一种在线二维串联色谱技术同时分离四种玫瑰红景天黄酮的方法
【专利摘要】一种在线二维色谱(串联液相色谱和高速逆流色谱)分离纯化四种玫瑰红景天黄酮的方法，通过离子液体水溶液作提取剂对玫瑰红景天黄酮进行在线超声提取和液固吸附色谱富集，对富集后的玫瑰红景天黄酮进行在线洗脱，然后直接对被洗脱的玫瑰红景天黄酮进行在线高速逆流色谱分离得到纯度超过95％的四种黄酮单体。本方法将提取、柱色谱和高速逆流色谱串联，避免了繁琐的溶剂萃取和反复柱色谱过程，分离方法简单、分离效率和产品的纯度高。
【专利说明】一种在线二维串联色谱技术同时分离四种玫瑰红景天黄酮的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种二维色谱同时分离玫瑰红景天黄酮的方法，属于化工领域。
【背景技术】
[0002]玫瑰红景天中的黄酮具有抗氧化、抗疲劳、抗微波辐射、抑菌、抑制肿瘤、保肝、调节心肌收缩等作用，显示了其在医药和功能食品的应用前景，因此提取、分离玫瑰红景天黄酮化合物有重要意义。
[0003]传统的提取溶剂主要是有机溶剂，这些有机溶剂具有易挥发、易燃、有毒和污染环境的缺点。近来，室温离子液体被认为是一种可以取代传统挥发性有机溶剂的环境友好型溶剂，一些室温离子液体己开始应用于天然产物活性成分的提取。室温离子液体具有很小的蒸汽压、好的热稳定性、好的溶解和提取能力以及可设计的结构。迄今还没有用离子液体提取玫瑰红景天黄酮的报道。
[0004]玫瑰红景天黄酮的分离方法主要是溶剂萃取和萃取后的多步柱色谱技术-硅胶柱色谱、0DS柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱和制备高效液相色谱。传统的柱层析方法分离玫瑰红景天酮存在分离时间长、回收率低、溶剂消耗大的缺点。而高速逆流色谱(high-speed countercurrent chromatography, HSCCC)作为一种连续高效的液-液分配色谱分离技术，可以克服上述缺点，特别适合于天然活性成分的分离。
[0005]多维色谱法利用两根或多根性质不同的色谱柱对复杂样品中的待分析组分进行分离。样品先在第一维色谱柱中进行预分离，然后将经过预分离的全部或部分组分选择性地转入另一根或多根不同类型的色谱柱中进一步分离。多维高效液相色谱技术具有对样品进行预处理，分离富集的功能，可提高色谱系统的分离能力和选择性；能从复杂的多种组分中排除干扰物质，有选择性地针对感兴趣的组分进行分析此外，和维色谱相比，二维色谱技术在峰容量、选择性和分辨率方面有明显的优势。迄今，还没有二维色谱技术分离玫瑰红景天黄酮的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服现有分离技术的不足之处，将提取、柱色谱和高速逆流色谱串联，提供一种在线的二维串联色谱技术同时分离四种玫瑰红景天黄酮的方法。
[0007]按照本发明提供的技术方案，在线的二维串联色谱技术同时分离四种玫瑰红景天黄酮的方法，步骤为:
[0008](1)在线提取和富集:玫瑰红景天取粉碎后，加入0.5-3mol/L的离子液体水溶液在20-60°C，0.2-lkw功率，30-180min超声提取玫瑰红景天黄酮；同时，在0.5-3柱体积(BV)/h流速下，提取液在线流过固相萃取柱富集玫瑰红景天黄酮；
[0009](2)在线洗脱和洗脱后的分离:将步骤(1)的固相萃取柱依次用平衡后的溶剂系统乙酸乙酯-正丁醇-水的下相和上相进行洗脱，溶剂体积比在3: 2: 5-4: 1: 5，洗脱体积分别为0.5-1个柱体积和1-2.5个柱体积，洗脱流速为0.5-4BV/h，在线收集上相洗脱液；
[0010](3)在线分离:上相的洗脱液直接注入高速逆流色谱柱进行分离，分离参数为:分离温度为25°C，流动相流速为0.5-3ml/min，转速为700_900rpm，溶剂系统为乙酸乙酯-正丁醇-水(下相为流动相，上相为固定相)，溶剂体积比在3:2:5-4:1: 5，检测波长280nm，根据逆流色谱图在线采集分离成分。
[0011](4)后处理:取步骤(3)所得的分离成分，在40_60°C蒸馏浓缩干燥得到高纯度玫瑰红景天黄酮单体。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]附图1在线提取和二维串联色谱系统图
【具体实施方式】
[0013]实施例1
[0014](1)在线提取和富集:玫瑰红景天取粉碎后，加入1.5mol/L的1_乙基_3_甲基咪唑氯水溶液，在40°C，350W的超声功率下，在线超声提取60min ;在提取的同时，提取液在线流过装有聚酰胺填料的固相萃取柱，提取液流速为1BV(柱体积)/h ;提取结束后，依次用平衡过的溶剂系统乙酸乙酯-正丁醇-水的下相和上相进行洗脱，洗脱流速为lBV/h，洗脱体积分别为1个柱体积和2个柱体积，收集上相溶剂的洗脱液；上相的洗脱液直接注入高速逆流色谱柱进行分离，溶剂系统是乙酸乙酯-正丁醇-水，体积比为4: 1: 5，以上相为固定，下相为流动相。在分离过程中，流动相流速为1.5ml/min,转速为800rpm,检测波长280nm,根据逆流色谱图在线采集分离组分；将所得的分离组分，在50°C下浓缩干燥得到高纯度玫瑰红景天黄酮单体 I (herbacetin-3-O-β -D-glucopyranosyl-7-0- a -L-rhamnopyranoside), II(kaempferol-3-0-β -D-glucopyranosyl-7-0-a -1-rhamnopyranoside), III (Kaempferol3-0- β -D-glucopyranoside- (2 — 1) - β -D-xylopyranoside), IV (herbacetin-8-0- β-D-glucopyranoside)。它们的纯度分别为 98.5%，95.4%，98.1 %和 97.5%。
[0015]实施例2
[0016]在线提取和富集:玫瑰红景天取粉碎后，加入1.5mol/L的1_乙基_3_甲基咪唑溴水溶液，在25°C，400W的超声功率下，在线超声提取45min ;在提取的同时，提取液在线流过装有LX-8填料的固相萃取柱，提取液流速为1.5BV/h ;提取结束后，依次用平衡后溶剂系统乙酸乙酯-正丁醇-水的下相和上相进行洗脱，洗脱流速为2BV/h，洗脱体积分别为0.5个柱体积和1.5个柱体积，收集上相溶剂的洗脱液；上相的洗脱液直接注入高速逆流色谱柱进行分离，溶剂系统是乙酸乙酯-正丁醇-水，体积比为3: 2: 5，以上相为固定，下相为流动相。在分离过程中，流动相流速为1.0ml/min，转速为850rpm，检测波长280nm，根据逆流色谱图在线采集分离组分；将所得的分离组分，在45°C下浓缩干燥得到高纯度玫瑰红景天黄酮单体 I (herbacetin-3-O- β -D-glucopyranosy 1-7-0- a -L-rhamnopyranoside) ,11(kaempferol-3-0-β -D-glucopyranosyl-7-0-a -L-rhamnopyranoside), III(kaempferol3-0- β -D-glucopyranoside-(2 — 1) - β -D-xylopyranoside), IV(herbacetin-8-0- β _D_glucopyranoside)。它们的纯度分别为 97.5%，96.4%，97.8%和 98.1 %。
[0017]实施例3
[0018](1)在线提取和富集:玫瑰红景天取粉碎后，加入2mol/L的1_ 丁基_3_甲基咪唑氯水溶液，在30°C，450W的超声功率下，在线超声提取50min ;在提取的同时，提取液在线流过装有CT-8填料的固相萃取柱，提取液流速为1.5BV/h ;提取结束后，依次用平衡后的溶剂系统乙酸乙酯-正丁醇-水的下相和上相进行洗脱，洗脱流速为lBV/h，洗脱体积分别为1个柱体积和2.5个柱体积，收集上相溶剂的洗脱液；上相的洗脱液直接注入高速逆流色谱柱进行分离，溶剂系统是乙酸乙酯-正丁醇-水，体积比为3.5: 1.5: 5，以上相为固定，下相为流动相。在分离过程中，流动相流速为2.0ml/min，转速为750rpm，检测波长280nm，根据逆流色谱图在线采集分离组分；将所得的分离组分，在50°C下浓缩干燥得到高纯度玫瑰红景天黄酮单体 I (herbacetin-3-O-β -D-glucopyranosyl-7-0- a -L-rhamnopyranoside), II(kaempferol-3-0-β -D-glucopyranosyl-7-0-a -L-rhamnopyranoside), III (kaempferol3-0- β -D-glucopyranoside- (2 — 1) - β -D-xylopyranoside), IV (herbacetin-8-0- β-D-glucopyranoside)。它们的纯度分别为 98.2%，95.8%，98.5%和 97.9%。
【权利要求】
1.一种在线二维色谱技术分离玫瑰红景天四种黄酮化合物的方法，其特征是，包括以下工艺步骤: (1)在线提取和富集:玫瑰红景天取粉碎后，加入0.5-3mol/L的离子液体水溶液在20-60°C,0.2-lkw功率，30-180min超声提取玫瑰红景天黄酮；同时，在0.5_3柱体积(BV)/h流速下，提取液在线流过固相萃取柱富集玫瑰红景天黄酮； (2)在线洗脱和洗脱后的分离:将步骤(I)的固相萃取柱依次用平衡后的高速逆流色谱的溶剂系统-乙酸乙酯-正丁醇-水的下相和上相进行洗脱，溶剂体积比在3:2:5-4:1: 5，洗脱体积分别为0.5-1个柱体积和1-2.5个柱体积，洗脱流速为0.5-4BV/h，在线收集上相洗脱液； (3)在线分离:上相的洗脱液直接注入高速逆流色谱柱进行分离，分离参数为流动相流速为0.5-3ml/min，转速为700_900rpm，溶剂系统为乙酸乙酯-正丁醇-水(下相为流动相，上相为固定相)，溶剂体积比在3:2:5-4:1: 5，检测波长280nm，根据逆流色谱图在线米集分尚成分。 (4)后处理:取步骤(3)所得的分离成分，在40?60°C蒸馏浓缩干燥得到高纯度玫瑰红景天黄酮单体。
2.如权利要求1所述一种在线二维色谱技术分离玫瑰红景天四种黄酮化合物的方法，其特征在于所述的离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑氯、1-乙基-3-甲基咪唑溴、1-丁基-3-甲基咪唑氯和1- 丁基-3-甲基咪唑溴。
3.如权利要求1所述一种在线二维色谱技术分离玫瑰红景天四种黄酮化合物的方法，其特征在于所述固相萃取柱的填料为聚酰胺、LX-8和CT-8。
4.如权利要求1所述一种在线二维色谱技术分离玫瑰红景天四种黄酮化合物的方法，其特征在于所用的二维色谱是串联液固吸附色谱和高速逆流色谱。
【文档编号】C07H1/08GK104277085SQ201310289315
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月11日 优先权日:2013年7月11日
【发明者】王洪新, 马朝阳, 樊琛 申请人:江南大学