专利名称：一种裂褶菌抗病毒蛋白及其制备方法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于植物病害防治领域，具体地说涉及一种裂褶菌抗病毒蛋白，以及该蛋白的制备方法和和用途。
背景技术：
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，简称为:TMV)能侵染爺科、葫芦科、十字花科等300多种植物,是危害广泛的植物病毒之一。目前，对于植物病毒病尚未有有效的防治方法。食用菌中的活性物质在提高免疫力、抗菌、抗癌方面有一定的作用。目前，对于食用菌中的活性物质的应用多集中在医学领域，而用于植物病毒防治方面则较少。裂裙菌(Schizophyllum commune Fr.)又称白参、树花，属于裂裙菌科(Schizophyllaceae),裂裙菌属(Schizophyllum)。裂裙菌广布于世界各地，我国大部分地区也都有分布。裂褶菌中含有多种抗菌消炎、抗肿瘤，抗辐射等活性物质。目前，对裂褶菌多糖研究较多，如专利申请《具有抗癌效果的蘑菇多糖体组合物及其制备方法》(公开号:CN101766644A)公开了包括裂褶菌多糖在内的几种蘑菇多糖组合物在提高免疫活性和促进细胞因子方面的作用；《免疫刺激剂》(公开号:CN1798563A)公开了裂褶菌多糖在内的多糖复合体作为免疫刺激剂的用途；《裂褶菌多糖在防治烟草花叶病毒病上的应用》(专利号:ZL2011101609475)公开了裂褶菌多糖提取物在防治烟草花叶病毒病上的用途。有关裂褶菌蛋白方面，专利《裂褶菌蛋白提取物及其制备方法和应用》(专利号:ZL200810247561)公开了裂褶菌蛋白提取物在抗烟草花叶病毒病上的用途。李洋等(李洋等.中国农学通报.2012年第24期250-255页)公开了裂 褶菌蛋白粗提液对烟草花叶病毒的钝化作用，但上述研究并未明确具体是哪种蛋白质在发挥作用。因此，有必要对其进行进一步研究，以便更好地加以应用。
发明内容
本发明目的在于提供一种裂褶菌抗病毒蛋白。本发明另一目的在于提供上述裂褶菌抗病毒蛋白的制备方法。本发明第三目的在于提供上述裂褶菌抗病毒蛋白在防治烟草花叶病毒病上的应用。实现本发明的技术方案如下:本发明一种裂裙菌抗病毒蛋白(其英文名称为:Schizophyllum communeantiviral protein,简称为:ScAP),其中所述的裂裙菌抗病毒蛋白来自于裂裙菌,其分子量为 28.5kDa。上述裂褶菌抗病毒蛋白中所述的病毒是指烟草花叶病毒等。 上述裂褶菌抗病毒蛋白，按照如下方法制备:(I)、按照裂褶菌菌丝粉与磷酸缓冲液之间重量体积比为Ig:10 20mL的比例，将裂褶菌菌丝粉与25mM、pH8.0的磷酸缓冲液混合，然后在4°C浸提I 3h ;再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min,收集上清液,得裂裙菌粗提液；(2)、向步骤(I)所得的裂褶菌粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，然后在4°C放置8 10h，再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min，收集上清液；(3)、向步骤(2)所得的上清液中加入硫酸铵至饱和度为85%，然后在4°C放置8 IOh,再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min,收集沉淀；(4)、将步骤(3)所得的沉淀用25mM、pH8.0磷酸缓冲液溶解，然后装入截留分子量为7000Da的透析袋，在超纯水中透析10-12h，每3小时更换I次超纯水；再将透析袋中的液体在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心30min,收集上清液；(5)、将步骤(4)所得的上清液进行离子交换层析，所用层析柱为HiTrap ANX FF(high sub),用洗脱液A进行洗脱,流速为lmL/min,收集280nm下吸收峰溶液；将所得吸收峰溶液进行超滤浓缩，得浓缩溶液；所述的洗脱液A为20mM Tris+0.1MNaCL, pH8.0 ；(6)、将步骤(5)超滤浓缩后所得的浓缩溶液进行凝胶层析，用洗脱液B进行洗脱，流速为0.4mL/min，检测280nm下紫外吸收值，收集第3个吸收峰，所得即为裂褶菌抗病毒蛋白的溶液；其中所述的洗脱液B为50mM磷酸盐缓冲液+0.15M NaCL ；pH7.2。上述裂褶菌抗病毒蛋白步骤(I)中所述的裂褶菌菌丝粉的粒径< 60目。上述裂褶菌抗病毒蛋白步骤(5)中所述的离子交换层析在AKTA Explore上于4°C层析柜中进行。上述裂裙菌抗病毒蛋白步骤(5)中所述的超滤浓缩是用Amicon Ultra_1550KD超滤离心管(Millipore公司生产)在4°C、4000rpm条件下超滤3-4次，15min/次。
上述裂裙菌抗病毒蛋白步骤(6)中所述的凝胶层析在在AKTA Explore上于4°C层析柜中进行；使用Superdex20010/300GL层析柱。上述裂褶菌抗病毒蛋白的制备方法，包括如下步骤:(I)、按照裂褶菌菌丝粉与磷酸缓冲液之间重量体积比为Ig:10 20mL的比例，将裂褶菌菌丝粉与25mM、pH8.0的磷酸缓冲液混合，然后在4°C浸提I 3h ;再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min,收集上清液,得裂裙菌粗提液；(2)、向步骤(I)所得的裂褶菌粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，然后在4°C放置8 10h，再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min，收集上清液；(3)、向步骤(2)所得的上清液中加入硫酸铵至饱和度为85%，然后在4°C放置8 IOh,再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min,收集沉淀；(4)、将步骤(3)所得的沉淀用25mM、pH8.0磷酸缓冲液溶解，然后装入截留分子量为7000Da的透析袋，在超纯水中透析10-12h，每3小时更换I次超纯水；再将透析袋中的液体在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心30min,收集上清液；(5)、将步骤(4)所得的上清液进行离子交换层析，所用层析柱为HiTrap ANX FF(high sub),用洗脱液A进行洗脱,流速为lmL/min,收集280nm下吸收峰溶液；将所得吸收峰溶液进行超滤浓缩，得浓缩溶液；所述的洗脱液A为20mM Tris+0.1MNaCL, pH8.0 ；(6)、将步骤(5)超滤浓缩后所得的浓缩溶液进行凝胶层析，用洗脱液B进行洗脱，流速为0.4mL/min，检测280nm下紫外吸收值，收集第3个吸收峰，所得即为裂褶菌抗病毒蛋白的溶液；其中所述的洗脱液B为50mM磷酸盐缓冲液+0.15M NaCL ；pH7.2。
上述制备方法步骤(5)中所述的离子交换层析在AKTA Explore上于4°C层析柜中进行。上述制备方法步骤(5)中所述的超滤浓缩是用Amicon Ultra_1550KD超滤离心管(Millipore公司生产)在4°C、4000rpm条件下超滤3-4次，15min/次。上述制备方法步骤(6)中所述的凝胶层析在在AKTA Explore上于4°C层析柜中进行；使用 Superdex20010/300GL 层析柱。上述裂褶菌抗病毒蛋白(或称ScAP)在防治烟草花叶病毒病上的应用。本发明褶菌抗病毒蛋白的使用方法为将上述裂褶菌抗病毒蛋白的溶液稀释成浓度为40ug/ml，喷施于3 5叶期的烟草、辣椒叶片上。本发明具有的优点:(1)本发明裂褶菌抗病毒蛋白对烟草花叶病毒的防治效果好，在喷施烟草72小时后，接种烟草花叶病毒，对烟草花叶病毒的抑制率可达到65%以上；
(2)本发明裂褶菌抗病毒蛋白为单一蛋白，为以后的测序和基因工程应用奠定了基础。(3)本发明裂褶菌抗病毒蛋白属于天然提取物，对人类和环境无害，可用于进一步开发生物农药。
图1;为裂褶菌抗病毒蛋白的电泳鉴定图谱；其中I为裂褶菌抗病毒蛋白，2为分子量标准。图2.为用凝胶层析鉴定牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白和为胰蛋白分子量的曲线图。图3.为用凝胶层析鉴定裂褶菌抗病毒蛋白分子量的曲线图。
具体实施例方式实施例1、本发明裂褶菌抗病毒蛋白的制备(I)将裂褶菌菌丝粉30g与磷酸缓冲液(25mM，pH8.0)450mL混合，在4°C浸提lh，再在4°C、8000rpm离心30min,收集上清液,得到裂裙菌粗提液。(2 ) 向步骤(I)所得的裂褶菌粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，在4°C放置8h，然后4°C、8000rpm离心30min,收集上清液。(3)向步骤(2)所得的上清液中加入硫酸铵至饱和度为85%，然后在4°C放置8h，再在4°C、8000rpm离心30min,收集沉淀。(4)将步骤(3)所得的沉淀用磷酸缓冲液(25mM，pH8.0)溶解，然后装入截留分子量为7000Da的透析袋，在超纯水中透析10h，每3h更换I次超纯水；再将透析袋中的液体于4°C、8000rpm离心30min,收集上清液。(5)将步骤(4)所得的上清液进行离子交换层析，在AKTA Explore上于4°C下进行；使用HiTrap ANX FF (high sub)层析柱进行分离，用洗脱液A (20mM Tris+0.1MNaCL,pH8.0)进行洗脱，收集280nm下的吸收峰，吸收峰溶液用AmiconUltra_153KD超滤管(Millipore公司生产)在4°C、4000rpm条件下进行超滤浓缩4次，15min/次,得浓缩溶液。(6)将步骤(5)超滤后所得的浓缩溶液进行凝胶层析，在AKTA Explore上于4°C层析柜中进行；使用Superdex20010/300GL层析柱，用洗脱液B (50mM磷酸盐缓冲液+0.15MNaCL ；pH7.2)进行洗脱，在280nm检测其紫外吸收值，收集第3个吸收峰，即为裂褶菌抗病毒蛋白的溶液。实施例2、本发明裂褶菌抗病毒蛋白的制备(I)、将裂褶菌菌丝粉30g与磷酸缓冲液(25mM，pH8.0) 300mL混合，然后在4°C浸提2h，再于4°C、9000rpm离心25min，收集上清液，得到裂褶菌粗提液。(2)、向步骤(I)所得的裂褶菌粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，然后在4°C放置9h，再于4°C、9000rpm离心25min，收集上清液。(3)、向步骤(2)所得的上清液中加入硫酸铵至饱和度为85%，然后在4°C放置9h，再于4°C、9000rpm离心25min,收集沉淀。(4)、将步骤(3)所得的沉淀用磷酸缓冲液(25mM，pH8.0)充分溶解，然后装入截留分子量为7000Da的透析袋，在超纯水中透析llh，每3h更换I次超纯水，再于4°C、9000rpm离心30min,收集上清液。(5)、将步骤(4)所得的上清液进行离子交换层析，在AKTA Explore上于4°C下进行；使用HiTrap ANX FF (high sub)层析柱进行分离，用洗脱液A (20mM Tris+0.1MNaCL,pH8.0)进行洗脱，收集280nm下吸收峰，所得吸收峰溶液用Millipore公司的AmiconUltra-153KD 超滤管浓缩(4°C、4000rpm 下超滤 4 次，15min/ 次)。(6)、将步骤(5)超滤浓缩得到的浓缩溶液进行凝胶层析，在AKTA Explore上于4°C层析柜中进行；使用Superdex20010/300GL层析柱，用洗脱液B (50mM磷酸盐缓冲液+0.15M NaCL ；pH7.2)进行洗脱，在280nm检测其紫外吸收值，收集第3个吸收峰，即为裂褶菌抗病毒蛋白的溶液。实施例3、本发明裂褶菌抗病毒蛋白的制备
(I)、将裂褶菌菌丝粉30g与磷酸缓冲液(25mM，pH8.0) 600mL混合，然后在4°C浸提3h,再于4°C、IOOOOrpm离心20min,收集上清液,得到裂裙菌粗提液；(2)、向步骤(I)所得的裂褶菌粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，然后在4°C放置10h，再于4°C、IOOOOrpm离心20min，收集上清液；(3)、向步骤(2)所得的上清液中加入硫酸铵至饱和度为85%，然后在4°C放置10h，再于4°C、IOOOOrpm离心20min,收集沉淀。(4)、将步骤(3)所得的沉淀用磷酸缓冲液(25mM，pH8.0)充分溶解后，装入截留分子量为7000Da的透析袋，在超纯水中透析12h，每3h更换I次超纯水，然后于4°C、IOOOOrpm离心30min,收集上清液。(5)、将步骤(4)所得的上清液进行离子交换层析，在AKTA Explore上于4°C下进行；使用HiTrap ANX FF (high sub)层析柱进行分离，用洗脱液A (20mM Tris+0.1MNaCL,pH8.0)进行洗脱，收集280nm下吸收峰溶液，吸收峰溶液用Millipore公司的AmiconUltra-153KD 超滤管浓缩(4°C、4000rpm 下超滤 4 次，15min/ 次)。(6)、将步骤(5)超滤浓缩得到的浓缩溶液进行凝胶层析，在AKTA Explore上于4°C层析柜中进行；使用Superdex20010/300GL层析柱，用洗脱液B (50mM磷酸盐缓冲液+0.15M NaCL ；pH7.2)进行洗脱，在280nm检测其紫外吸收值，收集第3个吸收峰，即为裂褶菌抗病毒蛋白的溶液。实施例4、本发明裂褶菌抗病毒蛋白(ScAP)的电泳鉴定按照如下方法操作:
(I )、SDS-PAGE凝胶配制:分离胶浓度12% (5mL凝胶中含去离子水1.6mL，30%Acrylamide2.0mL,1.5M pH8.8Tris-HCll.3mL,10%SDS50u L,10% 过硫酸铵 50 y L,TEMED2 u L),浓缩胶浓度 5% (3mL 凝胶中含去离子水 2.1mL, 30%Acrylamide0.5mL, 1.5MpH8.8Tris-HC10.38mL, 10%SDS30 u L, 10% 过硫酸铵 30 u L, TEMED3 u L);制胶；等待胶凝固。(2)、电泳:将实施例1制备的裂褶菌抗病毒蛋白加入SDS-PAGE上样缓冲液，在沸水浴中加热5min，在冰块中，待样品冷却后用微量进样器每孔进样20 u L。浓缩胶80V/cm，分离胶llOV/cm，待指示剂距离凝胶底端Icm时停止电泳。(3)、银染法:固定(30min)-致敏(30min)-水洗(3次，每次IOmin)-银染(20min)-水洗(2次，每次Imin)-显色-终止(IOmin)-保存(1%冰醋酸中，4°C保存)(4)、电泳图结果(见图1)显示只有一条蛋白条带，无其他条带，说明实施例1中所得的裂褶菌抗病毒蛋白为单一的蛋白质。实施例5、裂褶菌抗病毒蛋白的分子量测定在AKTA Explore上于4°C层析柜中进行，所用试剂均经过滤和脱气处理。使用Superdex20010/300GL层析柱，缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液和0.15MNaCL;pH7.2)充分平衡至280nm紫外吸光值不再变化，流速为0.5ml/min，上样量为IOOuL,标准蛋白浓度为2 3mg/mlo裂褶菌抗病毒蛋白经浓缩过滤后上样，缓冲液(0.05M磷酸盐缓冲液+0.15M Nacl,Ph7.2)，280nm检测其紫外吸光值。标准蛋白分别采用牛血清白蛋白(66.2kDa)、鸡卵清蛋白(44.28kDa)和胰蛋白酶(25.0kDa),以相同条件洗脱。分别记录本发明裂褶菌抗病毒蛋白(或称ScAP)及标准蛋白的洗脱体积，计算裂褶菌抗病毒蛋白(或称ScAP)的分子量。结果(见图2)显示胰蛋白酶(25.0kDa)、鸡卵清蛋白(44.28kDa)和牛血清白蛋白(66.2kDa)的洗脱体积分别为20.259mL、15.298mL、14.690mL ;裂褶菌抗病毒蛋白(或称ScAP)(见图3)的洗脱体积为19.02mL。根据标准蛋白的洗脱体积和分子量对数值绘制标准曲线，得到回归方程，通 过裂褶菌抗病毒蛋白的洗脱体积计算出裂褶菌抗病毒蛋白(或称ScAP)的分子量为28.5kDa。实施例6、本发明裂褶菌抗病毒蛋白的质谱鉴定经实施例4中SDS-PAGE电泳后切胶回收的裂褶菌抗病毒蛋白(或称ScAP)送往北京华大蛋白质研究中心进行LC/MS/MS分析，结果获得的酶解片段的一级(MS)和二级(MS/MS)质谱数据经MASCOT分析软件处理后，通过网上蛋白质数据库进行蛋白质搜索鉴定。结果显示:得到的27个肽段中，所匹配上的肽段数量为23个。数据检索时，ScAP与裂褶菌预测蛋白磷酸丙糖异构酶匹配率很高。实施例7、裂褶菌抗病毒蛋白诱导烟草抗烟草花叶病毒活性试验1、蛋白浓度的测定用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)检测实施例1、2、3制备的裂褶菌抗病毒蛋白的浓度。2、抗病毒效果试验(I)喷雾防治处理:分别将实施例1、2、3制备的ScAP配制成蛋白浓度为40 ii g/ml的溶液，分别对三至四叶期的枯斑三生烟进行整株喷雾，同时用清水喷施于三至四叶期的枯斑三生烟作为对照(CK)，设置三个重复，每个重复3株，每株3片叶子。(2)病毒接种液的制备:病毒来源为北京市农林科学院植物与环境保护研究所植病综防研究室保存的TMV普通株系(以普通烟为繁殖寄主，活体保存)，将感染烟草花叶病毒TMV普通株系的普通烟的叶片去除主脉，与pH8.0的0.01mol/L磷酸缓冲液按lg/20ml混合，每20ml磷酸缓冲液加0.015g金刚砂，将叶片充分研磨，得到接种液。(3)接种:按步骤(I)的方法喷雾处理枯斑三生烟植株72小时后，用步骤(2)得到的接种液进行汁液摩擦接种(植病研究方法(第三版)，方中达，中国农业出版社)接种后立即用清水冲洗，于防虫温室中培养，培养条件为28°C光照12小时，18°C无光照12小时，交替进行。(4)枯斑抑制率计算:接种72小时后调查枯斑三生烟叶片产生枯斑数量，按下式计算出枯斑抑制率。X= (CK-Y)/CKX 100 (式 I)式I中，X为枯斑抑制率，单位:％ ；CK为清水对照叶片的平均枯斑数，单位:个；Y为经ScAP诱导处理后叶片的平均枯斑数，单位:个。结果(见表I)用实施例1、2、3所得的裂褶菌抗病毒蛋白处理过的烟草对烟草花叶病毒的抑制率在65%以上，说明裂褶菌抗病毒蛋白能够诱导烟草对烟草花叶病毒产生抗性。表1.本发明裂褶菌抗病毒蛋白诱导烟草抗烟草花叶病毒活性试验结果
权利要求
1.一种裂褶菌抗病毒蛋白，其特征在于所述的裂褶菌抗病毒蛋白来自于裂褶菌，其分子量为28.5kDa ;其中所述的病毒是指烟草花叶病毒。
2.权利要求1所述的裂褶菌抗病毒蛋白，其特征在于按照如下方法制备: (1)、按照裂褶菌菌丝粉与磷酸缓冲液之间重量体积比为Ig:10 20mL的比例，将裂褶菌菌丝粉与25mM、pH8.0的磷酸缓冲液混合，然后在4°C浸提I 3h ;再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min,收集上清液,得裂裙菌粗提液； (2)、向步骤(I)所得的裂褶菌粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，然后在4°C放置8 IOh,再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min,收集上清液； (3)、向步骤(2)所得的上清液中加入硫酸铵至饱和度为85%，然后在4°C放置8 10h，再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min,收集沉淀； (4)、将步骤(3)所得的沉淀用25mM、pH8.0磷酸缓冲液溶解，然后装入截留分子量为7000Da的透析袋，在超纯水中透析10-12h，每3小时更换I次超纯水；再将透析袋中的液体在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心30min,收集上清液； (5)、将步骤(4)所得的上清液进行离子交换层析，所用层析柱为HiTrapANX FF (highsub)，用洗脱液A进行洗脱，流速为lmL/min，收集280nm下吸收峰溶液；将所得吸收峰溶液进行超滤浓缩，得浓缩溶液；所述的洗脱液A为20mM Tris+0.1MNaCL, pH8.0 ； (6)、将步骤(5)超滤浓缩后所得的浓缩溶液进行凝胶层析，用洗脱液B进行洗脱，流速为0.4mL/min,检测280nm下紫外吸收值，收集第3个吸收峰，所得即为裂褶菌抗病毒蛋白的溶液；其中所述的洗 脱液B为50mM磷酸盐缓冲液+0.15M NaCL ；pH7.2。
3.按照权 利要求2所述的裂褶菌抗病毒蛋白，其特征在于其步骤(I)中所述的裂褶菌菌丝粉的粒径< 60目 。
4.按照权利要求2所述的裂褶菌抗病毒蛋白，其特征在于其步骤(5)中所述的离子交换层析在AKTA Explore上于4°C层析柜中进行。
5.按照权利要求2所述的裂褶菌抗病毒蛋白，其特征在于其步骤(5)中所述的超滤浓缩是用Amicon Ultra-1550KD超滤离心管在4°C >4000rpm条件下超滤3-4次，15min/次。
6.按照权利要求2所述的裂褶菌抗病毒蛋白，其特征在于其步骤(6)中所述的凝胶层析在在AKTA Explore上于4°C层析柜中进行；使用Superdex20010/300GL层析柱。
7.权利要求2所述的裂褶菌抗病毒蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)、按照裂褶菌菌丝粉与磷酸缓冲液之间重量体积比为Ig:10 20mL的比例，将裂褶菌菌丝粉与25mM、pH8.0的磷酸缓冲液混合，然后在4°C浸提I 3h ;再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min,收集上清液,得裂裙菌粗提液； (2)、向步骤(I)所得的裂褶菌粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，然后在4°C放置8 IOh,再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min,收集上清液； (3)、向步骤(2)所得的上清液中加入硫酸铵至饱和度为85%，然后在4°C放置8 10h，再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min,收集沉淀； (4)、将步骤(3)所得的沉淀用25mM、pH8.0磷酸缓冲液溶解，然后装入截留分子量为7000Da的透析袋，在超纯水中透析10-12h，每3小时更换I次超纯水；再将透析袋中的液体在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心30min,收集上清液； (5)、将步骤(4)所得的上清液进行离子交换层析，所用层析柱为HiTrapANX FF (highsub)，用洗脱液A进行洗脱，流速为lmL/min，收集280nm下吸收峰溶液；将所得吸收峰溶液进行超滤浓缩，得浓缩溶液；所述的洗脱液A为20mM Tris+0.1MNaCL, pH8.0 ； (6)、将步骤(5)超滤浓缩后所得的浓缩溶液进行凝胶层析，用洗脱液B进行洗脱，流速为0.4mL/min,检测280nm下紫外吸收值，收集第3个吸收峰，所得即为裂褶菌抗病毒蛋白的溶液；其中所述的洗脱液B为50mM磷酸盐缓冲液+0.15M NaCL ；pH7.2。
8.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于其步骤(5)中所述的离子交换层析在AKTA Explore上于4°C层析柜中进行；所述的超滤浓缩是用Amicon Ultra_1550KD超滤离心管在4°C、4000rpm条件下超滤3-4次，15min/次。
9.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于其步骤(6)中所述的凝胶层析在在AKTA Explore上于4°C层析柜中进行；使用Superdex20010/300GL层析柱。
10.权利要求1 6任一 所述的裂褶菌抗病毒蛋白在防治烟草花叶病毒病上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种裂褶菌抗病毒蛋白，属于植物病害防治领域。本发明主要是将裂褶菌菌丝粉在磷酸缓冲液中浸提，离心后获得粗提液；然后加入硫酸铵进行沉淀，再经透析、离子交换层析、超滤浓缩和凝胶层析，获得单一的裂褶菌抗病毒蛋白，其分子量约为28.5kDa。本发明还公开了裂褶菌抗病毒蛋白的制备方法，以及在在防治烟草花叶病毒病上的应用。本发明裂褶菌抗病毒蛋白对烟草花叶病毒的防治效果好，在喷施烟草72小时后，对烟草花叶病毒的抑制率可达到65%以上；其次，本发明裂褶菌抗病毒蛋白为单一蛋白，为以后的测序和基因工程应用奠定了基础；本发明裂褶菌抗病毒蛋白为天然提取物，对人类和环境无害，可用于开发生物农药。
文档编号C07K1/30GK103224549SQ201310204598
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月28日 优先权日2013年5月28日
发明者周莹, 李洋, 严红 申请人:北京市农林科学院