稳定的α螺旋肽及其用途
【专利摘要】在此描述了新的多肽及其制备方法和用途。该多肽包括交联的(“烃环钩”)部分以在两个氨基酸部分之间提供限制该多肽二级结构的栓链。在此描述的多肽可用于治疗以过度的或不适当的细胞死亡为特征的疾病。
【专利说明】稳定的α螺旋肽及其用途
[0001]本申请是申请日为2004年11月05日和发明名称为“稳定的α螺旋肽及其用途”的200480039945.9号发明专利申请的分案申请。
[0002]优先权的请求
[0003]本申请在35USC§ 119(e)下要求于2003年11月5日提交的U.S.专利申请系列号60/517，848和于2004年7月27日提交的U.S.专利申请系列号60/591，548的优先权，其每个申请的全部内容在此并入作为参考。
[0004]背景
[0005]细胞凋亡或程序性细胞死亡在所有的多细胞生物体的内环境稳定的发展和保持中发挥重要的作用。对细胞凋亡的敏感性在细胞当中是显著不同的，并且受外部和内部细胞事件的影响。已经定义了介导细胞命运的正反调节蛋白质，并且已经在广谱的人类疾病，包括各种癌症的发病中证明了这些蛋白质信号网络的失调。BCL-2是这个细胞凋亡蛋白质家族的基本成员，并且首先在t(14 ；18) (q32 ；q21)淋巴瘤的染色体断裂点被鉴定出来(Bakhashi et al.1985Cell41:899 ；Cleary et al.1985Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA82:7439)。
[0006]基因重排将BCL-2置于免疫球蛋白重链基因座的转录调控下，产生BCL-2的不适当高水平且导致病理性细胞存活。已经在淋巴细胞和粒细胞性白血病和许多其他的恶性肿瘤的细胞凋亡中鉴定出这种失常，并且它已经与肿瘤进展和对化疗-诱导的细胞凋亡的获得性耐受力有关。BCL-2家族的蛋白质已有相当多的阐述，并且包括提供控制细胞死亡敏感性的制约与平衡的促-和抗-细胞凋亡分子(图1)。不会令人惊讶地，细胞凋亡蛋白质已经成为开发防止细胞损失疾病中突然的细胞死亡并且活化恶性肿瘤中细胞死亡通路的治疗剂的关键靶物。
[0007]BCL-2家族被定义为存在多达四个命名为BH1、BH2、BH3、和BH4的保守的“BCL-2同源，，(BH)结构域，其都包括 α -螺旋节段(Chittenden et al.1995EMB014:5589 ；ffang etal.1996Genes Dev.10:2859)。抗-细胞凋亡蛋白质，例如BCL-2和BCL-X^在所有的BH结构域显示序列保守性。促-细胞凋亡蛋白质被分为在BH1、BH2和BH3结构域中具有同源性的“多结构域”成员(例如BAK、BAX)，和包含专门在BH3两亲性的α -螺旋节段中的序列同源性的“只有ΒΗ3-结构域”成员(例如BID、BAD、BIM, BIK、NOXA, PUMA)。BCL-2家族成员具有形成同型和杂二聚物的能力，表明在促-和抗-细胞凋亡蛋白水平之间的竞争性结合和比例支配了对死亡刺激的敏感性。抗-细胞凋亡蛋白质能够保护细胞避免促-细胞凋亡过量，即过度的程序性细胞死亡。附加的“安全”测量包括调节促-细胞凋亡蛋白质的转录并保持他们为非活化的构象体，其需要蛋白水解的活化、去磷酸化、或配体-诱导的构象变化来活化促-死亡功能。在某些细胞类型中，在质膜收到的死亡信号通过线粒体途径触发细胞凋亡(图2)。线粒体可通过隔离细胞色素C，这一活化胱冬蛋白酶9而导致致命的下游蛋白水解事件的细胞溶质复合物的关键成分来作为细胞死亡的看门者发挥作用。多结构域蛋白质，例如BCL-2/BCL-X^和BAK/BAX在线粒体膜发挥保护者和执行者的作用，其活性进一步受到上游BH3-BCL-2家族的唯一成员的调节。例如，BID是促-细胞凋亡蛋白质的“只有BH3-结构域”子集中的成员，并且传输在质膜收到的死亡信号至在线粒体膜的效应物促-细胞凋亡蛋白质。BID具有与促-和抗-细胞凋亡蛋白质相互作用的独特能力，并且当受到胱冬蛋白酶8的活化时，触发细胞色素c释放和线粒体的细胞凋亡。缺失和诱变研究确定促细胞凋亡家族成员的两亲性α -螺旋ΒΗ3节段起死亡结构域的作用，并且因此表现出与多结构域细胞凋亡蛋白质相互作用的决定性结构基序。结构研究已经证明ΒΗ3螺旋通过插入由BHl、2和3结构域的接触面形成的疏水性沟槽而与抗-细胞凋亡蛋白质相互作用。活化的BID可被抗-细胞凋亡蛋白质结合和隔离(例如，BCL-2和BCL-XJ并且可触发促-细胞凋亡蛋白质BAX和BAK的活化，导致细胞色素c释放和线粒体的细胞凋亡程序。
[0008]BAD也是“只有ΒΗ3-结构域”(BH3_domain only)的促-细胞凋亡家族成员，其表达同样触发BAX/BAK的活化。然而与BID相反，BAD显示优先结合抗-细胞凋亡成员，BCL-2和BCL-Xp尽管BAD BH3结构域显示高亲合力结合BCL-2，BAD BH3肽不能体外活化细胞色素c从线粒体释放，表明BAD不是BAX/BAK的直接活化剂。过表达BCL-2的线粒体抗BID-诱导细胞色素c释放，但与BAD的共同治疗可恢复BID灵敏性。由BAD诱导的线粒体的细胞凋亡看来似乎是由于:(I) BAX/BAK活化剂，例如BID和BID-样的蛋白质从BCL-2/BCL-X^结合袋的置换(displacement)，或(2) BCL_2/BCL_Xl结合袋被BAD选择性占据而阻止BID-样蛋白质被抗-细胞凋亡蛋白质螯合分离。因此，已经出现两种类型的“只有BH3-结构域”的蛋白质，BID-样蛋白质直接活化线粒体的细胞凋亡，而BAD-样蛋白质具有敏化线粒体为被多结构域抗-细胞凋亡蛋白质的结合袋占据的BID-样促-细胞凋亡的能力。
[0009]已经对鉴定或产生小分子以体外探测细胞凋亡蛋白质功能并且在体内特异控制细胞凋亡途径的目的提出挑战。高流通量筛选已经鉴定了抑制BAK BH3结构域与BCL-X^微摩尔亲合力的相互作用的若干分子。除鉴定低亲合力化合物的潜在缺陷之外，该技术在产生适合蛋白质家族个别成员的精细结合特异性的化合物控制板的其能力方面受到限制。控制细胞凋亡途径的备选途径来源于 肽工程化，该技术使用非特异的肽序列来产生具有所需要三维结构的化合物。这种技术的一个应用涉及产生由用于通过破裂线粒体膜来诱导细胞死亡的非特异性肽序列组成的“促-细胞凋亡” α -螺旋。
[0010]α-螺旋是蛋白质的主要结构成份之一并且经常在蛋白质接触界面被发现，其参与多种分子间的生物学识别事件。理论上，螺旋肽，例如ΒΗ3螺旋，可用于有选择地干扰或稳定蛋白质-蛋白质相互作用，由此控制生理学过程。然而，当从全长蛋白质的范围内取出并被放入溶液中时，蛋白质内的生物学活化的螺旋基序一般具有很少的结构。因此，蛋白质肽片段已经由于二级结构螺旋的损失损害了其作为体内反应物的效力，其对蛋白水解的敏感性退化，并且不能透入完整细胞。尽管已经报道了共价螺旋稳定化的若干方法，大多数方法论涉及极化和/或不稳定的交联(Phelan et al.1997J.Am.Chem.Soc.119:455 ；Leuc et al.2003Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USAlOO:11273 ；Bracken et al., 1994J.Am.Chem.Soc.116:6432 ；Yan et al.2004Bioorg.Med.Chem.14:1403)。随后，Verdine 及其同事开发了备选的基于置换的方法，其使用包含烷基栓链(tethers)的α，α-二取代的非天然氨基酸(Schafmeister et al.，2000J.Am.Chem.Soc.122:5891 ；Blackwell et al.1994AngewChem.1nt.Ed.37:3281)。
[0011]概述
[0012]本发明部分地基于具有至少两个改变氨基酸(定义为“烃环钩”(hydro carbonstapling)方法)的稳定交联的多肽可帮助构象地赋予该多肽天然二级结构的发现。例如，使倾向于具有α-螺旋二级结构的多肽交联可约束该多肽至其天然的α-螺旋构象。被约束的二级结构可增加该多肽对蛋白水解切割的耐受性并且也增加疏水性。令人惊讶地，在有些情况下，该多肽可透过细胞膜(例如，通过能量-依赖的转运机制，例如胞饮作用)。因此,在此描述的交联多肽可相对于相应的未交联多肽具有改善的生物活性。例如该交联的多肽可包括BCL-2家族成员多肽的α -螺旋结构域(例如，BID-BH3结构域)，其可结合ΒΑΚ/ΒΑΧ和/或BCL-2/BCL-X^以在受试体中促进细胞凋亡。在有些情况下，该交联的多肽可用于抑制细胞凋亡。可治疗性地使用该在此所描述的交联多肽，例如，在受试体中用于治疗癌症。
[0013]在一个方面，本发明描述了通式⑴的多肽，
[0014]
【权利要求】
1.通式(I)的多肽，
2.权利要求1的多肽，其中该多肽结合BCL-2家族多肽。
3.权利要求1的多肽,其中该多肽结合抗-细胞凋亡多肽。
4.权利要求1的多肽，其中该多肽结合ΒΗ1、ΒΗ2或ΒΗ3结构域。
5.权利要求1的多肽,其中该多肽活化线粒体的细胞死亡。
6.权利要求1的多肽,其中该多肽活化细胞死亡。
7.权利要求1的多肽,其中该多肽抑制细胞死亡。
8.权利要求1的多肽，其中该多肽包括ΒΗ3结构域。
9.权利要求1的多肽，其中X是2、3、或6。
10.权利要求1的多肽,其中每个y独立地是3和15之间的整数。
11.权利要求1的多肽，其中R1和R2各自独立地是H或C1-C6烷基。
12.权利要求1的多肽，其中R1和R2各自独立地是C1-C3烷基。
13.权利要求11的多肽，其中R1和R2中的至少一个是甲基。
14.权利要求12的多肽，其中R1和R2是甲基。
15.权利要求1的多肽，其中R3是烷基。
16.权利要求14的多肽，其中X是3。
17.权利要求15的多肽，其中R3是C8烷基。
18.权利要求14的多肽，其中X是6。
19.权利要求17的多肽，其中R3是C11烷基。
20.权利要求1的多肽，其中R3是烯基。
21.权利要求18的多肽，其中X是3。
22.权利要求20的多肽，其中R3是C8烯基。
23.权利要求19的多肽，其中X是6。
24.权利要求19的多肽，其中R3是C11烯基。
25.权利要求1的多肽，其中R3是直链烷基、烯基、或炔基。
26.权利要求1的多肽，其中R3是[R4-K-R4];以及R4是直链烷基、烯基、或炔基。
27.权利要求1的多肽，该多肽包括与SEQID NO:1的氨基酸序列至少大约60%同一性的氨基酸序列。
28.权利要求15的多肽，其中R3是烷基或烯基。
29.权利要求15的多肽，其中R1或R2中的至少一个是烷基。
30.权利要求11的多肽，其中每个R1和R2独立地是H或C1-C3烷基。
31.权利要求1的多肽，其中R1和R2是甲基。
32.权利要求1的多肽，其中X是3或7以及ζ是O。
33.权利要求1的多肽，其中R3是C8或C11烷基或烯基。
34.权利要求1的多肽，该多肽包括与SEQID NO:2的氨基酸序列至少大约80%同一性的氨基酸序列。
35.权利要求1的多肽，其中该多肽转运通过细胞膜。
36.权利要求1的多肽，其中该多肽主动转运通过细胞膜。
37.权利要求1的多肽，进一步包括荧光部分或放射性同位素。
38.权利要求1的多肽，其中该多肽包括23个氨基酸； R1和R2是甲基； R3是C8烷基、C11烷基、C8烯基或C11烯基；以及 X是2、3或6。
39.权利要求1的多肽,进一步包括亲和标记。
40.权利要求1的多肽，进一步包括靶部分。
41.权利要求1的多肽，进一步包括生物素部分。
42.权利要求1的多肽，其中该多肽是选自图5所示多肽的多肽。
43.制备通式(III)的多肽的方法，包括 提供通式(II)的多肽；以及
44.权利要求43的方法，其中该多肽结合BCL-2家族成员多肽。
45.权利要求43的方法，其中该催化剂是钌催化剂。
46.权利要求43的方法，进一步包括在环闭合置换作用之后提供还原剂或氧化剂。
47.权利要求46的方法，其中该还原剂是H2或氧化剂是四氧化锇
48.治疗受试体的方法，包括将权利要求1的化合物施用于该受试体。
49.权利要求48的方法，进一步包括施用附加的治疗剂。
50.在受试体中治疗癌症的方法，包括将权利要求1的化合物施用于该受试体。
51.权利要求45的方法，进一步包括施用附加的治疗剂。
52.权利要求1，通式(I)的化合物的文库。
53.鉴定用于促进细胞凋亡的候选化合物的方法，包括； 提供线粒体； 使该线粒体与权利要求1的化合物接触； 测量细胞色素c释放；以及 与缺少权利要求1的化合物时的细胞色素c释放比较在存在权利要求1的化合物时的细胞色素c释放，其中在存在权利要求1的化合物时细胞色素c释放增加则鉴定该权利要求I的化合物为用于促进细胞凋亡的候选化合物。
54.通式(IV)的多肽，
55.通式(I)的多肽，
56.权利要求55的多肽，其中通过圆二色光谱测定该多肽具有至少35%的α螺旋度。
57.权利要求55的多肽，其屮通过圆二色光谱测定该多肽具有至少50%的α螺旋度。
58.权利要求55的多肽,其屮通过圆二色光谱测定该多肽具有至少60%的α螺旋度。
59.权利要求55的多肽,其中通过圆二色光谱测定该多肽具有至少70%的α螺旋度。
60.权利要求55的多肽,其中通过圆二色光谱测定该多肽具有至少80%的α螺旋度。
61.权利要求55的多肽,其中通过圆二色光谱测定该多肽具有至少90%的α螺旋度。
62.通式(I)的多肽，
63.权利要求62，通式(I)的多肽，其中通过圆二色光谱测定该多肽与通式(IV)的多肽相比具有至少1.5倍的α螺旋度增加。
64.权利要求62，通式(I)的多肽，其中通过圆二色光谱测定该多肽与通式(IV)的多肽相比具有至少1.75倍的α螺旋度增加。
65.权利要求62，通式(I)的多肽，其中通过圆二色光谱测定该多肽与通式(IV)的多肽相比具有至少2.0倍的α螺旋度增加。
66.权利要求62，通式(I)的多肽，其中通过圆二色光谱测定该多肽与通式(IV)的多肽相比具有至少2.5倍的α螺旋度增加。
67.权利要求62，通式(I)的多肽，其中通过圆二色光谱测定该多肽与通式(IV)的多肽相比具有至少3倍的α螺旋度增加。
68.权利要求62，通式(I)的多肽，其中通过圆二色光谱测定该多肽与通式(IV)的多肽相比具有至少4倍的α螺旋度增加。
69.鉴定用于抑制细胞凋亡的候选化合物的方法，包括； 提供线粒体； 使该线粒体与权利要求1的化合物接触； 测量细胞色素c释放；以及 与缺少权利要求1的化合物时的细胞色素c释放比较在存在权利要求1的化合物时的细胞色素c释放，其中在存在权利要求1的化合物时细胞色素c释放降低则鉴定该权利要求I的化合物为用于抑制细胞凋亡的候选化合物。
【文档编号】C07K14/00GK103467588SQ201310178526
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2004年11月5日 优先权日:2003年11月5日
【发明者】洛伦·D·沃伦斯基, 斯坦利·J·科斯迈耶, 格雷戈里·弗迪恩 申请人:达纳-法伯癌症研究所股份有限公司, 哈佛大学的校长及成员们