单体衣康酸的一种制备方法
【专利摘要】本发明公开了单体衣康酸的一种制备方法，其具体步骤如下：以土曲霉(Aspergillus?terreus)ZS01为出发菌株，微波诱变获得高产衣康酸菌株，采用气升式发酵罐发酵，过滤发酵液，经阴离子交换，真空浓缩，干燥，得到单体衣康酸，含量＝99.50％。本方法的衣康酸产酸达到100g/L以上，提高了衣康酸产率，减少了设备投资，节能效果明显，降低了生产成本，适用于大规模工业化生产。
【专利说明】单体衣康酸的一种制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，提供了一种单体衣康酸的制备方法。
【背景技术】
[0002]衣康酸(Itaconic acid)又名亚甲基丁二酸、亚甲基琥拍酸或分解乌头酸,是一种不饱和的二元有机酸。常温下为白色晶体，无毒，在酸性、中性和弱碱性常温条件下其性质稳定，但在强碱性条件下，其3种异构体可以相互转化，易溶于水、乙醇、丙酮，微溶于氯仿、苯和乙醚，有特殊的气味，在真空下能升华。
[0003]衣康酸及其酯类是制造合成树脂、合成纤维、塑料、橡胶、离子交换树脂、表面活性剂和高分子螯合剂等的良好添加剂和单体原料。它作为交联剂和乳化剂，含量在1%~5%时，生产的苯乙烯-丁二烯共聚物是质轻、易塑、绝缘、防水、抗蚀性能均好的塑料和涂料。用玻璃纤维填充则是一种高强度玻璃钢，可用于制造车，船和飞机的外壳及各种容器。含衣康酸的丙烯酸乳胶可以作为非织造纤维的粘合剂。含衣康酸单体的聚氯乙烯显示对纸张，赛璐玢和聚对苯二酸乙二醇薄膜的粘着性增强。聚丙烯腈纤维中含少量的衣康酸，就能大大改善其染色性能，使着色加深。加入多价金属氧化物(如锌和镁的硅铝酸盐或氧化物)交联的衣康酸-丙烯酸制成的牙科粘合剂具有良好的抗压性能和粘结强度，并有很好的生理适应性。衣康酸聚合物有特殊光泽，透明，适合于制造人造宝石和特种透镜，以及防水性能良好的抗化学剂和涂料等。衣康酸和丙烯酸的聚合物是一种高分子螯合物，用于作为水处理中的除垢剂，对防止碱性钙，镁垢的形成特别有效。加到海水蒸发脱盐体系中，有效成分为0.5~10mg/kg时就能有效的抑制水垢在蒸发器表面形成与附着。由衣康酸与芳香二胺生产的吡咯烷酮衍生物是润滑油的增稠剂，与其他各种胺生成的吡咯烷酮衍生物可用于洗涤剂、医药、除草剂之中。随着科学技术的发展和各个行业之间的交叉渗透，衣康酸的应用领域将会越来越多。
[0004]衣康酸自然界存在 较少，最早是由Baup等人于1836年在蒸馏分解柠檬酸时发现的。1929年，日本学者木下广野首次发现了可分泌衣康酸的微生物，并命名为衣康酸曲霉(Asp.1taconicus)。Raistrick在研究霉菌代谢产物时,发现土曲霉(Asp.terreus)也能分泌衣康酸，由此揭开了微生物发酵法生产衣康酸的研究历史。
[0005]衣康酸的生产方法主要有发酵法和化学合成法两种。化学合成法以原料的来源可以分为农产品和石油化工产品两种方法，农产品原料主要有柠檬酸、异柠檬酸、乌头酸及其酸酐等，石油化工产品原料主要有丁二酸酐、丁二酸二甲酯或丁二酸酯等。发酵法是目前工业上生产衣康酸的主要方法，国内外大多数生产厂家都采用这种方法来生产衣康酸。衣康酸的工业生产菌种主要是衣康酸曲霉(Asp.1taconicus)和土曲霉(Asp.terreus)。所用的原料主要有葡萄糖、蔗糖以及淀粉水解糖、糖蜜等。发酵工艺主要有表面发酵工艺、深层发酵工艺以及固定化细胞生产工艺等。衣康酸表面发酵工艺具有设备简单，投资少，上马快，操作技术简单，能耗低以及原料粗放等优点，不足之处是设备占地面积大，劳动强度高，增大产量有困难，目前此方法在衣康酸的生产中已经很少使用。深层发酵工艺是现行工业上最流行、最经济的衣康酸生产方法，整个工艺过程的连续性强，自动化程度高，产品成本低。近几年，固定化全细胞生产衣康酸的研究比较活跃，使用的载体多为聚丙烯酰胺凝胶，利用包埋法固定衣康酸生产菌的全细胞，目前存在的问题是固定化细胞制备技术不过关，产率太低以及生产速度慢等，还有待于进一步的研究开发。因此，发酵技术仍然是衣康酸生产的研究点。
[0006]采用发酵法生产单体衣康酸，菌种保存过程中由于经过多次传代，衣康酸的产量都有不同程度降低，同时许多学者试图通过提高衣康酸的产酸率来降低衣康酸生产成本，例如采用固定化技术，但由于衣康酸的发酵与供氧关系甚密，采用固定化技术后，无论是发酵产酸，还是转化率均难以与以游离细胞的方式进行的工业化生产水平相比。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是要寻找一种诱变方法使菌株具有较高产量，同时，采用新的生化反应器代替机械搅拌罐，以提高衣康酸产酸率。
[0008]本发明的整体技术构思是:以土曲霉为出发菌株，微波诱变获得高产衣康酸菌株，采用气升式发酵罐发酵，分离纯化单体衣康酸，其特征在于具体包括以下步骤:
[0009]I)微波诱变
[0010]土曲霉ZSOl出发菌株，斜面活化，将孢子用0.85%无菌氯化钠洗下，倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，35°C，摇床振荡活化lh，制备单孢子悬液。微波照射15s，将处理过的孢子悬液进行梯度稀释，涂布于平板。挑平板上透明圈大的单圈落，35°C，上摇瓶发酵72h，获得衣康酸高产菌株，产酸91.3g/L ；
[0011]2)种子培养
[0012]取一环经活化的高产菌种，接种于500ml三角瓶中，于35°C 200r/min往复摇床上培养2天；
[0013]3)气升式发酵罐发酵
[0014]以10%接种量转接至装有发酵培养基的气升式发酵罐中，通风量1.5vvm,35°C,发酵3天，产酸103.8g/L ；
[0015]4)纱布过滤
[0016]用洁净纱布过滤除去衣康酸发酵液中的菌丝体；
[0017]5)活性炭脱色
[0018]添加I~2 %的活性炭，吸附脱色Ih ；
[0019]6)过滤
[0020]将经脱色处理的发酵液泵入过滤器中，去除活性炭及其它不溶物；
[0021]7)离子交换树脂
[0022]用湿法将处理好的D311阴离子交换树脂装入玻璃交换柱，通入1.5mol/LNa0H溶液，流速为2Bv/h (Bv表示树脂床体积)，时间为2h左右，再用去离子水洗至pH8~9。通入衣康酸发酵液，上柱流速为4.0mL/min,最佳洗脱条件为以2mol/L的NaOH溶液为洗脱剂，洗脱流速为6.0mL/min，其回收率达86%以上；
[0023]8)浓缩
[0024]洗脱液于真空度为0.05Mpa的浓缩罐中浓缩；[0025]9)真空干燥
[0026]真空度低至0.08Mpa，升温至50°C干燥时间lh，得到单体衣康酸，含量=99.50%。
[0027]本发明提供的上述一种单体衣康酸的制备方法，其特点在于:
[0028]I)采用微波诱变获得高产菌株
[0029]微波在生物学上主要用于杀菌、刺激植物种子发芽生长。随着人们对微波的生物学效应及微生物特点认识的深入，微波在工业微生物诱变育种中也应用得越来越广泛，与紫外线、离子注入、抗癌药物、染料等方法处理菌种相比较，微波处理法具有操作简单、费用低、安全性高、对环境污染小、正变率较高等特点。本项目采用微波育种方法得到高产菌株，可有效提高衣康酸的产量。
[0030]2)采用气升式发酵罐发酵衣康酸
[0031]发酵采用气升式发酵罐，该设备最主要的特征是以静态搅拌装置代替了传统的动态搅拌装置，并结合了气升原理，因而对发酵工艺的改善具有下列特点:
[0032]a、与机械搅拌式发酵罐相比节电70% _80%，能耗成本降低。
[0033]b、本设备具有工作噪音小，装料系数高，基本不用维修等特点，设备投资比搅拌罐降低20%左右。
[0034]C、传热和传氧效率高，可满足好氧性微生物的发酵生产。研究适合衣康酸发酵的通风比,可提高衣康酸产酸18%。
[0035]3)采用阴离子交换树脂法提取衣康酸
[0036]对于含杂质较多的发酵液，采用浓缩结晶法易出现不合格产品，且造成衣康酸回收率无法提高，而用离子交换来完成的分离较单纯的结晶蒸发有更理想的效果。采用离子交换树脂进行衣康酸的分离提取，衣康酸的粗品回收率达到86%以上。
[0037]本发明接种高产衣康酸菌株于气升式发酵罐中进行发酵，产酸达到100g/L以上，衣康酸含量= 99.50%，提高了衣康酸产率，减少了设备投资，节能效果明显，降低了生产成本，更能适应市场需求(注:土曲霉(Aspergillus terreus)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期2012年10 月 15 日，保藏编号:CGMCCN0.6413)。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]附图1是以土曲霉为原料，微波诱变获得高产衣康酸菌株，种子培养，采用气升式发酵罐发酵，过滤发酵液，经阴离子交换，真空浓缩，干燥，得到单体衣康酸的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0039]提出以下实例来具体说明，以更好地理解本发明，但本发明的内容并不局限于此。
[0040]实施例1
[0041]土曲霉出发菌株，斜面活化，将孢子用0.85%无菌生理盐水洗下，倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，35°C，摇床振荡活化lh，制备单孢子悬液。微波照射15s，将处理过的孢子悬液进行梯度稀释，涂布于平板。挑平板上透明圈大的单圈落，350C，上摇瓶发酵72h，获得衣康酸高产菌株，产酸91.6g/L。
[0042]取一环经活化的高产菌种,接种于500ml三角瓶中，于35°C 200r/min往复摇床上、培养2天；以10%接种量转接至装有发酵培养基的气升式发酵罐中，通风量1.5VVm，35°C，发酵3天，产酸104.5g/L。
[0043]用洁净纱布过滤除去衣康酸发酵液中的菌丝体；添加I %的活性炭，吸附脱色Ih ；将经脱色处理的发酵液泵入过滤器中，去除活性炭及其它不溶物；用湿法将处理好的D311阴离子交换树脂装入玻璃交换柱，通入1.5mol/LNa0H溶液，流速为2Bv/h，时间为2h左右，再用去离子水洗至pH8~9。通入衣康酸发酵液,上柱流速为4.0mL/min,最佳洗脱条件为以2mol/L的NaOH溶液为洗脱剂，洗脱流速为6.0mL/min，其回收率为86.6% ;洗脱液于真空度为0.05Mpa的浓缩罐中浓缩；真空度低至0.08Mpa，升温至50°C干燥时间lh，得到单体衣康酸，含量99.68%。
[0044]实施例2
[0045]土曲霉出发菌株，斜面活化，将孢子用0.85%无菌生理盐水洗下，倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，35°C，摇床振荡活化lh，制备单孢子悬液。微波照射10s，将处理过的孢子悬液进行梯度稀释，涂布于平板。挑平板上透明圈大的单圈落，350C，上摇瓶发酵72h，获得衣康酸高产菌株，产酸92.2g/L。
[0046]取一环经活化的高产菌种,接种于500ml三角瓶中，于35? 250r/min往复摇床上培养2天；以10%接种量转接至装有发酵培养基的气升式发酵罐中，通风量1.0VVm，35°C，发酵3天，产酸105.lg/L。
[0047]用洁净纱布过滤除去衣康酸发酵液中的菌丝体；添加I %的活性炭，吸附脱色Ih ；将经脱色处理的发酵液泵入过滤器中，去除活性炭及其它不溶物；用湿法将处理好的D311阴离子交换树脂装入玻璃交换柱，通入1.5mol/LNaOH溶液，流速为2Bv/h，时间为2h左右，再用去离子水洗至pH8~9。通入衣康酸发酵液,上柱流速为4.5mL/min,最佳洗脱条件为以1.5mol/L的NaOH溶液为 洗脱剂，洗脱流速为6.0mL/min，其回收率为86.3% ;洗脱液于真空度为0.05Mpa的浓缩罐中浓缩；真空度低至0.08Mpa，升温至50°C干燥时间lh，得到单体衣康酸，含量99.75%。
[0048]实施例3
[0049]土曲霉出发菌株，斜面活化，将孢子用0.85%无菌生理盐水洗下，倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，35°C，摇床振荡活化lh，制备单孢子悬液。微波照射20s，将处理过的孢子悬液进行梯度稀释，涂布于平板。挑平板上透明圈大的单圈落，350C，上摇瓶发酵72h，获得衣康酸高产菌株，产酸91.5g/L。
[0050]取一环经活化的高产菌种,接种于500ml三角瓶中，于35? 200r/min往复摇床上培养2天；以12%接种量转接至装有发酵培养基的气升式发酵罐中，通风量1.5VVm，35°C，发酵3天，产酸105.8g/L。
[0051]用洁净纱布过滤除去衣康酸发酵液中的菌丝体；添加2%的活性炭，吸附脱色Ih ；将经脱色处理的发酵液泵入过滤器中，去除活性炭及其它不溶物；用湿法将处理好的D311阴离子交换树脂装入玻璃交换柱，通入1.5mol/LNaOH溶液，流速为2Bv/h，时间为2h左右，再用去离子水洗至pH8~9。通入衣康酸发酵液,上柱流速为4.5mL/min,最佳洗脱条件为以2mol/L的NaOH溶液为洗脱剂，洗脱流速为5.0mL/min，其回收率为86.9% ;洗脱液于真空度为0.05Mpa的浓缩罐中浓缩；真空度低至0.08Mpa,升温至50°C干燥时间lh，得到单体衣康酸，含量99.73%。
【权利要求】
1.一种以土曲霉(Aspergillus terreus)ZSOl为出发菌株,发酵制备单体衣康酸的方法，其特征在于: 1)微波诱变:土曲霉ZSOl为出发菌株，斜面活化，将孢子用无菌生理盐水洗下，倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，350C，摇床振荡活化，制备单孢子悬液。微波照射，将处理过的孢子悬液进行梯度稀释，涂布于平板。挑平板上透明圈大的单圈落，上摇瓶发酵，获得衣康酸高产菌株； 2)种子培养:取一环经活化的高产菌种，接种于500ml三角瓶中，于摇床上培养2天； 3)气升式发酵罐发酵:接种至装有发酵培养基的气升式发酵罐中发酵培养； 4)纱布过滤:用洁净纱布过滤除去衣康酸发酵液中的菌丝体； 5)活性炭脱色:添加I~2%的活性炭，吸附脱色Ih； 6)过滤:将经脱色处理的发酵液泵入过滤器中，去除活性炭及其它不溶物； 7)离子交换树脂:用湿法将处理好的阴离子交换树脂装入玻璃交换柱，通入1.5mol/LNaOH溶液，流速为2Bv/h (Bv表示树脂床体积)，时间为I~2h，再用去离子水洗至pH8~9，通入衣康酸发酵液， NaOH溶液洗脱； 8)浓缩:洗脱液于真空度为0.05Mpa的浓缩罐中浓缩； 9)真空干燥:真空度低至0.08Mpa,升温干燥,得到单体衣康酸,含量=99.60%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)所述的斜面培养基(g/L):玉米淀粉 7 ~10、(NH4) 2S043 ~6、MgSO4.7Η200.4、FeSO4.7Η200.4、ρΗ4.0 ~4.5、琼月旨 10 ~16 ;平板培养基(g/L):玉米淀粉 7 ~10、(NH4) 2S044 ~8、MgSO4.7Η200.4、LiCl0.05 ~0.2、溴甲酚绿0.2、ρΗ4.0~4.5、琼脂10~16 ;发酵培养基(g/L):玉米淀粉8~15、NH4N034~8、MgSO4.7Η200.4、FeSO4.7Η200.4、ρΗ4.0 ~4.5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)所述的无菌生理盐水为0.85%氯化钠；摇床振荡活化温度为30~40°C，时间为0.5~1.5h ;微波照射处理时间为10~25s ；经筛选菌落摇瓶发酵的温度为30~40°C，时间为48~72h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的种子培养基(g/L):玉米淀粉 50 ~60、NH4N035 ~8、MgSO4.7H202、FeSO4.7Η200.4、ρΗ4.0 ~4.5 ;种子培养温度为30~40°C，摇床转速为150~250r/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的发酵培养基(g/L):玉米淀粉 120 ~150、NH4N036 ~10、MgS04.7H202、FeSO4.7Η200.4、ρΗ4.0 ~4.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的接种量为8%~10%，通风量I~1.5vvm,发酵温度30~40°C。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)所述的阴离子交换树脂为D311。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)所述的发酵液上柱流速为3~6mL/min,以I~2mol/L的NaOH溶液为洗脱剂,洗脱流速为5~8mL/min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤9)所述的真空干燥温度为50°C以上，干燥时间I~2h。
【文档编号】C07C51/47GK103468752SQ201310143806
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年4月24日 优先权日:2013年4月24日
【发明者】许波, 贺玉荣 申请人:北京贯虹科技集团有限公司