一种博来霉素族衍生物的分离和纯化方法
【专利摘要】本发明涉及生物医药【技术领域】，具体涉及一种从黄绿链霉重组工程菌SB9026（保藏号CCTCC?M2011292）的发酵液中分离和纯化博来霉素族衍生物6’-脱羟基-BLM?S的方法。该方法包括沉淀分离前处理、D-113和Diaion?HP-20树脂吸附洗提、Silica?Flash柱等梯度洗提、脱铜精制等步骤。该方法简化和减少了分离纯化步骤，降低了生产成本，增加了回收率。本发明的博来霉素族衍生物其化学结构通式如说明书中所示。
【专利说明】一种博来霉素族衍生物的分离和纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药【技术领域】，具体涉及一种从黄绿链霉菌重组工程菌SB9026的发酵液中高效分离和纯化新型活性博来霉素族衍生物6’ -脱羟基-BLM S的方法。
【背景技术】
[0002]肿瘤是危害人类健康的严重疾病之一，目前全世界有恶性肿瘤病人约1400万，我国每年癌症发病人数约180万至200万，死亡140万至150万。我国居民每死亡5人中，SP有I人死于癌症。世界卫生组织预测，到2020年，每年新发癌症病人数将达到1500万，癌症已经成为新世纪人类的第一杀手，并成为全球最大的公共卫生问题。
[0003]博莱霉素(Bleomycin,缩略BLM)是从轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)中分离发现的一类糖肽类抗肿瘤抗生素，目前已发现十余种博莱霉素天然组分，其中主要成分为博莱霉素A2 (55%~70%)和博莱霉素B2 (25%~32%)。随后发现的泰莱霉素、佐伯霉素和腐草霉素等糖肽类天然产物与博莱霉素的结构和活性都极为相似，因此这一类天然产物被统称为博莱霉素族糖肽类抗肿瘤抗生素。博莱霉素族抗生素能够选择性地诱导单链或双链DNA的断裂，从而抑制肿瘤细胞DNA合成和复制。以BLM A2和B2为主要成分的商品药Blenoxane?作为一种重要的有效抗肿瘤药物，在临床上与其他试剂一起联合广泛应用于治疗睾丸 癌，及霍奇金淋巴瘤、鳞状上皮细胞癌、生殖细胞瘤和其他肿瘤。但是，博莱霉素诱导的剂量依赖性肺纤维化作为主要的副作用严重限制了其在临床的应用。
[0004]要推广博莱霉素类化合物在临床上的应用，就必须解决其诱导的肺毒性以及肿瘤细胞逐渐形成的耐药性等关键性问题，因此必须开发新型的高效低毒的博莱霉素族衍生物。因为博莱霉素族化合物的分子结构较为复杂，所以通过传统的化学全合成方法来获取其相关衍生物的过程及其繁琐且效率低下，无法满足临床研究的需要和工业化生产的应用，并且合成的博莱霉素衍生物也并未展示出更好的活性或更低的毒性。新兴的组合生物合成方法通过遗传操纵次代谢产物生物合成基因来获取目标天然产物衍生物，是一种非常有应用前景的高新技术。
[0005]专利申请号201110276318.9，从佐伯霉素的原始高产菌株黄绿链霉菌SB9001出发，我们应用基因重组技术将黄绿链霉菌SB9001中的zbmVIII基因完全失活后得到不生产佐伯霉素的黄绿链霉菌突变株，然后以该突变株作为异源宿主，将包含完整博莱霉素生物合成基因簇(blm基因簇)的人造细菌染色体质粒blml-6E转入其中获得黄绿链霉菌重组工程菌SB9026 (保藏号CCTCC M2011292)。从该重组工程菌的发酵培养产物中我们成功得到一种新型博莱霉素衍生物6’-脱羟基-BLM S，并且初步生物活性测试表明6’-脱羟基-BLMS的DNA裂解活性至少是博莱霉素-A2的10倍以上。这说明在更少用量的条件下，6’ -脱羟基-BLM S比目前临床使用的任何一种博莱霉素类抗癌药物的毒性都要低，因此作为迄今为止发现的最有效的博莱霉素衍生物，6’-脱羟基-BLM S很有希望成为博莱霉素族化合物中的新型抗癌药物。因此，无论是从现阶段研究的需要，还是将来工业化应用的需求，如何建立一套快速高效的6’ -脱羟基-BLM S的分离纯化方法都迫在眉睫。
【发明内容】
[0006]现有的分离纯化方法步骤较多，增加了生产的成本和目标产物在过程中的损耗；尤其是最后通过EDTA进行脱铜精制的步骤，使得6’ -脱羟基-BLM S的回收率大大降低。针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种利用黄绿链霉重组工程菌SB9026来高效合成新型活性博莱霉素衍生物的分离和纯化方法，该方法简化并减少了分离纯化步骤，降低了生产成本,提高了脱铜率,增加了目标产物的回收率。
[0007]为实现上述目的，本发明的技术方案是:
[0008]一种博来霉素族衍生物的分离和纯化方法，具体步骤为:
[0009](I)收集黄绿链霉重组工程菌SB9026经过发酵培养后得到的发酵液，加入十二水合硫酸铝钾，每升发酵液中加入十二水合硫酸铝钾0.4g-0.6g，充分搅拌后，静置25-30分钟后再加入硅藻土，每升发酵液中加入硅藻土 5g-6g，搅拌后进行固液分离，得到pH值为6-8的发酵上清液；所述黄绿链霉重组工程菌SB9026的保藏号为CCTCC M2011292 ；
[0010](2)向步骤(1)得到的发酵上清液中加入D113型弱酸性阳离子交换树脂富集吸附1-2小时，每升发酵上清液中加入D113型弱酸性阳离子交换树脂90ml-110ml ;将吸附后的D113型弱酸性阳离子交换树脂装入分离柱I并用去离子水冲洗至洗提液无色，然后用1.5-2.5倍于分离柱I柱体积的质量浓度为0.4%-0.5%的NaCl溶液冲洗树脂柱，最后用质量浓度为10%-12%的NaCl溶液进行洗提，收集洗提液；
[0011](3 )将步骤(2 )得到的洗提液与450ml-550ml Diaion HP-20树脂混合并在200C -25°C的温度下震荡25min-35min进行吸附，将Diaion HP-20树脂装入分离柱II后用
4.5-5.5倍于分离柱II柱体积的去离子水冲洗并排干残余水,然后用0.5-1.5倍分离柱体积的纯甲醇进行洗提，收集的甲醇洗提液浓缩蒸干后得到粗提物；
[0012](4)将步骤(3)得到的粗提物用质量浓度为4%_5%的甲醇去离子水溶液溶解，离心去除不溶物后所得的上清液载入Silica Flash柱，并用4%_5%的甲醇去离子水溶液进行等梯度洗提，直至洗提液中不含目标产物6’ -脱羟基-BLM S为止，收集洗提液合并浓缩后得到浅蓝色铜离子复合物粗品；
[0013](5)将步骤(4)得到的铜离子复合物粗品脱铜精制:每I克铜离子复合物粗品用15ml-20ml甲醇溶解，得复合物溶液；每0.2g 二乙基二硫代氨基甲酸钠用2ml_3ml甲醇溶解，得二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液；将复合物溶液与二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液充分混合，得混合溶液，使得混合溶液中铜离子复合物粗品与二乙基二硫代氨基甲酸钠的质量比为1:0.2-0.3 ;将混合溶液离心得到上清液，将上清液与丙酮按1:4-5的体积比充分混合，离心后去上清液，沉淀物用丙酮淋洗2-3次后在62°C _68°C下常压恒温干燥，得到不含铜离子的粗纯化产物；每I克的粗纯化产物用50ml-60ml去离子水充分溶解后，加入丙酮直至丙酮质量浓度达到65%-70%，在4°C _5°C的环境下静置18-20小时后进行离心处理，将离心处理后所得的上清液浓缩蒸干，得到不含铜离子的纯化6’ -脱羟基-BLM S。
[0014]优选的具体步骤为:
[0015](I)收集黄绿 链霉重组工程菌SB9026经过发酵培养后得到的发酵液，加入十二水合硫酸铝钾，每升发酵液中加入十二水合硫酸铝钾0.5g，充分搅拌后，静置30分钟后再加入硅藻土，每升发酵液中加入硅藻土 5g，搅拌后进行固液分离，得到pH值为7-8的发酵上清液；所述黄绿链霉重组工程菌SB9026的保藏号为CCTCC M2011292 ；
[0016](2)向步骤(1)得到的发酵上清液中加入D113型弱酸性阳离子交换树脂富集吸附1-2小时，每升发酵上清液中加入D113型弱酸性阳离子交换树脂100mL ;将吸附后的D113型弱酸性阳离子交换树脂装入分离柱I并用去离子水冲洗至洗提液无色，然后用2倍于分离柱I柱体积的质量浓度为0.5%的NaCl溶液冲洗树脂柱，再用质量浓度为10%的NaCl溶液进行洗提，收集洗提液；
[0017](3)将步骤(2)得到的洗提液与500ml Diaion HP-20树脂混合并在20°C _25°C的温度下震荡30min进行吸附，然后将Diaion HP-20树脂装填入入分离柱II，用5倍于柱体积的去离子水冲洗并排干残余水，用I倍于分离柱II柱体积的纯甲醇进行洗提，收集的甲醇洗提液浓缩蒸干后得到粗提物；
[0018](4)将步骤(3)得到的粗提物用质量浓度为5%的甲醇去离子水溶液溶解，离心去除不溶物后所得的上清液载入Silica Flash柱，并用5%的甲醇去离子水溶液进行等梯度洗提，直至洗提液中不含目标产物6’ -脱羟基-BLM S为止，收集洗提液合并浓缩后得到浅蓝色铜离子复合物粗品；
[0019](5)将步骤(4)得到的铜离子复合物粗品脱铜精制:每I克铜离子复合物粗品用15ml甲醇溶解，得复合物溶液；每0.2g 二乙基二硫代氨基甲酸钠用2ml甲醇溶解，得二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液；将复合物溶液与二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液充分混合，得混合溶液，使得混合溶液中铜离子复合物粗品与二乙基二硫代氨基甲酸钠的质量比为1:0.2 ;将混合溶液离心后去上清液，沉淀物用丙酮淋洗3次后在65°C下常压恒温干燥，得到不含铜离子的粗纯化产物；将I克的粗纯化产物用50ml去离子水充分溶解后，加入丙酮直至丙酮质量浓度达到65%，在4°C _5°C的环境下静置于18-20小时进行离心处理，将离心处理后得到的上清液浓缩蒸干，得到不含铜离子的纯化6’ -脱羟基-BLM S。
[0020]步骤(2)、(3)、(4)、(5)中优选用以下分析方法来检测洗提液或粗提物中是否含有目标产物:采用高效液相色谱分析，以下百分含量均为质量百分含量，流动相A为99.0%去离子水和1.0%醋酸；流动相B为99.0%甲醇和1.0%醋酸，流速为1.0mL/min,紫外检测器波长为300nm，线性梯度分析程序为:0_10分钟，95%A/5%B至65%A/35%B ;10_15分钟，65%A/35%B 至 95%A/5%B ； 15-20 分钟，95%A/5%B。
[0021]本发明的原理是:
[0022]本发明的一种博来霉素族衍生物的分离和纯化方法，第(I)步是通过前处理尽可能地将发酵液中的不溶物和悬浮物去除，提高发酵上清液的质量，保证后继树脂吸附时的效率和延长树脂的使用寿命；第(2)步是通过离子交换将发酵上清液中的目标产物吸附富集，以达到初步分离的效果；第(3)步是通过大孔吸附树脂除去部分盐和色素，同时达到溶剂置换的效果(溶剂由水变为洗提液甲醇)，便于后继处理；第(4)步是通过柱层析方法将目标产物和其他副产物有效的分离，同时除去色素，以达到分离纯化的目的；第(5)步是将得到的铜离子复合物粗品进行脱铜精制，将复合物中的铜离子去掉，得到最终的目标产物，同时通过丙酮沉淀进行最后的精制，进一步提高目标产物的纯度。[0023]第(I)步收集发酵液后，加入十二水合硫酸铝钾，充分搅拌后，再加入硅藻土搅拌后进行固液分离，得到PH值为7.5左右的发酵上清液。其中十二水合硫酸铝钾作为絮凝剂可以去除发酵液中的悬浮物质，硅藻土作为助滤剂可以帮助沉淀菌丝体和由十二水合硫酸铝钾絮凝下来的固体悬浮物质，添加两者极大地提高了固液分离效率，使得分离后得到的发酵上清液质量大幅提高，减少了后继处理过程中对树脂的影响(例如发酵上清液质量不好，清度不高时，容易导致树脂中毒，降低树脂的吸附效率和使用寿命，极大地增加生产成本等)。同时，得到的发酵上清液PH值为7.5左右，无须再进行pH值调节的前处理，简化了分离过程。
[0024]第(2)步中向发酵上清液中直接加入国产D113型弱酸性阳离子交换树脂进行富集吸附和洗涤，相比使用进口树脂而言可以明显地降低生产成本。
[0025]本方法在第(4)步分离前不需要用“ s印hadexLH-20柱和甲醇溶液进行洗提”的过程，减少了提纯工艺步骤，减少了目标产物的损失。
[0026]本方法第(4)步通过简单的Flash柱和等梯度洗脱分离方法，便可有效地将目标产物6’ -脱羟基-BLM S纯化分离，无须使用诸如制备液相色谱这类高端仪器来分离和纯化，极大地降低了生产成本，简化了分离纯化过程。
[0027]第(5)步在进行最后的脱铜精制时，原始方法使用EDTA脱铜效率较低，脱铜不完全，脱铜率仅为80%左右，大大降低了最后的纯化产物回收率；本发明利用铜试剂对铜离子极强的捕捉能力，对脱铜工艺进行了改进，脱铜率提高到90%左右，提高了目标产物的回收率。
[0028]使用原始的分离纯化工艺(实施例2的工艺)，由于步骤繁多，且脱铜效率不高，产物回收率仅为15%左右；采用本发明中建立的分离提纯工艺，减少了分离纯化步骤，提高了脱铜的效率，使目标产物 回收率提高到20%-25%。
[0029]下面对本发明做进一步的解释和说明:
[0030]本发明所述的博来霉素族衍生物或其异构体、非对映体、对映体，或其水解物、水合物、金属螯合物，或其医药用盐，其化学结构通式如式(I)所示:
[0031]
【权利要求】
1.一种博来霉素族衍生物的分离和纯化方法，其特征是，具体步骤为: (O收集黄绿链霉重组工程菌SB9026经过发酵培养后得到的发酵液，加入十二水合硫酸铝钾，每升发酵液中加入十二水合硫酸铝钾0.4g-0.6g，充分搅拌后，静置25-30分钟后再加入娃藻土，每升发酵液中加入娃藻土 5g-6g,搅拌后进行固液分离,得到pH值为6-8的发酵上清液；所述黄绿链霉重组工程菌SB9026的保藏号为CCTCC M2011292 ； (2)向步骤(1)得到的发酵上清液中加入D113型弱酸性阳离子交换树脂富集吸附1-2小时，每升发酵上清液中加入D113型弱酸性阳离子交换树脂90ml-110ml ;将吸附后的D113型弱酸性阳离子交换树脂装入分离柱I并用去离子水冲洗至洗提液无色，然后用1.5-2.5倍于分离柱I柱 体积的质量浓度为0.4%-0.5%的NaCl溶液冲洗树脂柱，最后用质量浓度为10%-12%的NaCl溶液进行洗提，收集洗提液； (3)将步骤(2)得到的洗提液与450ml-550mlDiaion HP-20树脂混合并在20°C -25°C的温度下震荡25min-35min进行吸附，将Diaion HP-20树脂装入分离柱II后用4.5-5.5倍于分离柱II柱体积的去离子水冲洗并排干残余水，然后用0.5-1.5倍分离柱体积的纯甲醇进行洗提，收集的甲醇洗提液浓缩蒸干后得到粗提物； (4)将步骤(3)得到的粗提物用质量浓度为4%-5%的甲醇去离子水溶液溶解，离心去除不溶物后所得的上清液载入Silica Flash柱，并用4%_5%的甲醇去离子水溶液进行等梯度洗提，直至洗提液中不含目标产物6’ -脱羟基-BLM S为止，收集洗提液合并浓缩后得到浅蓝色铜离子复合物粗品； (5)将步骤(4)得到的铜离子复合物粗品脱铜精制:每I克铜离子复合物粗品用15ml-20ml甲醇溶解，得复合物溶液；每0.2g 二乙基二硫代氨基甲酸钠用2ml_3ml甲醇溶解，得二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液；将复合物溶液与二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液充分混合，得混合溶液，使得混合溶液中铜离子复合物粗品与二乙基二硫代氨基甲酸钠的质量比为1:0.2-0.3 ;将混合溶液离心得到上清液，将上清液与丙酮按1:4-5的体积比充分混合，离心后去上清液，沉淀物用丙酮淋洗2-3次后在62°C _68°C下常压恒温干燥，得到不含铜离子的粗纯化产物；每I克的粗纯化产物用50ml-60ml去离子水充分溶解后，加入丙酮直至丙酮质量浓度达到65%-70%，在4°C _5°C的环境下静置18-20小时后进行离心处理，将离心处理后所得的上清液浓缩蒸干，得到不含铜离子的纯化6’ -脱羟基-BLM S。
2.根据权利要求1所述一种博来霉素族衍生物的分离和纯化方法，其特征是，具体步骤为: (1)收集黄绿链霉重组工程菌SB9026经过发酵培养后得到的发酵液，加入十二水合硫酸铝钾，每升发酵液中加入十二水合硫酸铝钾0.5g，充分搅拌后，静置30分钟后再加入硅藻土，每升发酵液中加入硅藻土 5g，搅拌后进行固液分离，得到pH值为7-8的发酵上清液；所述黄绿链霉重组工程菌SB9026的保藏号为CCTCC M2011292 ； (2)向步骤(1)得到的发酵上清液中加入D113型弱酸性阳离子交换树脂富集吸附1-2小时，每升发酵上清液中加入D113型弱酸性阳离子交换树脂100mL ;将吸附后的D113型弱酸性阳离子交换树脂装入分离柱I并用去离子水冲洗至洗提液无色，然后用2倍于分离柱I柱体积的质量浓度为0.5%的NaCl溶液冲洗树脂柱，再用质量浓度为10%的NaCl溶液进行洗提，收集洗提液； (3)将步骤(2)得到的洗提液与500mlDiaion HP-20树脂混合并在20°C _25°C的温度下震荡30min进行吸附，然后将Diaion HP-20树脂装填入入分离柱II，用5倍于柱体积的去离子水冲洗并排干残余水，用I倍于分离柱II柱体积的纯甲醇进行洗提，收集的甲醇洗提液浓缩蒸干后得到粗提物； (4)将步骤(3)得到的粗提物用质量浓度为5%的甲醇去离子水溶液溶解，离心去除不溶物后所得的上清液载入Silica Flash柱，并用5%的甲醇去离子水溶液进行等梯度洗提，直至洗提液中不含目标产物6’-脱羟基-BLM S为止，收集洗提液合并浓缩后得到浅蓝色铜离子复合物粗品； (5)将步骤(4)得到的铜离子复合物粗品脱铜精制:每I克铜离子复合物粗品用15ml甲醇溶解，得复合物溶液；每0.2g二乙基二硫代氨基甲酸钠用2ml甲醇溶解，得二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液；将复合物溶液与二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液充分混合，得混合溶液，使得混合溶液中铜离子复合物粗品与二乙基二硫代氨基甲酸钠的质量比为1:0.2 ;将混合溶液离心后去上清液，沉淀物用丙酮淋洗3次后在65°C下常压恒温干燥，得到不含铜离子的粗纯化产物；将I克的粗纯化产物用50ml去离子水充分溶解后，加入丙酮直至丙酮质量浓度达到65%，在4°C _5°C的环境下静置于18-20小时进行离心处理，将离心处理后得到的上清液浓缩蒸干，得到不含铜离子的纯化6’ -脱羟基-BLM S。
3.根据权利要求1或2所述一种博来霉素族衍生物的分离和纯化方法，其特征是，步骤(2)、(3)、(4)、(5)中用以下分析方法来检测洗提液或粗提物中是否含有目标产物:采用高效液相色谱分析，以下百分含量均为质量百分含量，流动相A为99.0%去尚子水和1.0%醋酸；流动相B为99.0%甲醇和1.0%醋酸，流速为1.0mL/min,紫外检测器波长为300nm，线性梯度分析程序为:0-10 分钟，95%A/5%B 至 65%A/35%B ; 10-15 分钟，65%A/35%B 至 95%A/5%B ；15-20 分钟，95%A/5% B。
【文档编号】C07K1/18GK104004065SQ201310060071
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2013年2月26日 优先权日:2013年2月26日
【发明者】段燕文, 沈奔, 朱湘成, 杨虎 申请人:长沙天赐生物医药科技有限公司, 长沙慈航药物研究所有限公司, 哈药慈航制药股份有限公司