一类新的抑制新生血管的小肽及其应用的利记博彩app
【专利摘要】一类新的抑制新生血管的小肽及其应用。本发明涉及一类预防和抑制血管新生的多肽及其应用。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。本发明多肽具有多种优点，例如分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度等。
【专利说明】一类新的抑制新生血管的小肽及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一类新的抑制新生血管的小肽，本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。
【背景技术】
[0002]新生血管的形成是一个极其复杂的过程，它包括:现存血管的扩张、血管通透性的增加、血管周围基质的降解、内皮细胞的激活增殖、迁移以及新的毛细血管样管腔的形成。
[0003]在眼部，约2/3的致盲性疾病均与病理性新生血管有关，例如:单纯疱疹性角膜基质炎引起的角膜新生血管，年龄相关性黄斑变性中的脉络膜新生血管，以及糖尿病视网膜病变或早产儿视网膜病变中的视网膜新生血管等。目前临床上，对于眼部病理性新生血管常规运用激光光凝、光动力学疗法(Photodynamic therapy, PDT)以及经瞳孔温热疗法(Thermal transpupilIary therapy, TTT)等进行治疗。然而，这些治疗手段不仅对局部组织易造成破坏，其远期疗效也并不十分令人满意。因此，近年来人们不断尝试开发治疗眼部病理性新生血管更有效的方法。
[0004]在开发有效的血管新生抑制剂时，应充分考虑到眼科用药的特殊性。
[0005]第一，眼部存在多个解剖性和功能性的屏障。全身给药常常由于血-房水屏障和血-视网膜屏障而无法在眼组织局部达到足够的药物浓度；局部给药，如玻璃体腔注射，大于76.5kDa的大分子在 理论上很难穿透视网膜作用于视网膜和脉络膜新生血管。对于眼表给药，药物必须要先后穿透亲脂性的角膜上皮细胞紧密连接和亲水性的角膜基质，因此只有具备适当脂溶性、低分子量或能与眼表组织内的转运体(如:氨基酸转运体、寡肽转运体等)结合的药物才能到达前房发挥作用。
[0006]第二，药物在亲水的泪液、房水、玻璃体液中溶解的程度与其有效性呈正相关。
[0007]第三，基于上述主要原因，眼科用药的生物利用度很低；要使之提高，可加大给药的浓度。用于治疗肿瘤新生血管的化合物毒副作用较为明显，全身和局部均无法高剂量给药。此外，分子量较大的外源性蛋白质也是敏感的异物源，可对眼部组织(如:葡萄膜)造成免疫损伤。
[0008]第四，目前虽然已经有一系列相对安全的内源性血管新生抑制剂被先后证实，如血管抑素(angiostatin),它由纤溶酶原 Kringle 结构域 1-4(plasminogen Kringlel-4)组成，可明显抑制血管依赖性肿瘤的生长，但由于其分子量较大且空间构象复杂，故在制备过程中存在重组表达纯化工艺繁琐和内毒素残留等不足。正是由于上述种种条件的限制，目前用于治疗眼部新生血管的药物十分有限，比如重组抗人VEGF单克隆抗体bevacizumab (Avastin)、重组抗人 VEGF 单克隆抗体片段 ranibizumab (Lucentis)等,但它们价格高昂，并且需反复经玻璃体腔给药，甚至可引起血管栓塞等风险。
[0009]由此可见，寻找具有特异生物学活性和生物相容性的小分子抑制剂，经无创或微创的给药途径透过各种眼组织屏障，提高眼局部的生物利用度，降低给药剂量，减少局部和全身的副作用，对新生血管性眼病的临床防治具有十分重要的意义。因此，本领域迫切需要开发一种适于眼球组织的有效安全的小分子新生血管抑制剂。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一类适于眼球组织的有效安全的可抑制血管新生的小分子多肽以及其片段、类似物和衍生物。
[0011]本发明的另一目的是提供含所述多肽的制法和应用。
[0012]在本发明的第一方面，提供了在本发明的第一方面，提供了一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐
[0013][XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[XaalO]-[XaalI] (I)
[0014]式中，
[0015]XaaO是无，或I~2个氨基酸构成肽段；
[0016]Xaal 是选自下组的氨基酸:Ile;Leu;Val;Met;Ala;或 Phe ;
[0017]Xaa2是选自下组的氨基酸:Ser;或Thr ；
[0018]Xaa3是选自下组的氨基酸:Lys;Arg;Gln;或Asn ;
[0019]Xaa4是选自下组的氨基酸:Glu;或Asp ；
[0020]Xaa5是选自下组的氨基酸:Thr;或Ser ；
[0021]Xaa6是选自下组的氨基酸:Lys;Arg;Gln;或Asn ;
[0022]Xaa7是选自下组的氨基酸:Lys;Arg;Gln;或Asn ；
[0023]Xaa8是选自下组的氨基酸:Lys;Arg;Gln;或Asn ;
[0024]Xaa9 是选自下组的氨基酸:Tyr;Trp;Phe;Thr;或 Ser ;
[0025]XaalO 是选自下组的氨基酸:Tyr; Trp; Phe; Thr;或 Ser ;
[0026]Xaal I是无，或I~2个氨基酸构成肽段；
[0027]并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的长度为10~14个氨基酸。
[0028]更佳地，所述的多肽中:
[0029]XaaO 是无；
[0030]Xaal是选自下组的氨基酸:Ile ;或Leu ;
[0031]Xaa2是选自下组的氨基酸:Ser ;或或Thr ；
[0032]Xaa3是选自下组的氨基酸:Lys ;*Arg ;
[0033]Xaa4是选自下组的氨基酸:Glu ;或Asp ;
[0034]Xaa5是选自下组的氨基酸:Thr ;或Ser ；
[0035]Xaa6是选自下组的氨基酸:Lys ;*Arg ;
[0036]Xaa7是选自下组的氨基酸:Lys ;*Arg ;
[0037]Xaa8是选自下组的氨基酸:Lys ;*Arg ;
[0038]Xaa9是选自下组的氨基酸:Tyr ；^Phe ；
[0039]XaalO是选自下组的氨基酸:Tyr ;*Phe ；
[0040]Xaall 是无
[0041] 在另一优选例中，所述多肽的长度为10~14个氨基酸；[0042]在另一优选例中，所述多肽的长度为9~14个氨基酸。
[0043]在另一优选例中，所述多肽选自下组:
[0044](a)具有SEQIDN0:2所示氨基酸序列的多肽；
[0045](b)将SEQIDN0:2所示氨基酸序列经过1_4个(较佳地1_3，更佳地1_2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。
[0046]在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了 > 70%的SEQ ID N0:2的所示多肽的抑制血管新生活性。
[0047]在另一优选例中，所述的衍生多肽与SEQ ID N0:2的相同性≥80%，较佳地≥90% ；更佳地> 95%。
[0048]本发明还提供了具有抑制血管新生功能的、式I化合物的二聚体和多聚体形式。
[0049]在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明上述的多肽。
[0050]在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有:
[0051](a)本发明上述的多肽或其药学上可接受的盐；和
[0052](b)药学上可接受的载体或赋形剂。 [0053]在另一优选例中，所述组合物的剂型为眼药水、针剂(如眼周和眼内注射液)、眼用凝胶或眼药膏。
[0054]在另一优选例中，所述的组合物为缓释剂型。
[0055]在本发明的第四方面，提供了一种本发明所述多肽或药学上可接受的盐的用途，它们被用于制备抑制血管新生或防治与血管新生相关疾病的药物。
[0056]在本发明的第五方面，提供了一种抑制哺乳动物血管新生的方法，包括步骤:给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。
[0057]在另一优选例中，所述的对象是人。
[0058]在另一优选例中，所述的血管新生是与新生血管性眼病相关的血管新生。
[0059]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0060]下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
[0061]图1显示了小肽ZY6对人脐静脉血管内皮细胞HUVECs增殖的影响，小肽ZY6具有显著抑制内皮细胞增殖的效应。相对于VEGF组，VEGF+多肽ZY6组(I μ M~100 μ Μ)具有显著抑制HUVECs增殖的作用，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，差异具有统计学意义。
[0062]图2显示小肽ΖΥ6对人脐静脉血管内皮细胞HUVECs管腔形成的影响，可见小肽ΖΥ6具有显著抑制内皮细胞管腔形成的效应。
[0063]图2a_2c显示小肽ZY6对HUVECs管腔形成的抑制作用。
[0064]图2a 为 VEGF 组；图 2b 为 VEGF+ZY6 (100 μ M)组；图 2c 为相对于 VEGF 组，VEGF+小肽ZY6组(I μ M~100 μ Μ)具有显著抑制HUVECs管腔形成的作用，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，差异具有统计学意义。[0065]图3显示小肽ZY6对鸡胚尿囊膜上新生血管具有显著的抑制效应。
[0066]图3a_3c示滤纸片周2.5mm范围内3_5级微血管计数。
[0067]图3a 为 PBS 组；图 3b 为 ZY6 (10 μ I/ 片)组；图 3c 为 ZY6 (50 μ I/ 片)组；图 3d为相对于PBS组，各个浓度的小肽ΖΥ6组均明显抑制鸡胚尿囊膜新生血管数，且抑制作用呈浓度依赖性，*P〈0.05, **Ρ〈0.01，差异具有统计学意义。
[0068]图4显示小肽ΖΥ6对小鼠视网膜新生血管具有显著的抑制效应。
[0069]图4a为PBS组；图4b为ZY6 (2 μ g/ μ I)组；图4c为相对于高氧+PBS组，高氧+ZY6组(lyg/yl~2yg/yl)显著抑制小鼠视网膜新生血管数，且抑制作用呈浓度依赖性，*Ρ〈0.05, **Ρ<0.01，差异具有统计学意义。
【具体实施方式】
[0070]本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一类具有抑制血管新生功能的，分子量小于3kD的小分子多肽。具体而言，本发明人应用生物信息学的方法，基于同源性分析和生物学特性等分析，设计了数个候选序列，采用固相法将其合成，分离纯化获得高纯度的小肽ZY6，并运用HPLC及MS对之进行鉴定，再经鸡胚尿囊膜血管模型、氧诱导小鼠视网膜新生血管模型、VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞增殖模型和人脐静脉内皮细胞管腔模型筛选，获得了一类新型的、具有预防和治疗血管新生相关疾病的小分子多肽。
[0071]本发明的小肽的分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用。在此基础上完成了本发明。
[0072]人Neuropil in-1
[0073]Neuropilin是1995年Satoda等人首次报道的一种跨膜糖蛋白。根据neuropil in基因的选择性拼接，可形成两个异构体:Neuropilin-l和Neuropilin_2,两者之间有44%的同源性。与其他Neuropilin家族成员高度保守结构一样,Neuropilin-1为跨膜蛋白，其胞外有3个不同的结构域，分别称为al/a2、FV/FV III(bl/b2)和MAM(c)，其跨膜区及胞浆内区域归入d结构域。Neuropilin-1基因在人体组织内广泛表达,例如:神经系统、内皮细胞、某些肿瘤细胞、心、肺、胎盘等。在新生血管生成过程中，VEGF-165、P1GF_2、VEGF-B、VEGF-E可与Neuropilin-Ι结合，激活下游的信号转导通路，发挥重要的生物学效应。
[0074]活性多肽
[0075]在本发明中，术语“本发明多肽”、“ZY6多肽”、“ZY6小肽”、“短肽ZY6”或“肽ZY6”可互换使用，都指具有血管新生抑制活性的肽ZY6氨基酸序列(ISKETKKKYY，如SEQ ID NO: 2所示)的蛋白或多肽。此外，所述术语还包括具有抑制血管新生功能的、SEQIDN0:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):1-4个(较佳地1-3个，更佳地1-2个，最佳地I个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为4个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。一种典型的多肽为C末端和/或N末端缺失一个氨基酸，即构成9个氨基酸的多肽。[0076]本发明还包括ZY6多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持抑制血管新生功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或
(iii)ZY6多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或α V)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0077]—类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多4个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地I个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
[0078]表1
[0079]
【权利要求】
1.一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐
[XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[XaalO]-[Xaall] (I) 式中， XaaO是无，或I~2个氨基酸构成肽段； Xaal是选自下组的氨基酸:1Ie;Leu;Val;Met;Ala;或Phe ； Xaa2是选自下组的氨基酸:Ser;或Thr ； Xaa3是选自下组的氨基酸:Lys;Arg;Gln;或Asn ； Xaa4是选自下组的氨基酸:Glu;或Asp ； Xaa5是选自下组的氨基酸:Thr;或Ser ； Xaa6是选自下组的氨基酸:Lys;Arg;Gln;或Asn ； Xaa7是选自下组的氨基酸:Lys;Arg;Gln;或Asn ； Xaa8是选自下组的氨基酸:Lys;Arg;Gln;或Asn ； Xaa9是选自下组的氨基酸:Tyr;Trp;Phe;Thr;或Ser ； XaalO是选自下组的氨基酸:Tyr;Trp;Phe;Thr;或Ser ； Xaall是无，或I~2个氨基酸构成肽段； 并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的长度为10~14个氨基酸。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，XaaO是I~2个氨基酸构成的肽段。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，XaalO是I~2个氨基酸构成的肽段。
4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自下组: (a)具有SEQID NO:2所示氨基酸序列的多肽； (b)将SEQID NO:2所示氨基酸序列经过1-4个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。
5.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的多肽。
6.一种药物组合物，其特征在于，它含有: (a)权利要求1所述多肽或其药学上可接受的盐；和 (b)药学上可接受的载体或赋形剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为针剂、眼药水、眼用凝胶或眼药膏。
8.如权利要求1所述的多肽或药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备抑制血管新生或防治与血管新生相关的疾病的药物。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的与血管新生相关的疾病的选自下组:新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger's病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症和肉瘤状病。
10.一种抑制哺乳动物血管新生的方法，其特征在于，包括步骤:给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。
【文档编号】C07K7/08GK103992376SQ201310052714
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2013年2月18日 优先权日:2013年2月18日
【发明者】郑颖, 许迅 申请人:上海市第一人民医院