经修饰的核苷、核苷酸和核酸组合物的利记博彩app

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【专利摘要】本公开尤其提供了包含可以编码蛋白质、蛋白质前体或者所述蛋白质或蛋白质前体的经部分或完全加工的形式的经修饰的核酸分子的制剂组合物。所述制剂组合物还可以包括经修饰的核酸分子和递送剂。本发明还提供了可用于编码能够调节细胞功能和/或活性的多肽的核酸。
【专利说明】经修饰的核苷、核苷酸和核酸组合物
[0001] 序列表引用
[0002] 本申请随电子格式的序列表一起提交。名为M11PCTSQLST. txt的序列表文件是在 2012年12月14日创建且大小为25, 579个字节。电子格式的序列表中的信息以全文引用 的方式并入本文中。
[0003] 相关申请的交叉引用
[0004] 本申请要求以下美国临时专利申请和国际公布的权益：2011年12月16日 提交的标题为"Modified Nucleoside，Nucleotide, and Nucleic Acid Compositions" 的美国临时专利申请号61/576, 705、2012年4月2日提交的标题为"Modified Nucleoside, Nucleotide, and Nucleic Acid Compositions" 的美国临时专利申请号 61/618, 957、2012 年 5 月 17 日提交的标题为"Modified Nucleoside, Nucleotide, and Nucleic Acid Compositions"的美国临时专利申请号61/648, 244、2012年8月10日提交 的标题为"Modified Nucleoside, Nucleotide, Nucleic Acid Compositions"的美国临时专 利申请号 61/681，712 和 2012 年 9 月 4 日提交的标题为"Modified Nucleoside, Nucleotide and Nucleic Acid Compositions, and Nucleic Acid Compositions" 的美国临时专利 申请号 61/696, 381、2012 年 10 月 3 日提交的标题为"Modified Nucleoside, Nucleotide and Nucleic Acid Compositions" 的美国临时专利申请号 61/709,303、2012 年 10 月 11 日提交的标题为 "Modified Nucleoside, Nucleotide and Nucleic Acid Compositions" 的美国临时专利申请号61/712, 490和2012年10月3日提交的标题为"Modified Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, And Uses Thereof" 的国际公布号 PCT/ US2012/058519,所述美国临时专利申请和国际公布的内容是以全文引用的方式并入本文 中。
[0005] 发明背景
[0006] -般来说，引入到细胞中的未经修饰的外源性核酸分子，特别是病毒核酸，会诱导 固有的免疫反应，由此导致产生细胞因子和干扰素（IFN)且最终导致细胞死亡。对于能够 向细胞中递送核酸，例如核糖核酸（RNA)，以便引起所述核酸的细胞内翻译且产生编码蛋白 质而不是产生固有免疫反应的治疗剂、诊断剂、试剂和生物测定非常感兴趣。因而，需要开 发包含可以有效地促进核酸体内递送到靶细胞而不产生固有的免疫反应的递送剂的制剂 组合物。 发明概要
[0007] 本公开尤其提供了包含可以编码蛋白质、蛋白质前体或者所述蛋白质或蛋白质前 体的经部分或完全加工的形式的经修饰的核酸分子的制剂组合物。所述制剂组合物还可以 包括经修饰的核酸分子和递送剂。本发明还提供了可用于编码能够调节细胞功能和/或活 性的多肽的核酸。
[0008] 在一个方面，描述了在哺乳动物细胞或组织中产生目的多肽的方法。所述方法包 括使所述哺乳动物细胞或组织与包含编码目的多肽的经修饰的mRNA的制剂接触。所述制 剂可以是但不限于纳米粒子、聚（乳酸-羟基乙酸）共聚物（PLGA)微球体、类脂质、脂质复 合物、脂质体、聚合物、碳水化合物（包括单糖）、阳离子脂质、纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝 胶、纤维蛋白胶、纤维蛋白密封剂、纤维蛋白原、凝血酶、快速消除型脂质纳米粒子（reLNP) 和其组合。所述经修饰的mRNA可以包含经纯化的IVT转录物。
[0009] 在一个实施方案中，包含所述经修饰的mRNA的所述制剂是可能包含至少一种脂 质的纳米粒子。所述脂质可以选自但不限于DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、 DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG 和聚乙二醇化脂质。在另一个 方面，所述脂质可以是阳离子脂质，如但不限于DLin-DMA、DLin-D-DMA、DLin-MC3-DMA、 DLin-KC2-DMA 和 DODMA。
[0010] 在所述制剂中，所述脂质与所述经修饰的mRNA的比率可以介于10:1与30:10之 间。包含所述经修饰的mRNA的所述纳米粒子制剂的平均尺寸可以介于60与225nm之间。 包含所述经修饰的mRNA的所述纳米粒子制剂的PDI介于0. 03与0. 15之间。所述脂质在 PH7.4下的ζ电位可以是-10到+10。
[0011] 经修饰的mRNA的所述制剂可以包含促融合脂质、胆固醇和PEG脂质。所述制剂可 以具有摩尔比为50:10:38. 5:1. 5-3. 0的阳离子脂质：促融合脂质：胆固醇：PEG脂质。所 述PEG脂质可以选自但不限于PEG-c-DOMG、PEG-DMG。所述促融合脂质可以是DSPC。
[0012] 可以使用如但不限于注射泵、内部渗透泵和外部渗透泵等装置接触所述哺乳动物 细胞或组织。
[0013] 经修饰的mRNA的所述制剂可以是PLGA微球体，所述PLGA微球体的尺寸可以介于 4与20 μ m之间。可以在48小时的时间段内从所述制剂中释放不到50%的所述经修饰的 mRNA。所述PLGA微球体制剂在血清中可以是稳定的。稳定性可以在90%血清中相对于未 经配制的经修饰的mRNA而测定。
[0014] 所述经修饰的mRNA PLGA微球体的负载重量百分比可以是至少0. 05%、至少 0. 1 %、至少0. 2%、至少0. 3%、至少0. 4%或至少0. 5%。所述经修饰的mRNA在所述PLGA 微球体中的囊封效率可以是至少50%、至少70%、至少90%或至少97%。
[0015] 本发明的脂质纳米粒子可以在如但不限于纤维蛋白密封剂等密封剂中配制。
[0016] 可以通过如但不限于静脉内、肌肉内、玻璃体内、鞘内、肿瘤内、肺和皮下等施用途 径接触所述哺乳动物细胞或组织。可以使用分割给药方案来接触所述哺乳动物细胞或组 织。可以通过注射来接触所述哺乳动物细胞或组织。所述注射可以对选自真皮内空间、表 皮、皮下组织和肌肉的组织进行。所述目的多肽可以在所述细胞或组织中从接触位置起在 整体位置上产生。
[0017] 在接触后可以在血清中检测到所述目的多肽持续长达72小时。所述目的多肽的 水平可以高于给药前的水平。所述目的多肽在雌性受试者的血清中的水平可以大于在雄性 受试者的血清中的水平。
[0018] 经修饰的mRNA的所述制剂可以包含超过一种经修饰的mRNA。所述制剂可以具有 两种或三种经修饰的mRNA。
[0019] 包含所述经修饰的mRNA的所述制剂可以包含快速消除型脂质纳米粒子（reLNP)， 所述快速消除型脂质纳米粒子可以包含reLNP脂质、促融合脂质、胆固醇和PEG脂质，其摩 尔比为50:10:38. 5:1. 5(reLNP脂质：促融合脂质：胆固醇：PEG脂质）。所述促融合脂质 可以是DSPC且所述PEG脂质可以是PEG-c-DOMG。所述reLNP脂质可以是具有内酯或末端 酯的DLin-DMA或者具有内酯或末端酯的DLin-MC3-DMA。总脂质与经修饰的mRNA的重量比 可以介于10:1与30:1之间。
[0020] 包含经修饰的mRNA的所述制剂可以包含纤维蛋白密封剂。
[0021] 包含经修饰的mRNA的所述制剂可以包含类脂质，其中所述脂质是选自C12-200和 98N12-5。
[0022] 包含经修饰的mRNA的所述制剂可以包括聚合物。所述聚合物可以涂布有、覆盖 有、环绕有、封围有或包含一层水凝胶或外科用密封剂。所述聚合物可以选自PLGA、乙烯/ 乙酸乙烯酯共聚物、泊洛沙姆和G ELSITES。
[0023] 可以通过使哺乳动物细胞或组织与包含编码所述目的多肽的经修饰的mRNA的缓 冲剂制剂接触而在所述哺乳动物细胞或组织中产生目的多肽。所述缓冲剂制剂可以选自 但不限于生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水和林格氏乳酸盐。所述缓冲剂制剂可以包含介于 1与10mM之间的钙浓度。所述缓冲剂制剂中的经修饰的mRNA可以包含经纯化的IVT转录 物。
[0024] 可以通过使灵长类动物与包含经配制的编码目的多肽的经修饰的mRNA的组合物 接触而在所述灵长类动物中产生药理学作用。所述经修饰的mRNA可以包含经纯化的IVT 转录物，和/或可以在以下各物中配制：纳米粒子、聚（乳酸-羟基乙酸）共聚物（PLGA)微 球体、类脂质、脂质复合物、脂质体、聚合物、碳水化合物（包括单糖）、阳离子脂质、纤维蛋 白凝胶、纤维蛋白水凝胶、纤维蛋白胶、纤维蛋白密封剂、纤维蛋白原、凝血酶、快速消除型 脂质纳米粒子（reLNP)和其组合。所述药理学作用可以大于与已知可产生所述药理学作用 的治疗剂和/或组合物相关的药理学作用。所述组合物可以包含经配制的或未经配制的经 修饰的mRNA。所述药理学作用可以对疾病、病症、病状或感染产生在治疗上有效的结果。所 述在治疗上有效的结果可以包括但不限于治疗、改善一种或多种症状、诊断、预防和延迟发 作。所述药理学作用可以包括但不限于细胞计数变化、血清化学性质变化、酶活性变化、血 红蛋白增加和红细胞压积增加。
[0025] 在一个实施方案中，本公开提供了一种制剂组合物，其包含经修饰的核酸分子和 递送剂。所述经修饰的核酸分子可以选自DNA、互补DNA (cDNA)、RNA、信使RNA (mRNA)、RNAi 诱导剂、RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核糖酶、催化DNA、诱导三螺旋形成的RNA、 适体、载体和其组合。如果所述经修饰的核酸分子是mRNA，则所述mRNA可以来源于cDNA。
[0026] 在一个实施方案中，所述经修饰的核酸分子可以包含至少一个修饰和一个可翻译 区。在一些情况下，所述经修饰的核酸包含至少两个修饰和一个可翻译区。所述修饰可以 位于所述核酸分子的骨架和/或核苷上。所述修饰可以位于核苷与骨架键二者上。
[0027] 在一个实施方案中，修饰可以位于所述经修饰的核酸分子的骨架键上。所述骨架 键可以通过置换一个或多个氧原子而加以修饰。对所述骨架键的修饰可以包括用硫代磷酸 酯键置换至少一个磷酸二酯键。
[0028] 在一个实施方案中，修饰可以位于所述经修饰的核酸分子的核苷上。核苷上的修 饰可以位于所述核苷的糖上。对核苷的修饰可以在核苷上的2'位置发生。
[0029] 所述核苷修饰可以包括选自以下的化合物：吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、 2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、 3-甲基尿苷、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假 尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺 酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫 代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿 苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫 代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲 基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、1-甲基-假 异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫 代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲 基-1-脱氮-假异胞苷、扎布拉林（zebularine)、5_氮杂-扎布拉林、5-甲基-扎布拉林、 5-氮杂-2-硫代-扎布拉林、2-硫代-扎布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞 苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2, 6-二氨基嘌呤、 脱氮-腺噪呤、7-脱氮_8_氮杂-腺噪呤、7-脱氮_2_氨基噪呤、7-脱氮_8_氮杂_2_氨 基嘌呤、7-脱氮-2, 6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2, 6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲 基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基）腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异 戊烯基）腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、2-甲基硫代-N6-苏氨 酰氨基甲酰腺苷、N6, N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、2-甲氧基-腺 嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫 代 -鸟苷、硫代-7_脱氮-鸟苷、6-硫代_7_脱氮_8_氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫 代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2，N2-二甲 基鸟苷、8_氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫 代-鸟苷和N2, N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。在另一个实施方案中，所述修饰是独立地选自 5_甲基胞嘧啶、假尿苷和1-甲基假尿苷。
[0030] 在一个实施方案中，修饰可以位于所述经修饰的核酸分子的核碱基上。核碱基上 的修饰可以选自胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核碱基上的修饰可以选自脱 氮-腺苷和脱氮-鸟苷，且连接子可以连接在所述脱氮-腺苷或脱氮-鸟苷的C-7或C-8 位置。经修饰的核碱基可以选自胞嘧啶和尿嘧啶，且连接子可以在N-3或C-5位置连接到 经修饰的核碱基。连接到核碱基的连接子可以选自二乙二醇、二丙二醇、三乙二醇、三丙二 醇、四乙二醇、四乙二醇、二价烷基、烯基、炔基部分、酯、酰胺和醚部分。
[0031] 在一个实施方案中，核酸分子的两个修饰可以位于所述经修饰的核酸分子的核苷 上。经修饰的核苷可以选自5-甲基胞嘧啶和假尿苷。
[0032] 在一个实施方案中，经修饰的核酸分子的两个修饰可以位于核苷酸或核苷上。在 一个实施方案中，本公开提供了一种制剂，其包含如但不限于SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、 SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10等核酸分子和递送剂。所述核酸分子可以包含长度为约160 个核苷酸的多聚腺苷酸尾。此外，所述核酸分子可以包含至少一个5'末端帽，如但不限于 0&卩0、0&口1、41^^、肌昔、1^1-甲基-鸟昔、2'-氣-鸟昔、7-脱氣-鸟昔、8-氧代-鸟昔、2-氛 基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
[0033] 在一个实施方案中，本公开提供了具有SEQ ID N0:6的核酸、5'末端帽Capl、长度 为约160个核苷酸的多聚腺苷酸尾和递送剂。
[0034] 在一个实施方案中，本公开提供了具有SEQ ID N0:7的核酸、5'末端帽Capl、长度 为约160个核苷酸的多聚腺苷酸尾和递送剂。
[0035] 在一个实施方案中，本公开提供了具有SEQ ID N0:9的核酸、5'末端帽Capl、长度 为约160个核苷酸的多聚腺苷酸尾和递送剂。
[0036] 在一个实施方案中，本公开提供了具有SEQ ID N0:10的核酸、5'末端帽Capl、长 度为约160个核苷酸的多聚腺苷酸尾和递送剂。
[0037] 在一个实施方案中，所述递送剂包含至少一种用以改良选自以下各项的递送的方 法：类脂质、脂质体、脂质纳米粒子、快速消除型脂质纳米粒子（reLNP)、聚合物、脂质复合 物、肽、蛋白质、水凝胶、密封剂、化学修饰、缀合、细胞和增强子。可以用作递送剂的类脂质、 脂质纳米粒子和快速消除型脂质纳米粒子可以包括可能选自以下各项的脂质：C12_200、 MDl、98N12-5、DLin-DMA、DLin-K-DMA、DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、 聚乙二醇化脂质和其类似物。快速消除型脂质纳米粒子可以在脂质链末端具有酯键，或酯 键可以是位于脂质链中的饱和碳的右侧或左侧的内部键。可以用作递送剂的快速消除型脂 质纳米粒子可以是但不限于DLin-MC3-DMA和DLin-DMA。
[0038] 在一个实施方案中，脂质纳米粒子可以包含PEG和至少一种如但不限于胆固醇、 阳离子脂质和促融合脂质等组分。
[0039] 在一个实施方案中，脂质纳米粒子可以包含PEG、胆固醇、阳离子脂质和促融合脂 质中的至少一者。
[0040] 在一个实施方案中，促融合脂质是二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC)。在另一个实施方 案中，PEG脂质是PEG-DMG。在又一个实施方案中，阳离子脂质可以是但不限于DLin-DMA、 DLin-MC3-DMA、C12-200、98N12-5 和 DLin-KC2-DMA。
[0041] 在一个实施方案中，脂质纳米粒子组合物可以包含50摩尔％阳离子脂质、10摩 尔％ DSPC、1. 5摩尔％到3. 0摩尔％ PEG和37摩尔％到38. 5摩尔％胆固醇。
[0042] 在一个实施方案中，经修饰的核酸可以与PLGA -起配制以形成持续释放制剂。在 另一个实施方案中，经修饰的核酸可以与PLGA和其它活性和/或非活性组分一起配制以形 成持续释放制剂。在一个实施方案中，经修饰的核酸分子可以包括但不限于SEQ ID N0:9 和 SEQ ID NO:10。
[0043] 在一个实施方案中，持续释放制剂可以包含持续释放微球体。所述持续释放微球 体的直径可以为约10到约50um。在另一个实施方案中，所述持续释放微球体可以含有约 0. 001重量％到约1. 0重量％的至少一种经修饰的核酸分子。
[0044] 在一个实施方案中，本发明的经修饰的核酸可以在3'未翻译区（UTR)之前包括至 少一个终止密码子。所述终止密码子可以选自TGA、TAA和TAG。在一个实施方案中，本发 明的经修饰的核酸包括终止密码子TGA和一个额外的终止密码子。在另一个实施方案中， 所述额外的终止密码子可以是TAA。在另一个实施方案中，本发明的经修饰的核酸包括三个 终止密码子。
[0045] 在一个实施方案中，本公开提供了一种控制释放制剂，其包含可以编码目的多肽 的经修饰的核酸。所述经修饰的核酸可以囊封或基本上囊封在递送剂中。所述递送剂可以 涂布有、覆盖有、环绕有、封围有和/或包含一层聚合物、水凝胶和/或外科用密封剂。在另 一个实施方案中，所述控制释放制剂可以包含第二层聚合物、水凝胶和/或外科用密封剂。
[0046] 在一个实施方案中，所述控制释放制剂的递送剂可以包括但不限于类脂质、脂质 体、脂质纳米粒子、快速消除型脂质纳米粒子、脂质复合物和自组装脂质纳米粒子。
[0047] 可用于控制释放制剂中的聚合物可以包括但不限于PLGA、乙烯/乙酸乙烯酯共聚 物、泊洛沙姆和GELSITE?。可用于控制释放制剂中的外科用密封剂可以包括但不限于纤 维蛋白原聚合物、TISSEELL?、基于PEG的密封剂和COSEAL?。
[0048] 在一个实施方案中，控制释放制剂的递送剂包含脂质纳米粒子或快速消除型脂质 纳米粒子递送剂。在一个方面，脂质纳米粒子或快速消除型脂质纳米粒子可以涂布有、基本 上涂布有、覆盖有、基本上覆盖有、环绕有、基本上环绕有、封围有、基本上封围有和/或包 含一层聚合物、水凝胶和/或外科用密封剂。在另一个方面，所述递送剂可以是脂质纳米粒 子，其可以涂布有、基本上涂布有、覆盖有、基本上覆盖有、环绕有、基本上环绕有、封围有、 基本上封围有和/或包含一层PLGA。
[0049] 附图简述
[0050] 前述和其它目标、特征和优点将从以下对本发明的特定实施方案的描述中显而易 见，如附图中所说明，其中在所有不同的视图中，同样的参考标号是指相同部分。这些图未 必按比例绘制，而是将重点放在说明本发明的各个实施方案的原则上。
[0051] 图1说明可用于本发明的现有技术的脂质结构。显示了 98N12-5(TETA5-LAP)、 DLin-DMA、DLin-K-DMA(2, 2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环）、 DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA 和 C12-200 的结构。
[0052] 图2是可用于本文中所教示的IVT反应中的代表性质粒。所述质粒含有由本发明 的发明人设计的插入序列64818。
[0053] 图3是囊封在PLGA微球体中的经修饰的mRNA的凝胶谱。
[0054] 发明详述
[0055] 将核酸递送到细胞中会有许多不希望有的复杂状况，包括将核酸整合到靶细胞基 因组中可能导致表达水平不精确、核酸不利地被转移到后代和相邻细胞中，和有相当大的 造成突变的风险。本公开的经修饰的核酸分子能够降低引入了所述经修饰的核酸分子的细 胞群体的固有免疫活性，因而提高该细胞群体中的蛋白质产生效率。此外，本文中描述了本 公开的核酸和蛋白质的一种或多种额外有利的活性和/或性质。
[0056] 另外，本文中提供了治疗患有或疑似患有某种疾病、病症和/或病状的受试者的 方法，所述方法包括以足以治疗所述疾病、病症和/或病状的量向需要所述治疗的受试者 施用本文中所描述的组合物。
[0057] 除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语的含义都与本发明所属 领域的技术人员通常所理解的含义相同。尽管与本文中所描述的方法和材料类似或等效的 方法和材料可以用于实施或测试本发明的特征性方法，但下文描述合适的方法和材料。
[0058] 经修饰的核酸分子
[0059] 本公开提供了如本文中所描述的核酸，包括RNA，如mRNA，其含有一个或多个经修 饰的核苷或核苷酸（称为"经修饰的核酸分子"、"经修饰的mRNA"或"经修饰的mRNA分子")。 对本发明的核酸分子的修饰可以具有有用的性质，包括但不限于引入了经修饰的mRNA的 细胞中的固有免疫反应显著减小或对其缺乏实质性诱导。与未经修饰的核酸分子相比，经 修饰的核酸分子还可以展现升高的蛋白质产生效率、核酸的细胞内滞留和所接触细胞的活 力，以及具有降低的免疫原性。
[0060] 提供了含有一个可翻译区和一个、两个或多于两个不同的核苷修饰的经修饰的核 酸分子。用于本公开的示例性核酸包括核糖核酸（RNA)、脱氧核糖核酸（DNA)、苏糖核酸 (TNA)、二醇核酸（GNA)、锁核酸（LNA)或其杂交物。在优选实施方案中，经修饰的核酸分子 包括信使RNA (mRNA)。如本文中所描述，本公开的经修饰核酸分子可能基本上不会诱导引入 了所述经修饰的mRNA的细胞的固有免疫反应。在另一个实施方案中，与未经修饰的核酸相 t匕，经修饰的核酸分子可以在引入了所述经修饰的核酸分子的细胞中展现减少的降解。
[0061] 术语"核酸"包括已并入或可以并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。根 据本公开使用的示例性核酸包括但不限于以下中的一项或多项：DNA、cDNA、RNA(包括信使 RNA(mRNA))、其杂交物、RNAi诱导剂、RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核糖酶、催化 DNA、诱导三螺旋形成的RNA、适体、载体等等。
[0062] 在某些实施方案中，需要使引入到细胞中的经修饰的核酸分子在细胞内降解。举 例来说，如果需要蛋白质产生的精确定时，则将会需要使经修饰的核酸分子降解。因而，本 公开提供了一种含有降解域的经修饰的核酸分子，其能够在细胞内以定向方式受作用。
[0063] 在一些实施方案中，经修饰的核酸分子可以在糖、核碱基（例如在核碱基的5'位 置）或磷酸酯骨架（例如用另一个部分，如硫代磷酸酯置换磷酸酯）上被化学修饰。在一 些实施方案中，所述修饰可能会破环大沟-结合伴侣相互作用，这可能会促成固有的免疫 反应。在一些实施方案中，相对于施用经修饰的核酸分子而不并入递送剂，所述制剂组合 物在施用到受试者时可以改良经修饰的核酸分子的生物利用率、治疗窗或分布体积。在 一些实施方案中，本发明的经修饰核酸分子的经修饰核苷和核苷酸可以使用国际公布号 W02012138530中所描述的0-经保护的化合物来合成，所述国际公布的内容是以全文引用 的方式并入本文中。
[0064] 在某些实施方案中，经修饰的核酸分子可以包含mRNA。在特定的实施方案中，经修 饰的mRNA(_RNA)可能来源于cDNA。在某些实施方案中，_RNA可以包含至少两个核苷修 饰。在一个实施方案中，所述核苷修饰可以选自5-甲基胞啼陡和假尿苷。在另一个实施方 案中，所述核苷修饰中至少一个不是5-甲基胞嘧啶和/或假尿苷。在某些实施方案中，递 送剂可以包含允许_RNA的局部化和全身性递送的制剂。经修饰的核酸分子和/或_RNA 的制剂可以选自但不限于类脂质、脂质体和脂质纳米粒子、快速消除型脂质纳米粒子、聚合 物、脂质复合物、肽和蛋白质、至少一个化学修饰和缀合、增强子和/或细胞。
[0065] 在一个实施方案中，本发明的经修饰的核酸分子可以在3'未翻译区（UTR)之前包 括至少两个终止密码子。所述终止密码子可以选自TGA、TAA和TAG。在一个实施方案中， 本发明的核酸包括终止密码子TGA和一个额外的终止密码子。在另一个实施方案中，所述 额外的终止密码子可以是TAA。在另一个实施方案中，经修饰的核酸分子可以包含三个终止 密码子。
[0066] 在经修饰的核酸分子中，核酸的其它组分是任选的，但在一些实施方案中，这些组 分可能是有益的。
[0067] 未翻译区（UTR)
[0068] 基因的未翻译区（UTR)经过转录而未经翻译。5'UTR开始于转录开始位点且延续 到起始密码子，但不包括起始密码子；而3' UTR在终止密码子之后立即开始且一直延续到 转录终止信号为止。关于UTR在核酸分子的稳定性和翻译方面所起的调控作用存在越来越 多的证据。UTR的调控特征可以并入到本发明的经修饰mRNA分子中以增强所述分子的稳定 性。还可以并入特定的特征以便确保转录物在其被误导到不希望的器官部位的情况下的受 控下调。
[0069] 5' UTR和翻译起始
[0070] 天然5'UTR具有在翻译起始时起作用的特征。它们拥有如Kozak序列等特征序列， 通常已知这些特征序列与核糖体起始许多基因的翻译所经历的过程有关。Kozak序列具有 一致CCR(A/G)CCAUGG(SEQ ID N0:1)，其中R是距起始密码子（AUG)上游三个碱基的嘌呤 (腺嘌呤或鸟嘌呤），其后为另一个'G'。还已知5' UTR形成了与延长因子结合有关的二级 结构。
[0071] 通过对典型地在特定靶器官的丰富表达的基因中发现的特征进行工程改造，我们 可以增强本发明的经修饰mRNA分子的稳定性和蛋白质产量。举例来说，引入肝脏表达的 mRNA(如白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、α胎儿蛋白、促红细胞生成 素或因子VIII)的5'UTR可以用来增强经修饰的核酸分子（如_RNA)在肝细胞系或肝脏 中的表达。同样，对于肌肉（MyoD、肌球蛋白、肌红蛋白、肌细胞生成素、生肌调节因子）、内 皮细胞（Tie-1、CD36)、骨髓细胞（C/EBP、AML1、G-CSF、GM-CSF、CDllb、MSR、Fr-1、i-NOS)、 白细胞（〇)45、〇)18)、脂肪组织（〇)36、61^^'4、4〇^30、脂联素）和肺上皮细胞（5?4/%/(：/ D)来说，使用来自于其它组织特异性mRNA的5' UTR来改良在该组织中的表达是有可能的。
[0072] 其它非UTR序列可以并入到本发明的经修饰核酸分子的5'UTR(或3'UTR)中。举 例来说，内含子或部分内含子序列可以并入到本发明的经修饰mRNA的侧翼区。并入内含子 序列可以增加蛋白质产量以及mRNA水平。
[0073] 3' UTR和富含AU的元件
[0074] 已知3' UTR中嵌入有腺苷㈧和尿苷⑶延伸段。这些富含AU的特征在高转换率 基因中特别普及。基于其序列特征和功能性质，富含AU的元件（ARE)可以分成三类（Chen 等，1995):第I类ARE在富U区内含有AUUUA基序的若干个分散的拷贝。C-Myc和MyoD含 有第I类ARE。第II类ARE具有两个或更多个重叠 UUAUUUA(U/A) (U/A) (SEQ ID N0:2)九 聚物。含有这种类型的ARE的分子包括GM-CSF和TNF-a。第III类ARE的定义不那么明 确。这些富U区不含AUUUA基序。c-Jun和肌细胞生成素是这个类别中已得到充分研究的 两个实例。已知与ARE结合的大部分蛋白质会使得信使不稳定，而已经记录ELAV家族的成 员（最值得注意的是HuR)会增加 mRNA的稳定性。HuR结合所有三类ARE。将HuR特异性 结合位点工程改造到核酸分子的3'UTR中将引起HuR结合，且因而体内稳定信息。
[0075] 3'UTR富AU元件（ARE)的引入、去除或修饰可以用于调节本发明的经修饰的mRNA 的稳定性。当工程改造特定经修饰的mRNA时，可以引入ARE的一个或多个拷贝以使本发明 的经修饰的mRNA不太稳定，且从而缩减翻译并且降低所得蛋白质的产量。
[0076] 同样，可以鉴别ARE并将其去除或使其突变以增加细胞内稳定性且因而增加翻译 和所得蛋白质的产量。转染实验可以在相关细胞系中使用本发明的经修饰的mRNA来进行， 且可以在转染后在不同的时间点测定蛋白质产量。举例来说，可以利用不同的ARE工程改 造分子且通过针对相关蛋白质使用ELISA试剂盒来转染细胞，且在转染后6小时、12小时、 24小时、48小时和7天测定所产生的蛋白质。
[0077] 并入微RNA结合位点
[0078] 微RNA (或miRNA)是19到25个核苷酸长的非编码RNA，其结合核酸分子的3' UTR 且通过降低核酸分子稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。本发明的经修饰的mRNA可 以包含一个或多个微RNA靶序列、微RNA序列或微RNA种子。所述序列可能对应于任何已 知的微RNA，如美国公布US2005/0261218和美国公布US2005/0059005中所教示的那些，所 述美国公布的内容是以全文引用的方式并入本文中。
[0079] 微RNA序列包含"种子"区，即，成熟微RNA的位置2到8的区域中的序列，所述序 列与miRNA靶序列具有完美的Watson-Crick互补性。微RNA种子可以包括成熟微RNA的位 置2到8或2到7。在一些实施方案中，微RNA种子可以包含7个核苷酸（例如成熟微RNA 的核苷酸2到8)，其中对应miRNA靶的种子互补位点是通过与微RNA位置1相对的腺嘌呤 (A)侧接。在一些实施方案中，微RNA种子可以包含6个核苷酸（例如成熟微RNA的核苷酸 2到7)，其中对应miRNA靶的种子互补位点是通过与微RNA位置1相对的腺嘌呤（A)侧接。 参见例如 Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP ;Mol Cell. 2007年7月6日；27(1) :91-105 ;各自以全文引用的方式并入本文中。微RNA种子的 碱基与靶序列具有完全互补性。通过将微RNA靶序列工程改造到本发明的经修饰的mRNA 的3' UTR中，我们可以靶向所述分子以便降解或减少翻译，前提条件是所讨论的微RNA是可 利用的。这一过程将降低在递送核酸分子时发生脱靶效应的危险性。已经报道了微RNA、微 RNA祀区及其表达模式和在生物学中的作用的鉴别（Bonauer等，Curr Drug Targets2010 11:943-949 ;Anand 和 Cheresh Curr Opin Hematol2011 18:171-176 ;Contreras 和 Rao Leukemia2012 26:404-413(2011 年 12 月 20 日.doi:10.1038/leu. 2011.356) ;Bartel Cell2009 136:215-233 ;Landgraf 等，Cell, 2007 129:1401-1414 ;各自以全文引用的方式 并入本文中）。
[0080] 举例来说，如果经修饰的核酸分子是经修饰的mRNA且并不意在递送到肝脏但最 终到达那里，则miR-122, 一种在肝脏中非常丰富的微RNA，可以在miR-122的一个或多个靶 位点被工程改造到经修饰的mRNA的3' UTR中的情况下抑制相关基因的表达。可以进行工 程改造以针对不同的微RNA引入一个或多个结合位点，以便进一步降低经修饰的核酸分子 和/或经修饰的mRNA的寿命、稳定性和蛋白质翻译。
[0081] 如本文中所使用，术语"微RNA位点"是指微RNA靶位点或微RNA识别位点，或者微 RNA所结合或缔合的任何核苷酸序列。应了解，"结合"可以遵循传统的Watson-Crick杂交 规则，或可以体现微RNA与微RNA位点处或与微RNA位点相邻的靶序列的任何稳定的缔合。
[0082] 反之，出于本发明的经修饰的mRNA的目的，微RNA结合位点可以工程改造到其天 然存在的序列以外（即，从中去除），以便增加特定组织中的蛋白质表达。举例来说，可以移 除miR-122结合位点以改良肝脏中的蛋白质表达。多个组织中的表达的调控可以通过引入 或去除一个或若干个微RNA结合位点来实现。
[0083] 已知微RNA调控mRNA且从而调控蛋白质表达的组织的实例包括但不限于：肝脏 (miR-122)、肌肉（miR-133、miR-206、miR-208)、内皮细胞（miR-17-92、miR-126)、髓样细胞 (miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪组织（let-7、 miR-30c)、心脏（miR-ld、miR-149)、肾（miR-192、miR-194、miR-204)和肺上皮细胞（let-7、 miR-133、miR-126)。微RNA还可以调控复杂的生物学过程，如血管生成（miR-132)(Anand 和Cheresh Curr Opin Hematol2011 18:171-176;以全文引用的方式并入本文中）。在本 发明的经修饰的mRNA中，可以去除或引入与所述过程有关的微RNA的结合位点以便针对生 物学上相关的细胞类型或针对相关生物学过程的情形定制经修饰的mRNA的表达。
[0084] 最后，通过对微RNA在不同的细胞类型中的表达模式的理解，可以对经修饰的 mRNA进行工程改造以便在特定细胞类型中或仅在特定生物学条件下更具靶向性地表达。通 过引入组织特异性微RNA结合位点，可以设计将会对于某一组织中或生物学条件情形下的 蛋白质表达来说最佳的经修饰的mRNA。
[0085] 转染实验可以使用经工程改造的经修饰的mRNA在相关细胞系中进行，且可以在 转染后在不同的时间点测定蛋白质产量。举例来说，可以利用不同的微RNA结合位点工程 改造修饰的mRNA且通过针对相关蛋白质使用ELISA试剂盒来转染细胞，且在转染后6小 时、12小时、24小时、48小时、72小时和7天测定所产生的蛋白质。还可以使用微RNA结合 位点工程改造化的分子进行体内实验，以检查经配制的经修饰mRNA的组织特异性表达的 变化。
[0086] 5' 加帽
[0087] mRNA的5'帽结构参与核输出，从而增加 mRNA稳定性，并且结合mRNA帽结合蛋白 (CBP)，所述mRNA CBP通过CBP与poly (A)结合蛋白缔合以形成成熟环状mRNA物质来负责 细胞中的mRNA稳定性和翻译能力。所述帽还有助于在mRNA剪接期间去除5'近端内含子。
[0088] 内源性mRNA分子可以经过5'端加帽，从而在所述mRNA分子的末端鸟苷帽残基与 5'末端转录有义核苷酸之间产生5'-ppp-5'-三磷酸酯键。然后，这一 5'鸟苷酸帽可以被 甲基化以产生N7-甲基-鸟苷酸残基。mRNA的5'端的末端和/或前端转录的核苷酸的核 糖还可以任选地被2'-0-甲基化。通过鸟苷酸帽结构的水解和裂解进行的5'脱帽可以靶 向核酸分子（如mRNA分子）以便降解。
[0089] 对本发明的经修饰mRNA的修饰可以产生不可水解的帽结构，从而防止脱帽且因 而增加 mRNA半衰期。因为帽结构水解需要使5'-ppp-5'磷酸二酯键裂解，所以在加帽反应 期间可以使用经修饰的核苷酸。举例来说，得自于New England Biolabs (Ipswich，MA)的牛 痘病毒加帽酶可以根据制造商说明书与α -硫代-鸟苷核苷酸一起使用，以便在5' -ppp-5' 帽中建立硫代磷酸酯键。可以使用其它经修饰的鸟苷核苷酸，如α-甲基-膦酸和硒代磷 酸核苷酸。
[0090] 其它修饰包括但不限于在糖环的2' -羟基上对mRNA的5'末端和/或5'前端核 苷酸的核糖进行2'-0-甲基化。可以使用多个独特的5'帽结构来产生核酸分子（如mRNA 分子）的5'帽。
[0091] 帽类似物，在本文中也称为合成帽类似物、化学帽、化学帽类似物或者结构或功能 帽类似物，在其化学结构上不同于天然（即，内源性、野生型或生理性）5'帽，不过保留了帽 功能。帽类似物可以用化学方式（即，非酶方式）或酶方式合成，和/或连接到核酸分子。
[0092] 举例来说，抗-反向帽类似物（ARCA)帽含有由5'_5'_三磷酸酯基连接的两个鸟 嘌呤，其中一个鸟嘌呤含有N7甲基以及3'-0-甲基（S卩，N7, 3'-0-二甲基-鸟苷-5'-三磷 酸酯-5'-鸟苷〇1^-3'111--?-6);其可以等效地称为3'0, 61176(5'）？?？(5'）6)。另一个未 经修饰的鸟嘌呤的3' -0原子连接到经加帽的核酸分子（例如mRNA或mmRNA)的5'末端核 苷酸。N7-甲基化和3' -0-甲基化鸟嘌呤提供了经加帽的核酸分子（例如mRNA或_RNA) 的末端部分。
[0093] 另一个示例性帽为mCAP，其类似于ARCA但在鸟苷上具有2'-0-甲基（即， N7, 2' -0-二甲基-鸟苷-5' -三磷酸酯-5' -鸟苷，m7Gm-ppp-G)。
[0094] 尽管帽类似物允许核酸分子在体外转录反应中的伴随性加帽，但多达20%的转录 物可能仍然未被加帽。此现象以及由内源性细胞转录机制产生的帽类似物与核酸内源性5' 帽结构的结构差异可能导致翻译能力下降和细胞稳定性下降。
[0095] 本发明的经修饰的mRNA还可以在转录后使用酶进行加帽，以便产生更逼真的5' 帽结构。如本文中所使用，短语"更逼真的"是指某一特征在结构上或功能上很能反映或模 拟内源性或野生型特征。也就是说，与现有技术的合成特征或类似物等相比，"更逼真的"特 征更好地代表了内源性、野生型、天然的或生理的细胞功能和/或结构，或在一个或多个方 面的性能优于相应的内源性、野生型、天然的或生理的特征。本发明的更逼真的5'帽结构 的非限制性实例为与本领域中已知的合成5'帽结构（或野生型、天然的或生理的5'帽结 构）相比尤其具有增强的帽结合蛋白结合、增加的半衰期、降低的5'核酸内切酶敏感性和/ 或减少的5'脱帽现象的5'帽结构。举例来说，重组牛痘病毒加帽酶和重组2'-0-甲基转移 酶可以在mRNA的5'末端核苷酸与鸟嘌呤帽核苷酸之间建立典型的5' -5' -三磷酸酯键，其 中所述帽鸟嘌呤含有N7甲基化且所述mRNA的5'末端核苷酸含有2'-0-甲基。所述结构称 为Capl结构。这种帽产生较高翻译能力和细胞稳定性且减少细胞促炎性细胞因子的活化， 例如与本领域中已知的其它5'帽类似物结构相比。帽结构包括但不限于7mG(5'）ppp(5'） N，pN2p(capO)、7mG(5,）ppp(5,）NlmpNp(capl)和 7mG(5,）-ppp(5,）NlmpN2mp(cap2)。
[0096] 因为经修饰的mRNA可以在转录后被加帽，且因为这个过程更有效，所以可以将几 乎100%的经修饰mRNA加帽。这与当帽类似物在体外转录反应过程中连接到mRNA时的约 80 %形成对照。
[0097] 根据本发明，5'末端帽可以包括内源性帽或帽类似物。根据本发明，5'末端帽可 以包含鸟嘌呤类似物。可用的鸟嘌呤类似物包括但不限于肌苷、N1-甲基-鸟苷、2' -氟-鸟 苷、脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
[0098] 病毒序列
[0099] 其它病毒序列，如但不限于大麦黄矮病病毒（BYDV-PAV)的翻译增强子序列，可以 经工程改造并插入本发明的经修饰的mRNA的3'UTR中，并且可以在体外和体内刺激所述 mRNA的翻译。可以在相关细胞系中进行转染实验，且在转染后12小时、24小时、48小时、72 小时和第7天，可以利用ELISA测定蛋白质产量。
[0100] IRES 序列
[0101] 此外，提供了可能含有内部核糖体进入位点（IRES)的经修饰的mRNA。IRES最初 被鉴别为细小的核糖核酸病毒RNA的特征，它在不存在5'帽结构的情况下引发蛋白质合成 方面起重要作用。IRES可以充当唯一核糖体结合位点，或可以充当mRNA的多个核糖体结合 位点之一。含有超过一个功能性核糖体结合位点的经修饰的mRNA可以编码若干种由核糖 体独立地翻译的肽或多肽（"多顺反子核酸分子")。当经修饰的mRNA具备有IRES时，还任 选地提供第二可翻译区。可根据本发明使用的IRES序列的实例包括但不限于得自于小核 糖核酸病毒（例如FMDV)、害虫病毒（CFFV)、脊髓灰质炎病毒（PV)、脑心脊炎病毒（ECMV)、 口蹄疫病毒（FMDV)、丙型肝炎病毒（HCV)、经典猪瘟病毒（CSFV)、鼠类白血病病毒（MLV)、猴 免疫缺陷病毒（SIV)或蟋蟀麻痹病毒（CrPV)的IRES序列。
[0102] 多聚腺苷酸尾
[0103] 在RNA加工期间，可以将腺嘌呤核苷酸的长链（多聚腺苷酸尾）加入到经修饰的 核酸分子（如经修饰的mRNA分子）中以便增加稳定性。在转录后可以立即裂解转录物的 3'端以释放3'羟基。然后多聚腺苷酸聚合酶将腺嘌呤核苷酸链加入到RNA中。所述过程 称为聚腺苷酸化，加入了多聚腺苷酸尾，所述多聚腺苷酸尾的长度可以介于例如约100与 250个残基之间。
[0104] 已经发现，独特的多聚腺苷酸尾长度为本发明的经修饰的mRNA提供了某些优点。
[0105] 一般来说，本发明的多聚腺苷酸尾的长度多于30个核苷酸。在另一个实施方案 中，多聚腺苷酸尾的长度多于35个核苷酸（例如至少或多于约35、40、45、50、55、60、70、 80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1，000、 1，100、1，200、1，300、1，400、1，500、1，600、1，700、1，800、1，900、2, 000、2, 500 和 3, 000 个核 苷酸）。在一些实施方案中，经修饰的mRNA包括约30到约3, 000个核苷酸（例如30到 50、30 到 100、30 到 250、30 到 500、30 到 750、30 到 1，000、30 到 1，500、30 到 2, 000、30 到 2, 500、50 到 100、50 到 250、50 到 500、50 到 750、50 到 1，000、50 到 1，500、50 到 2, 000、50 到 2, 500、50 到 3, 000、100 到 500、100 到 750、100 到 1，000、100 到 1，500、100 到 2, 000、100 到 2, 500、100 到 3, 000、500 到 750、500 到 1，000、500 到 1，500、500 到 2, 000、500 到 2, 500、500 至IJ 3, 000、1，000 到 1，500、1，000 到 2, 000、1，000 到 2, 500、1，000 到 3, 000、1，500 到 2, 000、 1，500 到 2, 500、1，500 到 3, 000、2, 000 到 3, 000、2, 000 到 2, 500 和 2, 500 到 3, 000)。
[0106] 在一个实施方案中，相对于整个经修饰的mRNA的长度设计多聚腺苷酸尾。这一设 计可以基于编码区的长度、特定特征或区域（如侧翼区）的长度或基于由经修饰的mRNA表 达的最终产物的长度。
[0107] 在这种情形下，多聚腺苷酸尾的长度可能比经修饰的mRNA、其区域或特征的大 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。多聚腺苷酸尾还可以设计为 其所属经修饰mRNA的一部分。在这种情形下，多聚腺苷酸尾可以是所述分子的总长度或所 述分子减去所述多聚腺苷酸尾后的总长度的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% 或90 %或更多。此外，经工程改造的结合位点和经修饰的mRNA与多聚腺苷酸结合蛋白的缀 合可以增强表达。
[0108] 另外，多个不同的经修饰的mRNA可以使用经修饰的核苷酸在多聚腺苷酸尾的3' 末端经由3'端一起连接到PABP(多聚腺苷酸结合蛋白）。可以在相关细胞系中进行转染实 验，且在转染后12小时、24小时、48小时、72小时和第7天，可以利用ELISA测定蛋白质产 量。
[0109] 在一个实施方案中，对本发明的经修饰的mRNA进行设计而包括polyA-G四联体。G 四联体是四个鸟嘌呤核苷酸的环状氢键键结阵列，其可以由DNA和RNA中的富G序列形成。 在这个实施方案中，G四联体被并入多聚腺苷酸尾的末端。在不同的时间点测定所得_RNA 分子的稳定性、蛋白质产量和其它参数，包括半衰期。已经发现，P〇lyA-G四联体使得蛋白质 产量相当于单独使用具有120个核苷酸的多聚腺苷酸尾时所见的蛋白质产量的至少75%。
[0110] 修饰
[0111] 本发明的经修饰的核酸和经修饰的mRNA(_RNA)可以含有一个、两个或更多个不 同的修饰。在一些实施方案中，经修饰的核酸和_RNA可以含有一个、两个或更多个不同的 核苷或核苷酸修饰。在一些实施方案中，引入到细胞中的经修饰的核酸或mmRNA (例如具有 一个或多个_RNA分子）与未经修饰的核酸或_RNA相比可以在所述细胞中展现减少的降 解。
[0112] 经修饰的核酸和_RNA可以包括任何可用的修饰，如对糖、核碱基（例如对核碱基 的一个或多个修饰，如通过用任选地经取代的氨基、任选地经取代的硫醇基、任选地经取代 的烷基（例如甲基或乙基）或卤基（例如氯基或氟基）置换或取代嘧啶核碱基的原子）或 核苷间键（例如对磷酸二酯骨架的一个或多个修饰）的修饰。在某些实施方案中，修饰存 在于糖与核苷间键二者中（例如一个或多个修饰，如存在于核糖核酸（RNA)、脱氧核糖核酸 (DNA)、苏糖核酸（TNA)、二醇核酸（GNA)、肽核酸（PNA)、锁核酸（LNA)或其杂交物中）。本 文中描述了其它修饰。
[0113] 如本文中所描述，本发明的经修饰的核酸和mmRNA基本上不会诱导引入了所述 mRNA的细胞的固有免疫反应。在某些实施方案中，可能需要使引入到所述细胞中的经修饰 的核酸分子或经修饰的核酸分子在细胞内降解。举例来说，如果需要蛋白质产生的精确定 时，则可能优选使经修饰的核酸分子或经修饰的mRNA降解。因而，在一些实施方案中，本发 明提供了一种含有降解域的经修饰的核酸分子，其能够在细胞内以定向方式受作用。在另 一个方面，本公开提供了包含可以破坏大沟相互作用（例如结合）伴侣与核酸的结合（例 如在与未经修饰的核苷酸相比，经修饰的核苷酸与大沟相互作用伴侣的结合亲和力有所降 低的情况下）的核苷或核苷酸的核酸。
[0114] 经修饰的核酸和_RNA可以任选地包括其它试剂（例如RNAi诱导剂、RNAi剂、 siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核糖酶、催化性DNA、tRNA、诱导三螺旋形成的RNA、适体、载 体等）。在一些实施方案中，经修饰的核酸或_RNA可以包括一种或多种信使RNA (mRNA)和 一种或多种经修饰的核苷或核苷酸（例如mmRNA分子）。这些经修饰的核酸和_RNA的详 情如下。
[0115] 经修饰的核酸
[0116] 本发明的经修饰的核酸或_RNA可以包括编码目的多肽的连接核苷的第一区、位 于所述第一区的5'末端的第一侧翼区和位于所述第一区的3'末端的第二侧翼区。
[0117] 在一些实施方案中，经修饰的核酸或_RNA包括η个具有式（la)或式（Ia-Ι)的 连接核苷：
[0118]
【权利要求】
1. 一种在哺乳动物细胞或组织中产生目的多肽的方法，所述方法包括使所述哺乳动物 细胞或组织与包含编码所述目的多肽的经修饰的mRNA的制剂接触，其中所述制剂是选自： 纳米粒子、聚（乳酸-羟基乙酸）共聚物（PLGA)微球体、类脂质、脂质复合物、脂质体、聚合 物、碳水化合物（包括单糖）、阳离子脂质、纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶、纤维蛋白胶、纤 维蛋白密封剂、纤维蛋白原、凝血酶、快速消除型脂质纳米粒子（reLNP)和其组合。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的mRNA包含经纯化的IVT转录物。
3. 如权利要求1所述的方法，其中包含所述经修饰的mRNA的所述制剂是纳米粒子且其 中所述纳米粒子包含至少一种脂质。
4. 如权利要求3所述的方法，其中所述脂质是选自：DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、 C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG 和聚乙二醇化脂质。
5. 如权利要求3所述的方法，其中所述脂质是阳离子脂质。
6. 如权利要求5所述的方法，其中所述阳离子脂质是选自：DLin-DMA、DLin-K-DMA、 DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA 和 DODMA。
7. 如权利要求3所述的方法，其中所述脂质与所述经修饰的mRNA的重量比介于10:1 与30:1之间。
8. 如权利要求7所述的方法，其中包含所述经修饰的mRNA的所述纳米粒子制剂的平均 尺寸介于60与225nm之间。
9. 如权利要求8所述的方法，其中包含所述经修饰的mRNA的所述纳米粒子制剂的Η)Ι 介于0.03与0. 15之间。
10. 如权利要求3所述的方法，其中所述脂质在pH7. 4下的ζ电位为-10到+10。
11. 如权利要求7所述的方法，其中包含所述经修饰的mRNA的所述纳米粒子制剂还包 含促融合脂质、胆固醇和PEG脂质。
12. 如权利要求11所述的方法，其中包含所述经修饰的mRNA的所述纳米粒子制剂具有 摩尔比为50:10:38. 5:1. 5-3. 0的阳离子脂质：促融合脂质：胆固醇：PEG脂质。
13. 如权利要求12所述的方法，其中所述PEG脂质是选自PEG-c-DOMG和PEG-DMG且所 述促融合脂质是DSPC。
14. 如权利要求1所述的方法，其中接触是通过使用选自注射泵、内部渗透泵和外部渗 透泵的装置来进行。
15. 如权利要求1所述的方法，其中包含所述经修饰的mRNA的所述制剂是聚（乳酸-羟 基乙酸）共聚物（PLGA)微球体。
16. 如权利要求15所述的方法，其中包含所述经修饰的mRNA的所述PLGA微球体制剂 的微球体尺寸介于4与20 μ m之间。
17. 如权利要求15所述的方法，其中包含所述经修饰的mRNA的所述PLGA微球体制剂 在48小时的时间段内释放不到50%的所述经修饰的mRNA。
18. 如权利要求15所述的方法，其中包含所述经修饰的mRNA的所述PLGA微球体制剂 在血清中是稳定的。
19. 如权利要求18所述的方法，其中所述稳定性是在90%血清中相对于未经配制的经 修饰的mRNA而测定。
20. 如权利要求15所述的方法，其中负载重量百分比为至少0. 05%、至少0. 1 %、至少 0. 2%、至少0. 3%或至少0. 4%。
21. 如权利要求15所述的方法，其中所述经修饰的mRNA在所述PLGA微球体中的囊封 效率为至少50%。
22. 如权利要求15所述的方法，其中所述经修饰的mRNA在所述PLGA微球体中的囊封 效率为至少70%。
23. 如权利要求15所述的方法，其中所述经修饰的mRNA在所述PLGA微球体中的囊封 效率为至少90%。
24. 如权利要求15所述的方法，其中所述经修饰的mRNA在所述PLGA微球体中的囊封 效率为至少97%。
25. 如权利要求11所述的方法，其中接触所述哺乳动物细胞或组织是经由选自静脉 内、肌肉内、玻璃体内、鞘内、肿瘤内、肺和皮下的施用途径而发生。
26. 如权利要求25所述的方法，其中在接触后在血清中可检测到所述目的多肽持续长 达72小时，其水平高于接触前的水平。
27. 如权利要求26所述的方法，其中所述目的多肽可在雌性受试者的血清中检测到， 其水平高于雄性受试者的血清中的水平。
28. 如权利要求1所述的方法，其中所述制剂还包含第二经修饰的mRNA。
29. 如权利要求28所述的方法，其中所述制剂还包含第三经修饰的mRNA。
30. 如权利要求1所述的方法，其中包含所述经修饰的mRNA的所述制剂包括快速消除 型脂质纳米粒子。
31. 如权利要求30所述的方法，其中所述快速消除型脂质纳米粒子包含reLNP脂质、促 融合脂质、胆固醇和PEG脂质，其摩尔比为50:10:38. 5:1. 5 (reLNP脂质：促融合脂质：胆 固醇：PEG脂质）。
32. 如权利要求31所述的方法，其中所述促融合脂质是DSPC且所述PEG脂质是 PEG-c-DOMG。
33. 如权利要求31所述的方法，其中所述reLNP脂质是选自：具有内酯的DLin-DMA、具 有末端酯的DLin-DMA、具有内酯的DLin-MC3-DMA和具有末端酯的DLin-MC3-DMA。
34. 如权利要求30所述的方法，其中总脂质与经修饰的mRNA的重量比介于10:1与 30:1之间。
35. 如权利要求1所述的方法，其中接触是使用分割给药方案经由注射而发生。
36. 如权利要求35所述的方法，其中所述注射是对选自真皮内空间、表皮、皮下组织和 肌肉的组织进行。
37. 如权利要求1所述的方法，其中包含所述经修饰的mRNA的所述制剂包含纤维蛋白 密封剂。
38. 如权利要求1所述的方法，其中包含所述经修饰的mRNA的所述制剂包含类脂质且 其中所述脂质是选自C12-200和98N12-5。
39. 如权利要求1所述的方法，其中包含所述经修饰的mRNA的所述制剂是聚合物且所 述聚合物涂布有、覆盖有、环绕有、封围有或包含一层水凝胶或外科用密封剂。
40. 如权利要求39所述的方法，其中所述聚合物是选自PLGA、乙烯/乙酸乙烯酯共聚 物、泊洛沙姆和GELSITE?。
41. 如权利要求40所述的方法，其还包括另一层聚合物、水凝胶或外科用密封剂。
42. 如权利要求2所述的方法，其中所述经修饰的mRNA包含选自以下的至少一个5'末 端帽：CapO、Capl、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟嘌呤核苷、2' -氟-鸟嘌呤核苷、7-脱氮-鸟嘌 呤核苷、8_氧代-鸟嘌呤核苷、2-氨基-鸟嘌呤核苷、LNA-鸟嘌呤核苷和2-叠氮基-鸟嘌 呤核苷。
43. 如权利要求42所述的方法，其中所述5'末端帽是Capl。
44. 如权利要求43所述的方法，其中所述经修饰的mRNA包含至少两个修饰。
45. 如权利要求44所述的方法，其中所述至少两个修饰是独立地选自：5_甲基胞苷、假 尿苷和1-甲基-假尿苷。
46. -种在哺乳动物细胞或组织中产生目的多肽的方法，所述方法包括使所述哺乳动 物细胞或组织与包含编码所述目的多肽的经修饰的mRNA的缓冲剂制剂接触。
47. 如权利要求46所述的方法，其中所述缓冲剂制剂是选自：生理盐水、磷酸盐缓冲生 理盐水和林格氏乳酸盐。
48. 如权利要求46所述的方法，其中所述缓冲剂制剂所包含的钙浓度介于1到10mM之 间。
49. 如权利要求46所述的方法，其中所述经修饰的mRNA包含经纯化的IVT转录物。
50. 如权利要求46所述的方法，其中接触所述哺乳动物细胞或组织是经由选自静脉 内、肌肉内、玻璃体内、鞘内、肿瘤内、肺和皮下的施用途径而发生。
51. 如权利要求25或50所述的方法，其中所述目的多肽是在所述细胞或组织中从接触 位置起在整体位置上产生。
52. 如权利要求51所述的方法，其中所述施用途径是经由肌肉内或皮下的途径。
53. 如权利要求3所述的方法，其中还在密封剂中配制所述脂质纳米粒子制剂。
54. 如权利要求53所述的方法，其中所述密封剂是纤维蛋白密封剂。
55. -种在灵长类动物中产生药理学作用的方法，所述方法包括使所述灵长类动物与 包含经配制的编码目的多肽的经修饰的mRNA的组合物接触。
56. 如权利要求55所述的方法，其中所述经修饰的mRNA包含经纯化的IVT转录物。
57. 如权利要求56所述的方法，其中所述制剂是选自：纳米粒子、聚（乳酸-羟基乙酸） 共聚物（PLGA)微球体、类脂质、脂质复合物、脂质体、聚合物、碳水化合物（包括单糖）、阳离 子脂质、纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶、纤维蛋白胶、纤维蛋白密封剂、纤维蛋白原、凝血 酶、快速消除型脂质纳米粒子（reLNP)和其组合。
58. 如权利要求57所述的方法，其中所述药理学作用大于与已知可产生所述药理学作 用的治疗剂相关的药理学作用。
59. 如权利要求57所述的方法，其中所述药理学作用大于由包含未经配制的编码所述 目的多肽的经修饰mRNA的组合物所产生的药理学作用。
60. 如权利要求57所述的方法，其中所述药理学作用大于由包含经配制的编码所述目 的多肽的未经修饰的mRNA的组合物所产生的药理学作用。
61. 如权利要求57所述的方法，其中所述药理学作用对疾病、病症、病状或感染产生在 治疗上有效的结果。
62. 如权利要求61所述的方法，其中所述药理学作用是选自：细胞计数变化、血清化学 性质变化、酶活性变化、血红蛋白增加和红细胞压积增加。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述在治疗上有效的结果是选自：治疗、改善一种 或多种症状、诊断、预防和延迟发作。
【文档编号】C07H21/02GK104114572SQ201280069609
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2012年12月14日 优先权日:2011年12月16日
【发明者】安东宁·德富热罗勒, K·M·伍德, S·M·伊巴希尔, 努巴尔·B·埃非扬, P·瓦伦西亚, 杰森·P·斯洛姆 申请人:现代治疗公司