新型抗人ctgf抗体的利记博彩app
【专利摘要】本发明提供与以往的抗人CTGF抗体相比在结合活性和/或中和活性方面优良的抗人CTGF抗体、以及使用该抗人CTGF抗体的包括慢性肾病、糖尿病性肾病等肾疾病的人CTGF参与病态形成的各种疾病的预防或治疗手段。一种抗人CTGF抗体，其包含由序列号10所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
【专利说明】新型抗人CTGF抗体
【技术领域】
[0001]本发明涉及新型抗人CTGF抗体。详细而言，本发明的新型抗人CTGF抗体是与以往的抗人CTGF抗体相比在结合活性和/或中和活性方面优良的抗人CTGF抗体。
【背景技术】
[0002]CTGF (结缔组织生长因子)是属于CCN家族的分子量约36~38kDa的富含半胱氨酸残基的分泌蛋白质(非专利文献I)，以往，已知由被认为是对纤维化最重要的增殖因子的TGF- β诱导(非专利文献2)。因此，推测TGF- β诱导CTGF，诱导出的CTGF促进器官、组织的纤维化，CTGF被认为对纤维化、细胞的增殖、细胞外基质的代谢、血管形成、动脉硬化等发挥重要的作用(非专利文献3)。
[0003]已知CTGF中存在多个结构域，并且与其他因子相互作用。其中，已经揭示出CTGF通过血管性血友病因子C结构域与TGF-β或ΒΜΡ4直接结合，引起TGF-β信号传递的促进或BMP信号传递的抑制(非专利文献4)。
[0004]CTGF在各种肾病(例如，慢性肾病、糖尿病性肾病、肾小球硬化症、IgA肾病、局灶节段性肾小球硬化症、ANCA相关性肾炎、急进性肾小球肾炎、慢性移植肾病、肾病综合征、狼疮肾炎、膜增生性肾小球肾炎)中表达亢进(非专利文献5)，有报道称其与纤维化密切相关(非专利文献6)。
[0005]另外，报道了CTGF与各种纤维化病(硬皮病、间质性肺病、特发性肺纤维化等肺纤维化病、由慢性B型或C型肝炎产生的纤维化病、放射线诱导性纤维化病、由创伤愈合产生的纤维化病、以及心脏的肥大和纤维化病)、血管增生性疾病、糖尿病性视网膜病、癌症等相关，将其视为新的治疗标靶(非专利文献7、8)。
[0006]因此，如果能够开发具有与CTGF特异性地结合而阻碍CTGF所带来的各种作用的活性的单克隆抗体，则可望用于CTGF参与病态形成的各种疾病的诊断、预防或治疗。
[0007]作为到目前为止进行了研究的对人CTGF显示功能抑制作用的抗体，报道了作为人单克隆抗体的Μ84和Μ320(专利文献I)、CLNl (专利文献2)、作为小鼠单克隆抗体的CTGF-m2-l (专利文献3)等。其中，对CLNl进行了最详细的研究，在间质性肺纤维化模型、由单侧输尿管结扎导致的肾间质纤维化模型中，其效果明确。CLNl目前作为FG-3019正处于临床试验(II期)阶段。
[0008]但是，以往的抗体对CTGF的结合活性称不上充分，从治疗有效性的观点考虑，对CTGF的中和活性称不上足够强。
[0009]作为规定抗体药物的有效给药量的主要因素，一般可以列举抗体所具有的对抗原的结合活性和中和活性、体内存在的抗原的量，提高结合活性或中和活性使给药量降低，结果会降低患者的经济负担和医疗成本，可以说是极为有益的改良。
[0010]鉴于上述情况，获得结合活性、中和活性比以往的抗体强的抗人CTGF抗体对用于CTGF参与病态形成的各种疾病的预防或治疗是必不可缺的。
[0011]现有技术文献[0012]专利文献
[0013]专利文献1:日本特开2000-232884
[0014]专利文献2:TO2004/108764
[0015]专利文献3:W02007/066823
[0016]非专利文献
[0017]非专利文献I:D.M.Bradhamet al, J.Cell Biol.114:1285-1294(1991)
[0018]非专利文献2:A.1garashi et al’Mol.Biol.Cell4:637_645 (1993)
[0019]非专利文献3:Blom IE et al, Matrix Biol.21(6): 473-82 (2002)
[0020]非专利文献4:Abreu, et al.Nat.Cell.Biol.4，599-604 (2002)
[0021]非专利文献5:1to Y et al.: Kidney Int.53 (4) 853-61，(1998)
[0022]非专利文献6:Phanish MK et al, Nephron Exp Nephrol.114 (3) e83_92, (2010)
[0023]非专利文献7:Sh1-ffen X et al, Cytokine Growth Factor Rev.19(2): 133-44.(2008)
[0024]非专利文献8: Jun JI et al, Nat Rev Drug Discov.10 (12):945-63 (2011)
【发明内容】
[0025]发明所要解决的问题
[0026]本发明的课题在于提供与以往的抗人CTGF抗体相比在结合活性和/或中和活性上优良的抗人CTGF抗体。
[0027]用于解决问题的方法
[0028]本发明包含以下的发明作为医学上或产业上有用的物质/方法。
[0029][I] 一种抗人CTGF抗体，其包含由序列号10所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
[0030][2]如[I]所述的抗人CTGF抗体，其中，上述抗体的重链恒定区为人IgY I恒定区。
[0031][3]如[I]所述的抗人CTGF抗体，其中，上述抗体的轻链恒定区为人Ig K恒定区。
[0032][4]如[I]所述的抗人CTGF抗体，其中，上述抗体的重链恒定区为人IgY I恒定区，上述抗体的轻链恒定区为人IgK恒定区。
[0033][5]如[I]所述的抗人CTGF抗体，其包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号8所示的氨基酸序列构成的轻链。
[0034][6] 一种多核苷酸,其包含编码[I]~[5]中任一项所述的抗体的重链可变区的序列。
[0035][7] 一种多核苷酸，其包含编码[I]~[5]中任一项所述的抗体的轻链可变区的序列。
[0036][8] 一种表达载体，其包含[6]和/或[7]所述的多核苷酸。
[0037][9] 一种经[8]所述的表达载体转化的宿主细胞。
[0038][10]如[9]所述的宿主细胞，其选自由以下的(a)和(b)组成的组:
[0039] (a)经含有包含编码[I]~[5]中任一项所述的抗体的重链可变区的序列的多核苷酸和包含编码该抗体的轻链可变区的序列的多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞；和[0040](b)经含有包含编码[I]~[5]中任一项所述的抗体的的重链可变区的序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码该抗体的轻链可变区的序列的多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞。
[0041][11] 一种生产[I]~[5]中任一项所述的抗人CTGF抗体的方法，其包含对[9]或
[10]所述的宿主细胞进行培养以使其表达抗人CTGF抗体的步骤。
[0042][12] 一种人CTGF参与病态形成的疾病的治疗药，其包含[I]~[5]中任一项所述的抗体。
[0043][13]如[12]所述的治疗药，其中，上述疾病为肾疾病。
[0044][14]如[13]所述的治疗药，其中，上述肾疾病为慢性肾病或糖尿病性肾病。
[0045][15] 一种用于预防或处置人CTGF参与病态形成的疾病的方法，其包含施用[I]~
[5]中任一项所述的抗体的步骤。
[0046][16]如[15]所述的方法，其中，上述疾病为肾疾病。
[0047][17]如[16]所述的方法，其中，上述肾疾病为慢性肾病或糖尿病性肾病。
[0048][18]用于在人CTGF参与病态形成的疾病的预防或处置中使用的、[I]~[5]中任一项所述的抗体。 [0049][19]如[18]所述的抗体，其中，上述疾病为肾疾病。
[0050][20]如[19]所述的抗体，其中，上述肾疾病为慢性肾病或糖尿病性肾病。
[0051]发明效果
[0052]根据本发明，提供与以往的抗人CTGF抗体相比在结合活性和/或中和活性上优良的抗人CTGF抗体。本发明的抗人CTGF抗体通过抑制人CTGF的功能而具有强力的抗纤维化作用，对于人CTGF参与病态形成的各种疾病的预防或治疗有用。而且，这种本发明的抗人CTGF抗体带来给药量的降低、给药间隔的扩大、给药方法的改善(例如，皮下注射剂)等临床应用上的优良改善，大大有助于改善治疗有效性和患者依从性。
【具体实施方式】
[0053]以下，对本发明进行详述。
[0054]本发明人对抗人CTGF抗体的制作进行了大量的创意研究，结果成功地制作了与以往的抗人CTGF抗体相比结合活性得到改善、中和活性优良的抗人CTGF抗体。
[0055]抗体分子的基本结构在各类中是共通的，由分子量5万~7万的重链和2~3万的轻链构成。重链通常由含有约440个氨基酸的多肽链构成，在各类中具有特征性的结构，与IgG、IgM、IgA、IgD、IgE相对应被称为Y链、μ链、α链、δ链、ε链。而且IgG中存在1861、1862、1863、1864，分别被称为y、Y 2、Y 3、Y 4。轻链通常由含有约220个氨基酸的多肽链构成，已知有L型和K型两种，分别被称为λ链、κ链。抗体分子的基本结构的肽构成由各自相同的2条重链和2条轻链通过二硫键(S-S键)和非共价键结合而成，分子量为15万~19万。2种轻链与任一种重链均能够成对。各个抗体分子常常由相同的2条轻链和相同的2条重链形成。
[0056]链内S-S键在重链中有四个(μ、ε链中有五个)，在轻链中有两个，每100~110个氨基酸残基形成一个环，该立体结构在各环间类似，被称为结构单元或结构域。对于在重链、轻链中均位于N末端的结构域而言，即使是来自于同种动物的同一类(亚类)的标准品，其氨基酸序列也不固定，被称为可变区，各结构域分别被称为重链可变区(Vh)和轻链可变区(')。比可变区更靠C末端侧的氨基酸序列在各类或亚类中基本固定，被称为恒定区(各结构域分别表示为CH1、Ch2、Ch3或CJ。
[0057]抗体的抗原决定部位由Vh和\构成，结合的特异性由该部位的氨基酸序列决定。另一方面，与补体或各种细胞的结合等生物学活性反映出各类Ig的恒定区的结构的差异。已知轻链和重链的可变区的可变性基本限定在任一种链中均存在的3个小的超变区内，将这些区域称为互补决定区(⑶R ;从N末端侧起分别为⑶R1、⑶R2、⑶R3)。可变区的其余部分被称为框架区(FR)，比较恒定。
[0058]本发明人成功制作的本发明的抗人CTGF抗体为具有以下特征的抗人CTGF抗体。
[0059]一种抗人CTGF抗体，其包含由序列号10所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
[0060]具体而言，本发明人使用人单克隆抗体开发技术“Veloclmmune” (VelocImmuneantibody technology ；Regeneron公司(美国专利6596541号))小鼠制作抗体，通过使用各种生物学活性试验和物性试验的抗体的筛选，成功地鉴定了本发明的抗人CTGF抗体。在Ve1cImmune技术中，将内源性的免疫球蛋白重链和轻链的可变区由对应的人可变区置换的转基因小鼠用目标抗原(例如，人CTGF)免疫后，获得表达抗体的小鼠的淋巴系细胞，与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，由此制作杂交瘤。接着，就是否产生与目标抗原特异性地结合的抗体对该杂交瘤细胞进行筛选。在此产生的抗体为具有人抗体的可变区和小鼠抗体的恒定区的抗体(也称为嵌合抗体)。接着，在鉴定出与目标抗原特异性地结合的抗体的情况下，从该杂交瘤细胞中分离编码抗体的重链和轻链的可变区的DNA，将该DNA与编码期望类别的人抗体重链和轻链的恒定区的DNA连接。使如此得到的编码重链和轻链的基因在细胞内(例如，CHO细胞)表达，产生抗体分子。通过该方法制作的抗体的重链和轻链为来源于人免疫球蛋白基因的“完全人型”抗体的重链和轻链。
[0061]本发明的抗人CTGF抗体可以由本领域技术人员基于本申请说明书中公开的、其重链可变区和轻链可变区的序列信息，使用该领域中公知的方法容易地制作。本发明的抗人CTGF抗体可以优选将其重链可变区和轻链可变区与人抗体的重链恒定区和轻链恒定区分别连接而以完全人型抗体的形式进行制作。具体而言，制作具有编码本发明的抗体的重链可变区氨基酸(序列号10)的碱基序列的重链可变区基因片段和具有编码本发明的抗体的轻链可变区氨基酸(序列号4)的碱基序列的轻链可变区基因片段。然后，将该可变区基因与人抗体的适当类别的恒定区基因连接而制作完全人型抗体基因。接着，将该抗体基因与适当的表达载体连接，导入培养细胞中。最后，对该培养细胞进行培养，可以从培养上清中得到单克隆抗体。
[0062]编码本发明的抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸的基因片段例如可以基于依据该重链和轻链可变区的氨基酸序列而设计的碱基序列，利用该领域中公知的基因合成方法进行合成。作为这样的基因合成方法，可以使用W090/07861中记载的抗体基因的合成方法等本领域技术人员公知的各种方法。
[0063]接着，将上述的可变区基因片段与人抗体的恒定区基因连接而制作完全人型抗体基因。使用的人抗体的恒定区可以选择任何一种亚类的恒定区(例如，作为重链的Y1、Y 2、y3或Y 4、作为轻链的λ链或K链的恒定区)，作为重链恒定区，可以优选使用人Igy I，另外，作为轻链恒定区，可以优选使用人IgK。
[0064]对于在该完全人型抗体基因的制作之后的抗体基因向表达载体中的导入、表达载体向培养细胞中的导入、培养细胞的培养、抗体的纯化等，可以使用该领域中公知的各种方法进行。
[0065]作为与如上所述得到的抗体基因连接的表达载体，可以列举例如GS载体pEE6.4、pEE12.4(Lonza Biologies公司)，只要是能够表达抗体基因的表达载体，则没有特别限制。另外，也可以利用AG-Y 1、AG-κ (例如，参考W094/20632)等预先具有人Ig恒定区基因的表达载体。
[0066]上述的表达载体通过例如磷酸钙法、电穿孔法等被导入培养细胞中。
[0067]作为导入表达载体的培养细胞，可以使用例如CHO-KlSV细胞、CH0-DG44细胞、293细胞等培养细胞，将其通过常规方法进行培养即可。
[0068]上述培养后，蓄积在培养上清中的抗体可以通过各种柱层析、例如使用蛋白A柱或蛋白G柱的各种层析进行纯化。
[0069]本发明的抗人CTGF抗体为与人CTGF结合的抗体。作为测定所得到的抗人CTGF抗体对人CTGF的结合活性的方法，有ELISA、表面等离子共振(SPR)分析等方法。例如，在使用ELISA的情况下，将人CTGF(序列号14)固定在ELISA板上，向其中添加抗人CTGF抗体使其反应后，使用辣根过氧化物酶(HRP)等酶标记的抗IgG抗体等二次抗体进行反应，清洗后，加入显色底物(例如，HRP标记的情况下为TMB显色试剂)，测定吸光度。另外，可以利用SPR分析，更详细地测定对人CTGF的结合活性。在进行SPR分析的情况下，例如，可以通过使用Biacore系统测定抗人CTGF抗体与人CTGF的结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)，由2个常数的比算出解离常数(KD)。本发明的抗人CTGF抗体中也包括与来源于其它动物的CTGF(例如，小鼠CTGF)结合的抗体，也可以测定对这些蛋白质的结合活性。
[0070]另外，本发明的抗人CTGF抗体对人CTGF具有中和活性。在本说明书中使用的情况下，抗体的“中和活性”是指通过与CTGF结合，抑制介由CTGF所带来的任意生物活性的活性，可以将CTGF的I个或多个生物活性作为指标来进行评价。作为这样的中和活性，可以列举例如肾来源的成纤维细胞中的胶原蛋白合成抑制(纤维化抑制)作用，可以通过使用后述实施例中记载的方法进行评价。
[0071]为了更详细地评价本发明的抗人CTGF抗体的效果，也可以使用抗体的体内药效试验。例如，可以通过后述实施例中记载的使用小鼠慢性肾病模型、大鼠肾炎模型的肾功能评价来评价抗体在体内的药效。
[0072]此外，作为评价本发明的抗人CTGF抗体的各种稳定性(例如，热稳定性、长期保存稳定性、高浓度稳定性)的方法，可以列举例如利用差示扫描量热测定、保存中凝集体形成测定的方法。
[0073]本发明的抗人CTGF抗体可以优选通过如下方法容易地获得:使用该领域中公知的方法，合成包含编码序列号10所示的重链可变区氨基酸序列的碱基序列的DNA和包含编码序列号4所示的轻链可变区氨基酸序列的碱基序列的DNA，将这些DNA与适当类别的人抗体恒定区基因、对于重链而言优选人Ig Y I恒定区基因、对于轻链而言优选人IgK恒定区基因连接，构建完全人型抗体基因，使用该领域中公知的各种方法，将该完全人型抗体基因导入表达载体，将该表 达载体导入培养细胞并对该培养细胞进行培养，从所得到的培养物中纯化抗体。包含编码序列号10所示的重链可变区氨基酸序列的碱基序列的DNA优选包含序列号9所示的碱基序列。包含编码序列号4所示的轻链可变区氨基酸序列的碱基序列的DNA优选包含序列号3所示的碱基序列。
[0074]包含序列号10所示的重链可变区和人Ig Y I恒定区的本发明的优选的抗人CTGF抗体重链为由序列号12所示的氨基酸序列构成的重链。包含序列号4所示的轻链可变区和人Ig K恒定区的本发明的优选的抗人CTGF抗体轻链为由序列号8所示的氨基酸序列构成的轻链。包含编码由序列号12所示的氨基酸序列构成的抗人CTGF抗体重链的碱基序列的DNA优选包含序列号11所示的碱基序列。包含编码由序列号8所示的氨基酸序列构成的抗人CTGF抗体轻链的碱基序列的DNA优选包含序列号7所示的碱基序列。作为包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号8所示的氨基酸序列构成的轻链的本发明的抗人CTGF抗体，可以列举后述实施例中记载的完全人型37-45-MH1。
[0075]本发明也包括含有包含由序列号10的第31~35位的氨基酸序列构成的⑶R1、由序列号10的第50~66位的氨基酸序列构成的⑶R2、由序列号10的第99~108位的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区和包含由序列号4的第24~35位的氨基酸序列构成的⑶R1、由序列号4的第51~57位的氨基酸序列构成的⑶R2、由序列号4的第90~98位的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区的抗人CTGF抗体。这样的抗人CTGF抗体也可以由本领域技术人员按照前述的步骤容易地制作。
[0076]本发明也包含含有本发明的抗体的重链可变区和轻链可变区且保持活性的单链可变区片段(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2等抗人CTGF抗体片段。另外,本领域技术人员也可以基于本发明制作该抗人CTGF抗体或抗体片段与其他肽或蛋白质的融合抗体，或者制作结合有修饰剂的修饰抗体。用于融合的其他肽或蛋白质只要不会使抗体的结合活性降低，则没有特别限定，可 以列举例如:人血清白蛋白、各种标签肽、人工螺旋基序肽、麦芽糖结合蛋白质、谷胱甘肽S转移酶、各种毒素、其他能够促进多聚体化的肽或蛋白质等。用于修饰的修饰剂只要不会使抗体的结合活性降低，则没有特别限定，可以列举例如:聚乙二醇、糖链、磷脂、核糖体、低分子化合物等。
[0077]如此得到的本发明的抗人CTGF抗体根据需要纯化后，按照常规方法制剂化，可以用于慢性肾病、糖尿病性肾病等肾疾病、血管增生性疾病、心肌病、肝脏的纤维增生疾病、肺纤维化病、皮肤纤维化疾病、糖尿病性视网膜病、癌症等CTGF参与病态形成的疾病的预防、治疗。
[0078]本发明的抗人CTGF抗体可以优选作为肾疾病治疗剂使用，更优选作为慢性肾病或糖尿病性肾病的治疗剂使用。作为这些治疗剂等的剂型的例子，可以为注射剂、点滴用剂等非口服制剂，优选通过静脉内给药、皮下给药等进行给药。另外，制剂化时，可以在药学上允许的范围内使用与这些剂型相应的载体、添加剂。
[0079]上述制剂化时的本发明的抗人CTGF抗体的添加量根据患者的症状的程度和年龄、使用的制剂的剂型或抗体的结合效价等而异，例如，可以使用约0.00 lmg/kg至约100mg/kg。
[0080]本发明还提供包含编码本发明的抗人CTGF抗体的序列的多核苷酸和包含该多核苷酸的表达载体。本发明还提供包含编码本发明的抗人CTGF抗体的重链可变区的序列的多核苷酸、包含编码本发明的抗CTGF抗体的轻链可变区的序列的多核苷酸、以及包含这些多核苷酸中的任意一者或两者的表达载体。本发明的表达载体只要能够在原核细胞和/或真核细胞的各种宿主细胞中表达编码本发明的抗体或其重链可变区和/或轻链可变区的基因并且能够产生这些多肽，则没有特别限制。可以列举例如:质粒载体、病毒载体(例如，腺病毒、逆转录病毒)等。本发明的表达载体优选含有上述的包含编码本发明的抗体的重链或轻链的序列的多核苷酸，或者含有包含编码本发明的抗体的重链的序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗体的轻链的序列的多核苷酸这两者。
[0081 ] 本发明的表达载体可以含有以能够工作的方式与编码本发明的抗人CTGF抗体或其重链可变区和/或轻链可变区的基因连接的启动子。作为用于在细菌中表达编码本发明的抗体或其重链 可变区和/或轻链可变区的基因的启动子，在宿主为埃希氏菌属菌的情况下，可以列举例如:Trp启动子、Iac启动子、recA启动子、λ PL启动子、Ipp启动子、tac启动子等。作为用于在酵母中表达的启动子，可以列举例如:PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子，作为用于在芽孢杆菌属菌中表达的启动子，可以列举:SL01启动子、SP02启动子、penP启动子等。另外，在宿主为哺乳动物细胞等真核细胞的情况下，可以列举:来源于SV40的启动子、逆转录病毒的启动子、热休克启动子等。
[0082]在使用细菌、特别是大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，本发明的表达载体可以进一步包含起始密码子、终止密码子、终止子区和可复制单元。另一方面，在使用酵母、动物细胞或昆虫细胞作为宿主的情况下，本发明的表达载体可以包含开始密码子、终止密码子。另外，该情况下，可以包含增强子序列、编码本发明的抗体或其重链可变区或轻链可变区的基因的5’侧和3’侧的非翻译区、分泌信号序列、剪接部、多聚腺苷酸化位点或可复制单元等。另外，根据目的，可以包含通常使用的选择标记(例如，四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因)。
[0083]本发明还提供导入了编码本发明的抗体或其重链可变区和/或轻链可变区的基因的转化体。这样的转化体例如可以通过使用本发明的表达载体转化宿主细胞而制作。作为用于制作转化体的宿主细胞，只要适合上述的表达载体且能够被转化，则没有特别限定，可以例示本发明的【技术领域】中通常使用的天然细胞或人工建立的细胞等各种细胞(例如，细菌(埃希氏菌属菌、芽孢杆菌属菌)、酵母(酵母属、毕赤酵母属等)、动物细胞或昆虫细胞(例如，Sf9)等)。转化可以通过本身公知的方法进行。
[0084]本发明的转化体优选为使用含有包含编码本发明的抗体的重链可变区的序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗体的轻链可变区的序列的多核苷酸的表达载体转化后的宿主细胞，或者使用含有包含编码本发明的抗体的重链可变区的序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码本发明的抗体的轻链可变区的序列的多核苷酸的表达载体转化后的宿主细胞。本发明的转化体更优选为使用含有上述的包含编码本发明的抗体的重链的序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗体的轻链的序列的多核苷酸的表达载体转化后宿主细胞，或者使用含有上述的包含编码本发明的抗体的重链的序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码本发明的抗体的轻链的序列的多核苷酸的表达载体转化后的宿主细胞。
[0085]本发明还提供包括使编码本发明的抗体或其重链可变区和/或轻链可变区的基因在宿主细胞中表达的步骤，即，使用这种转化体的步骤的本发明的抗人CTGF抗体的生产方法。在该方法中使用的宿主细胞优选为使用上述的本发明的表达载体转化后的宿主细胞，该表达载体可以分开或同时含有包含编码本发明的抗体的重链可变区的序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗体的轻链可变区的序列的多核苷酸。
[0086]在本发明的抗人CTGF抗体的生产中，转化体可以在营养培养基中进行培养。营养培养基优选含有转化体的生长所需的碳源、无机氮源或有机氮源。作为碳源，可以例示例如:葡萄糖、右旋糖酐、可溶性淀粉、蔗糖等，作为无机氮源或有机氮源，可以例示例如:铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浸液、蛋白胨、酪蛋白、肉浸膏、大豆柏、马铃薯提取液等。另外，可以根据期望含有其他营养素(例如，无机盐(例如，氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁)、维生素类、抗生素(例如，四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等)等)。
[0087]转化体的培养可以通过本身公知的方法进行。适当选择培养条件，例如温度、培养基的PH和培养时间。例如，在宿主为动物细胞的情况下，作为培养基，可以使用含有约5~20 %的胎牛血清的MEM培养基(Science, Vol.122，p.501, 1952)、DMEM 培养基(Virology, Vol.8，p.396，1959)、RPMI1640 培养基(J.Am.Med.Assoc.，Vol.199，p.519，1967)、199 培养基(proc.Soc.Exp.Biol.Med.，Vol.73，p.1, 1950)等。培养基的pH优选为约6~约8，培养通常在约30°C~约40°C进行约15小时~约72小时，根据需要也可以进行通气或搅拌。在宿主为昆虫细胞的情况下，可以列举例如含有胎牛血清的 Grace’ s 培养基(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Vol.82, p.8404, 1985)等，其 pH 优选为约5~约8。培养通常在约20°C~约40°C进行15~100小时，根据需要也可以进行通气或搅拌。在宿主为细菌、放线菌、酵母、丝状菌的情况下，例如，含有上述营养源的液体培养基是适当的。优选PH为5~8的培养基。在宿主为大肠杆菌的情况下，作为优选的培养基，可以例不 LB 培养基、M9 培养基(Miller 等、Exp.Mol.Genet, Cold Spring HarborLaboratory, p.431, 1972)等。在该情况下，培养可以根据需要在通气、搅拌的同时,通常在14~43°C进行约3小时~约24小时。在宿主为芽孢杆菌属菌的情况下，可以根据需要在通气、搅拌的同时，通常在30~40°C进行约16小时~约96小时。在宿主为酵母的情况下，作为培养基，可以列举例如Burkholder基本培养基(Bostian, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Vol.77，p.4505, 1980)，优选pH为5~8。培养通常在约20°C~约35°C进行约14小时~约144小时，根据需要也可以进行通气或搅拌。
[0088]本发明的抗人CTGF抗体可以通过对上述的转化体进行培养而从该转化体中回收，优选进行分离、纯化。作为分离、纯化方法，可以列举例如:盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法、透析、超速过滤、凝胶过滤、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳等利用分子量差异的方法、离子交换色谱、羟磷灰石色谱等利用带电的方法、亲和色谱等利用特异亲和性的方法、反相高效液相色谱等利用疏水性差异的方法、等电点电泳等利用等电点差异的方法等。
[0089]对本发明进行了全面记载，为了获得进一步的理解，在此提供参考的特定实施例，但这些实施例的目的在于例示，并不用于限定本发明。
[0090]实施例
[0091]对于使用市售的试剂盒或试剂等的部分，若无特别说明，则按照附属的操作说明进行实验。
[0092](实施例1:各种来源的CTGF蛋白质的获得)
[0093] 本发明人获得了人CTGF蛋白质作为用于制作抗CTGF抗体的抗原。将人CTGF的全长基因(序列号13)整合入表达载体(pcDNA3.1 ;Invitrogen公司)中，将制成的载体使用作为基因导入试剂的 FreeStyle MAX Reagent (Invitrogen 公司)对 FreeStyle293细胞(Invitrogen公司)进行基因导入。将该细胞在使用FreeStyle293表达培养基(Invitrogen公司)的无血清培养体系中培养后，获得了含有人CTGF蛋白质的培养上清。使用HiTrap肝素柱和CM柱(GE医疗日本公司)从获得的培养上清中纯化蛋白质，将其用于以下的实验。对于小鼠、大鼠和猴CTGF蛋白质，也使用同样的方法获得。
[0094](实施例2:对VelocImmune小鼠的免疫)
[0095]通过对Veloclmmune小鼠进行免疫，获得抗人CTGF的抗体。为了提高所得到的抗体的多样性，本发明人对多种免疫方法、给药途径、佐剂、免疫期间等进行了研究。作为免疫原，使用纯化的人CTGF，与佐剂混合后进行免疫。作为给药途径，对足底给药和腹腔内给药进行了研究。作为佐剂，对TiterMax Gold(CytRx公司)、完全弗氏佐剂(Sigma公司)和不完全弗氏佐剂(Sigma公司)进行了研究。作为进一步添加的免疫激活剂，对CpG寡核苷酸和磷酸铝凝胶(BRENNTAG公司)进行了研究。作为免疫期间，对3周~14周进行了研究。数次免疫后，从小鼠尾静脉进行采血，监测效价，由此进行产生与人CTGF结合的抗体的VelocImmune小鼠的选择。
[0096]效价测定使用以下的标准ELISA方法进行测定。向Maxisorp384孔板(Nunc公司)中添加20 μ L人CTGF的磷酸缓冲生理盐水(PBS)溶液(I μ g/mL)，在4°C孵育过夜进行固相化。次日，使用100 μ L清洗液(TBST:含有0.05% Tween-20的Tris缓冲液)将板清洗I次后，添加100 μ L封闭剂(含有I % BSA的PBS)，在室温静置I小时。使用100 μ L TBST清洗液清洗I次后，制作采血得到的血浆的稀释系列并添加。在室温孵育I小时后，使用100 μ L TBST清洗液清洗3次，添加20 μ L使用含有0.1 % BSA的TBST清洗液稀释5000倍的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体(HRP-goat ant1-mouse IgG antibody ；Zymed公司)。在室温孵育I小 时后，使用100 μ L TBST清洗液清洗3次。加入40 μ L TMB显色试剂(住友酚醛塑料株式会社)，在室温静置10分钟后，加入40 μ L终止液(2mol/L硫酸)使反应停止，测定450nm的吸光度。
[0097](实施例3:产生抗人CTGF抗体的杂交瘤的制作)
[0098]对确认抗体效价的上升后选择出的小鼠进行最终免疫(抗原的静脉内施用或腹腔内施用)。按照常规方法，摘除免疫后的小鼠的脾脏、淋巴结等，收集淋巴细胞，将其与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，由此制作杂交瘤。对杂交瘤进行有限稀释，在得到单一克隆的基础上，使用蛋白A或蛋白G柱(GE医疗日本公司)从上清中纯化抗体。
[0099](实施例4=ELISA检测)
[0100]本发明人使用ELISA方法对抗体与CTGF的结合特异性进行了评价。向Maxisorp384孔板(Nunc公司)中添加20 μ L人CTGF的PBS溶液(I μ g/mL)，在4°C孵育过夜进行固相化。次日，使用100 μ L清洗液(TPBS:含有0.05% Tween-20的PBS)将板清洗I次后，添加100 μ L封闭剂(含有I % BSA的PBS)，在室温静置I小时。使用100 μ L TBST清洗液清洗I次后，将纯化抗体样品制成适当稀释系列并添加。在室温孵育I小时后，使用100 μ L TBST清洗液清洗3次，添加20 μ L使用含有0.1 % BSA的TBST清洗液稀释5000倍的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体(HRP-goat ant1-mouse IgG antibody ；Zymed公司)。在室温孵育I小时后，使用100 μ L TBST清洗液清洗3次。加入40 μ L TMB显色试剂(住友酚醛塑料株式会社)，在室温静置10分钟后，加入40 μ L终止液(2mol/L硫酸)使反应停止,测定450nm的吸光度。使用复孔对各抗体进行试验,通过曲线拟合分析EC50。
[0101]其结果，确认命名为37-45的抗体具有高结合活性(EC50:1.6ng/ml)。
[0102](实施例5:抗体的序列确定)
[0103]对于鉴定出的抗体37-45，本发明人从杂交瘤中克隆了编码抗体的重链和轻链的基因。从杂交瘤中提取RNA，使用cDNA扩增试剂盒(SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒；Clontech公司)制作cDNA。接着，使用PCR，对重链和轻链的可变区进行延伸和扩增。将PCR产物重组入pCR3.1-TOPOdnvitrogen公司)等PCR产物亚克隆用载体后，使用测序仪(ABI PRISM3100 ;应用生物系统公司)鉴定基因序列。
[0104]将鉴定的37-45的重链可变区的碱基序列示于序列号I中，将氨基酸序列示于序列号2中，将37-45的轻链可变区的碱基序列示于序列号3中，将氨基酸序列示于序列号4中。
[0105](实施例6:完全人型抗体的制作)
[0106]上述抗体为可变区来源于人、恒定区来源于小鼠的抗体。因此，本发明人将来源于小鼠的恒定区置换成来源于人的恒定区，制作成完全人型抗体(完全人型37-45)。具体而言，在抗体的重链可变区基因的5’侧连接信号序列，然后在3’侧连接人Ig Y I的恒定区基因(Man Sung Co 等，(1992) J Immunol.Vol.148(4): 1149-1154)，将该重链基因插入 GS 载体(Lonza Biologies公司)pEE6.4中。插入时，将基因中的限制酶BbvCI识别位点改变成对抗体的氨基酸序列没有影响的DNA序列。另外，在抗体的轻链可变区基因的5’侧连接信号序列，然后在3’侧连接人K链的恒定区基因(Man Sung Co等，出处同上)，将该轻链基因插入GS载体ρΕΕ12.4中。
[0107]将制成的完全人型37-45的重链的碱基序列示于序列号5中，将氨基酸序列示于序列号6中，将该抗体的轻链的碱基序列示于序列号7中，将氨基酸序列示于序列号8中。
[0108](实施例7:可变区的糖链修饰位点的突变体制作)
[0109]上述的完全人型37-45的重链可变区氨基酸包含N-X-(T/S)的N型糖链修饰基序序列。具体而言，序列号2所示的重链可变区中的、基于Kabat编号的58位的Asn相当于糖链修饰位点。如果存在糖链修饰位点，则在细胞培养期间产生向抗体上的糖链的添加，已知糖链的添加依赖于培养条件、表达的宿主。即，即使是已建立的同一抗体产生细胞，糖链添加的程度也可能随培养条件(培养基、细胞密度等)而改变，可能难以获得质量均匀的抗体药品。因此，本发明人制作了在完全人型37-45的重链可变区导入有突变的完全人型抗体(完全人型37-45-MH1)。
[0110]将制成的完全人型37-45-MH1的重链可变区的碱基序列示于序列号9中，将氨基酸序列示于序列号10中。将制成的完全人型37-45-MH1的重链的碱基序列示于序列号11中，将氨基酸序列示于序列号12中。完全人型37-45-MH1的轻链与完全人型37-45的轻链相同。
[0111]完全人型37-45-MH1抗体的重链可变区的⑶Rl、⑶R2和⑶R3分别为基于Kabat编号的重链可变区的31~35位、50~65位和95~102位的区域，分别由序列号10的31~35位、50~66位和99~108位的氨基酸序列构成。完全人型37-45-MH1抗体的轻链可变区的⑶R1XDR2和⑶R3分别 为基于Kabat编号的轻链可变区的24~34位、50~56位和89~97位的区域,分别由序列号4的24~35位、51~57位和90~98位的氨基酸序列构成。
[0112](实施例8:完全人型抗体的表达和纯化)
[0113]将分别插入有上述各抗体(完全人型37-45和完全人型37-45-MH1)的重链和轻链的基因的上述GS载体使用NotI和PvuI进行限制酶切割，使用Ligation-Convenience试剂盒(NIPPONGENE公司)或Ligation-high(东洋纺公司)进行连接，构建插入有重链和轻链两种基因的GS载体。该载体编码全长的重链、轻链和谷氨酰胺合成酶(Glutaminesynthetase)，通过转染到CHO-KlSV细胞中使其表达抗体。使用蛋白A或蛋白G柱(GE医疗日本公司)纯化培养上清，得到各完全人型抗体的纯化抗体。
[0114](实施例9:完全人型抗体的ELISA检测)
[0115]本发明人使用ELISA方法对上述实施例中制作的完全人型37-45和完全人型37-45-MH1与人、小鼠、大鼠和猴CTGF的结合特异性进行了评价。在此，使用与实施例4所述的方法同样的方法，但作为二次抗体，使用以含有0.1 % BSA的TBST清洗液稀释5000倍的辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体(HRP-rabbit ant1-human IgG antibody ;丹科公司)。使用复孔对各抗体进行试验，通过曲线拟合分析EC50。
[0116]其结果可知，任何一种完全人型抗体对人、小鼠、大鼠和猴CTGF均具有相同程度的结合能力。
[0117]表1:完全人型抗体对各种CTGF的结合活性
[0118]
【权利要求】
1.一种抗人CTGF抗体，其包含由序列号10所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
2.如权利要求1所述的抗人CTGF抗体，其中，所述抗体的重链恒定区为人IgY I恒定区。
3.如权利要求1所述的抗人CTGF抗体，其中，所述抗体的轻链恒定区为人IgK恒定区。
4.如权利要求1所述的抗人CTGF抗体，其中，所述抗体的重链恒定区为人IgYI恒定区，所述抗体的轻链恒定区为人IgK恒定区。
5.如权利要求1所述的抗人CTGF抗体，其包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号8所示的氨基酸序列构成的轻链。
6.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1所述的抗体的重链可变区的序列。
7.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1所述的抗体的轻链可变区的序列。
8.—种表达载体,其包含权利要求6和/或7所述的多核苷酸。
9.一种经权利要求8所述的表达载体转化的宿主细胞。
10.如权利要求9所述的宿主细胞，其选自由以下的(a)和(b)组成的组: (a)经含有包含编码权利要求1所述的抗体的重链可变区的序列的多核苷酸和包含编码该抗体的轻链可变区的序列的多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞；和 (b)经含有包含编码权利 要求1所述的抗体的重链可变区的序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码该抗体的轻链可变区的序列的多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞。
11.一种生产权利要求1所述的抗人CTGF抗体的方法，其包含对权利要求9或10所述的宿主细胞进行培养以使其表达抗人CTGF抗体的步骤。
【文档编号】C07K16/22GK104011206SQ201280063995
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2011年12月22日
【发明者】岩崎正司, 守屋隆一, 吉野正康, 高仓浩二 申请人:安斯泰来制药株式会社