稳定的多抗原结合抗体的利记博彩app
【专利摘要】本发明提供了与多个抗原结合的抗体，所述抗体具有至少两个抗体轻链可变结构域和两个抗体重链可变结构域，其中每个轻链可变结构域与重链可变结构域连接以形成VH/VL构建体，并且其中至少一个所述VH结构域包含AHo位置12、AHo位置103和/或AHo位置144上的具体氨基酸，并且至少一个所述VL结构域包含AHo位置47和/或AHo位置50上的具体氨基酸。还公开了用于表达本发明的重组抗体的核酸分子、载体和宿主细胞、用于分离它们的方法以及所述抗体在医学中的用途。
【专利说明】稳定的多抗原结合抗体
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35U.S.C.§ 119要求2011年10月20日提交的美国临时专利申请号61/549，482的优先权，所述临时专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。
发明领域
[0003]本发明涉及一种稳定的多抗原结合抗体，其具有至少两个抗体轻链可变结构域、两个抗体重链可变结构域，并且缺乏恒定结构域，其中每个轻链可变结构域与重链可变结构域连接以形成VH/VL构建体，并且其中至少一个VH结构域包含AHo位置12、AHo位置103和/或AHo位置144上的具体氨基酸，并且至少一个VL结构域包含AHo位置47和/或AHo位置50上的具体氨基酸。本发明进一步涉及产生此类抗体的方法和包含此类抗体的药物组合物。
[0004]发明背景
[0005]能够与多于一个抗原结合的抗体分子是希望作为用于治疗涉及多种蛋白质的疾病的潜在治疗剂。例如，经常希望以相同的信号传导途径靶向两种蛋白质或通过以每个途径靶向蛋白质来调整两个不同途径的活性。此类抗体的实例包括多特异性抗体(例如，结合两个不同靶分子的双特异性抗体)和多价抗体(例如，结合一个靶分子的两个不同结合位点的二价抗体)。在治疗性抗体的领域中已开发了若干方法使两种治疗性抗体组合到单个分子中，以便利用加性效应或协同效应同时维持稳定性和其它希望的性质。此类方法包括重组形式如串联单链可变片段(TdscFv) (Hagemeyer等，2009，ThrombHaemost 边1: 1012-1019 ;Robinson 等，2008，Br J Cancer幽:1415-1425)、双抗体(diabody)(Hudson 等，1999，J Tmmunol Methods231:177-189)、串联双抗体(Kipriyanov, 2009，Methods Mol Biol562:177-193)、二合一抗体(Bostrom等，2009，Science⑩:1610-1614)以及双重可变结构域抗体(Wu等，2007，NatBiotechno125:1290-1297)。`
[0006]其中两组分治疗方法是有吸引力的疾病的一个实例为脉络膜新血管形成。脉络膜新血管形成的血管组分包括血管内皮细胞、内皮细胞前体以及周细胞。血管外组分(所述血管外组分在组织病理学上看起来是血管生成刺激物的来源并且常常是体积最大的组分)包括炎症性的、神经胶质的和视网膜的色素上皮细胞以及成纤维细胞。组织损伤可以由任一组分引起。每个组分可以通过多种单一疗法来分别靶向。然而，对抗血管内皮生长因子(VEGF)和肿瘤坏死因子(TNF)的双特异性抗体代表同时攻击两个组分的机会。
[0007]与多特异性抗体和多价抗体相关的常见问题是稳定性差，以及关于生产收率、纯度和亲和性的问题。已开发了解决这些问题的各种方法，包括合理设计和定向进化(Mabry和Snavely, 2010，IDrugsl^: 543-549)。然而，此类方法费时并且尚未提供普遍适用的结果。
[0008]因此，本领域存在对多特异性和多价抗体形式的需要，所述多特异性和多价抗体形式是稳定的和可溶的并且缺乏传统多特异性抗体形式和多价抗体形式的缺陷。
[0009]发明概述[0010]本发明提供了与多个抗原结合的抗体，如双特异性抗体和二价抗体，所述抗体在可变重链和/或可变轻链中的具体位置上包含某些氨基酸残基，所述抗体为高度稳定的分子。
[0011]一方面，本发明提供了多抗原结合抗体分子，其包含:
[0012]a)两个重链可变结构域，一个对抗原A具有特异性(VH-A)并且一个对抗原B具有特异性(VH-B)，以及
[0013]b)两个轻链可变结构域，一个对抗原A具有特异性(VL-A)并且一个对抗原B具有特异性(VL-B)，
[0014]其中所述两个重链可变结构域中的至少一个包含以下至少一种:AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的丝氨酸或苏氨酸以及AHo位置144上的丝氨酸或苏氨酸；和/或其中所述两个轻链可变结构域中的至少一个包含AHo位置50上的精氨酸。
[0015]在某些方面中，VH-A与VL-A连接以形成对抗原A具有特异性的单链抗体(scFvA)，并且VH-B与VL-B连接以形成对抗原B具有特异性的单链抗体(scFv B)。
[0016]一方面，本发明提供了多抗原结合抗体分子，其包含:对抗原A具有特异性的重链可变结构域(VH-A)，其通过肽接头I与对抗原B具有特异性的轻链可变结构域(VL-B)连接以形成VH-A/VL-B构建体；对抗原B具有特异性的重链可变结构域(VH-B)，其通过肽接头2与对抗原A具有特异性的轻链可变结构域(VL-A)连接以形成VH-B/VL-A构建体；其中多抗原结合抗体缺乏恒定结构域，VL-A和VL-B中的至少一个包含AHo位置50上的精氨酸，并且VH-A和VH-B中的至少一个包含以下至少一种:AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的丝氨酸或苏氨酸以及AHo位置144上的丝氨酸或苏氨酸。
[0017]在某些方面中，VH-A/VL-B构建体处于VH-A-(接头I) -VL-B取向或VH-B-(接头
`I)-VL-A取向。在其它方面中，VH-B/VL-A构建体处于VH-B-(接头2) -VL-A取向或VH-A-(接头2)-VL-B取向。
[0018]另一方面，VL-A或VL-B中的至少一个包含与SEQ ID NO:6的序列具有至少65%同一性的框架序列。
[0019]另一方面，VH-A或VH-B中的至少一个包含与SEQ ID NO: 7的序列具有至少80%同一性的框架序列。
[0020]另一方面，VL-A/VH-B和VH-B/VL-A构建体中的至少一个包含人V κ I家族轻链可变区、人νλ I家族轻链可变区或人VK 3家族轻链可变区。
[0021]另一方面，VL-A/VH-B和VH-B/VL-A构建体中的至少一个包含人VH3家族重链可变区、人VHla家族重链可变区或人VHlb家族重链可变区。
[0022]另一方面，VH结构域和VL结构域包含来自兔类动物的CDR。
[0023]另一方面，本发明进一步提供了多抗原结合抗体，其包含:
[0024]a)包含对抗原A具有特异性的重链可变结构域(VH-A)的单链抗体，所述对抗原A具有特异性的重链可变结构域通过肽接头3与对抗原A具有特异性的轻链可变结构域(VL-A)连接以形成scFv-A ；
[0025]b)包含对抗原B具有特异性的重链可变结构域(VH-B)的单链抗体，所述对抗原B具有特异性的重链可变结构域通过肽接头3与对抗原B具有特异性的轻链可变结构域(VL-B)连接以形成scFv-B ；[0026]其中scFv-A通过肽接头I与scFv_B连接，并且VL-A和VL-B中的至少一个包含AHo位置50上的精氨酸，并且VH-A和VH-B中的至少一个包含以下至少一种:AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的丝氨酸或苏氨酸以及AHo位置144上的丝氨酸或苏氨酸。
[0027]—方面，本发明的多抗原结合抗体包含以下列形式的对抗原A具有特异性的单链抗体和对抗原B具有特异性的单链抗体:VH-A/VL-A-接头-VH-B/VL-B。在一个优选的方面中，接头具有20个氨基酸。在另一个优选的方面中，接头的序列为SEQ ID N0:4。
[0028]在又一个方面中，本发明提供了多抗原结合抗体分子，其包含:来自兔类动物的CDR ;对抗原A具有特异性的重链可变结构域(VH-A)，其通过肽接头I与对抗原B具有特异性的轻链可变结构域(VL-B)连接以形成VH-A/VL-B构建体；对抗原B具有特异性的重链可变结构域(VH-B)，其通过肽接头2与对抗原A具有特异性的轻链可变结构域(VL-A)连接以形成VH-B/VL-A构建体；其中至少一个重链可变结构域包含以下至少三种:AHo位置24上的苏氨酸⑴、AHo位置25上的缬氨酸(V)、AHo位置56上的丙氨酸⑷或甘氨酸(G)、AHo位置82上的赖氨酸⑷、AHo位置84上的苏氨酸⑴、AHo位置89上的缬氨酸(V)以及AHo位置108上的精氨酸(R)。在某些方面中，此类抗体在至少一个可变轻链结构域中进一步包含AHo位置I上的谷氨酸(E)、AHo位置3上的缬氨酸(V)、AHo位置4上的亮氨酸(L)、AHo位置10上的丝氨酸⑶、AHo位置47上的精氨酸(R)、AHo位置57上的丝氨酸⑶、AHo位置91上的苯丙氨酸(F)和/或AHo位置103上的缬氨酸(V)。
[0029]本发明的具体优选实施方案将从下列某些优选实施方案和权利要求书的更详细描述中变得明显。
[0030]详述
[0031]本文示出的细节是作为实施例并且仅出于对本发明的优选实施方案的说明性讨论的目的，并且之所以呈现这些细节，是为了提供认为是本发明的各种实施方案的原理和概念方面的最有用和易理解的描述的内容。在这点上，除对于本发明的基本理解所必需的之外，没有企图更详细地示出本发明的结构细节，借助于附图和/或实施例所作的描述使得本领域技术人员明了如何可以在实践中实施本发明的若干形式。
[0032]为了使本发明可以更易理解，如下并且如贯穿详述所列举来定义某些术语。定义和解释意指并且旨在控制任何未来构建，除非在以下实施例中明确并毫无疑问地被修改或是当含义的应用使得任何构建无意义或基本上无意义。在术语的构建将使它无意义或基本上无意义的情况下，定义应该从韦氏字典(Webster’s Dictionary),第3版或本领域技术人员已知的字典如生物化学和分子生物学牛津字典(Ed.Anthony Smith,牛津大学出版社,Oxford, 2004)中取得。
[0033]本发明的总体目的是为了提供适合用于治疗性使用的能够结合多个抗原的抗体。如本文第一次所描述，当某些氨基酸存在于轻链可变结构域和重链可变结构域中的具体位置上时，此类抗体的性质可以改进。此类改进的性质包括例如增加的稳定性、生产收率和纯度。
[0034]因此，本发明提供了结合多个抗原的抗体，所述抗体包含:
[0035]a)对抗原A具有特异性的重链可变结构域(VH-A)，其通过肽接头I与对抗原B具有特异性的轻链可变结构域(VL-B)连接以形成VH-A/VL-B构建体；
[0036]b)对抗原B具有特异性 的重链可变结构域(VH-B)，其通过肽接头2与对抗原A具有特异性的轻链可变结构域(VL-A)连接以形成VH-B/VL-A构建体；
[0037]其中VL-A和VL-B中的至少一个包含AHo位置47和/或AHo位置50上的精氨酸，并且VH-A和VH-B中的至少一个包含AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的丝氨酸或苏氨酸和/或AHo位置144上的丝氨酸或苏氨酸。在一个实施方案中，VL包含AHo位置50上的精氨酸，并且VH包含AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的苏氨酸以及AHo位置144上的苏氨酸。
[0038]在一个优选的实施方案中，本发明的抗体为缺乏恒定结构域的多抗原结合抗体，如scFv抗体。
[0039]术语“scFv”是指包含由接头连接的抗体重链可变结构域(或区；VH)和抗体轻链可变结构域(或区；VL)并且缺乏恒定结构域的分子。此类scFv分子可以具有一般结构:NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-C00H。适合的接头描述在本文中并且为本领域技术人员所已知，包括例如描述在国际专利申请W02010/006454中的接头。
[0040]如本文所使用，“多抗原结合抗体”是具有至少四个可变结构域并且可以结合不同靶分子的两个或更多个抗原(例如，双特异性抗体)或相同靶分子的两个或更多个抗原(例如，二价抗体)的抗体。本发明的多抗原结合抗体的形式包括，但不限于本领域技术人员所已知的双抗体、单链双抗体以及串联抗体。
[0041]如本文所使用的“双特异性抗体”是可以结合两种不同靶分子的抗体。
[0042]如本文所使用的“二价抗体”是可以结合一种靶分子的两个不同位点的抗体。
[0043]在某些实 施方案中，本发明的多抗原结合抗体的VL在本文已示出改进多抗原结合抗体形式的稳定性的至少一个具体位置中包含至少一个具体氨基酸，并且本发明的多抗原结合抗体的VH在本文已示出改进多抗原结合抗体形式的稳定性的三个具体位置的至少一个中包含三种具体氨基酸的至少一种。在一个具体实施方案中，VL中的位置为AHo位置50和/或AHo位置47，并且在所述一个或多个位置上的氨基酸为精氨酸。在另一个具体实施方案中，VH中的位置为AHo位置12、AHo位置103和AHo位置144，并且在所述位置上的优选氨基酸为:AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的丝氨酸或苏氨酸以及AHo位置144上丝氨酸或苏氨酸。在一个优选实施方案中，VH中的氨基酸为AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的苏氨酸以及AHo位置144上的苏氨酸。在某些实施方案中，这些优选的氨基酸可以通过在一个或多个所鉴别的位置上取代天然存在的氨基酸来引入到VL和/或VH中。
[0044]AHo 编号系统进一步描述在 Honegger, A.和 Pluckthun, A.(2001) J.Mol.Biol.309:657-670 中。或者，可以使用如在 Kabat 等(Kabat, Ε.A.,等(1991) Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第五版，U.S.Department of Health andHuman Services, NIH出版号91-3242)中进一步描述的Kabat编号系统。针对用来鉴别抗体重链可变区和轻链可变区中的氨基酸残基位置的两种不同编号系统的转换表提供在A.Honegger, 2001, J.Mol.Biol.309:657-670 中。对于 VL 中的 AHo 位置 47 的对应 Kabat 编号为39。对于VL中的AHo位置50的对应Kabat编号为42。对于VH中的AHo位置12的对应Kabat编号为11。对于VH中的AHo位置103的对应Kabat编号为89。对于VH中的AHo位置144的对应Kabat编号为108。
[0045]在另一个实施方案中，本发明提供了多抗原结合抗体，其在本文所公开的优选位置上包含一个或多个优选氨基酸并且其包含至少两种抗体或其抗体片段(包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv)的结合特异性。此类抗体还可以是轻链或重链二聚体、或其任何最小片段，如在Ladner等的美国专利号4，946，778中所描述的Fv或单链构建体，所述专利的内容以引用的方式明确并入。在某些实施方案中，此类多抗原结合抗体包含:至少一个VL，其具有AHo位置50上的精氨酸；和至少一个VH，其具有AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的丝氨酸或苏氨酸以及AHo位置144上的丝氨酸或苏氨酸。
[0046]接头和VH/VL构建体
[0047]如本文所使用，“肽接头I”和“肽接头2”是指使VH/VL构建体中的可变结构域彼此连接或使一个或多个scFv构建体连接在一起的接头肽。“VH/VL构建体”可以是:VH-A/VL-B或VH-B/VL-A构建体，其包含具有与具体抗原结合的CDR的VH结构域和具有与不同抗原结合的CDR的VL结构域；或VH-A/VL-A或VH-B/VL-B构建体，其包含具有与具体抗原结合的CDR的VH结构域和具有与相同抗原结合的CDR的VL结构域。此类构建体的形式可以是VH-L-VL或VL-L-VH，其中L为肽接头I或肽接头2。此类肽接头的长度优选地小于或等于约20个氨基酸。具体来说，此类肽接头的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在某些实施方案中，肽接头的长度为3至7个氨基酸。针对肽接头I和/或肽接头2，优选的接头序列为GGGGS (SEQ ID NO:1)。适用作本发明的多抗原结合抗体中的肽接头I和/或肽接头2的其它接头序列包括:GGS和GGGGGGS (SEQ ID N0:2)。在某些实施方案中，VH/VL构建体可以是单链抗体。单链抗体中的接头是本领域中已知的。优选地，在本发明的抗体中连接与优选抗原结合的VH和VL结构域的单链抗体的接头可以是高达20个氨基酸，例如序列为以下示出的SEQ ID N0:4。
[0048]在某些实施方案中，VH/VL构建体通过肽接头3连接至另一个VH/VL构建体。在其它实施方案中，VH/VL构建体中的可变结构域通过肽接头3彼此连接。肽接头3的长度优选地大于约10个氨基酸并且小于约30个氨基酸。具体来说，肽接头3的长度为10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些实施方案中，肽接头3的长度为10至15个氨基酸。针对肽接头3，优选的接`头序列为GSDSNAGRASAGNTS(SEQ ID NO:3)。针对肽接头3，另一个优选的接头序列为(GGGGS)4(SEQ ID N0:4)。本领域技术人员将认识到，可以对接头序列作出保守改变(例如，取代)而不影响本发明的多抗原结合抗体的活性和优选性质。
[0049]在某些实施方案中，VH/VL构建体可以处于以下形式之一:VH-A-(接头I或接头2)-VL-B ;VH-B-(接头 I 或接头 2)-VL-A ;VH_A-(接头 I 或接头 2)-VL-A ;VH_B-(接头 I 或接头2) -VL-B ；VL-A-(接头I或接头2) -VH-A ；VL-B-(接头I或接头2) -VH-B。本领域技术人员可以想到VH/VL构建体中的VH和VL结构域的其它取向。例如，VL-A-(接头I或接头
2)-VH-B,VL-B-(接头 I 或接头 2) -VH-A、VL_A-(接头 I 或接头 2) -VH-A、VL_B-(接头 I 或接头2) -VH-B。在其中VH/VL构建体通过肽接头3连接的具体实施方案中，可以形成以下形式之一:VH-A-(接头-1) -VL-A-(接头 3) -VH-B-(接头 2) -VL-B ；VH-A-(接头-1) -VL-B-(接头
3)-VH-B-(接头 2) -VL-A ；VL-A-(接头-1) -VH-B-(接头 3) -VL-B-(接头 2) -VH-A ；VL-A-(接头-1)-VH-A-(接头3)-VL-B-(接头2)-VH-B。本文所鉴别的形式为非限制性实例，并且应该易理解本领域技术人员可以各种其它取向布置VH和VL结构域，只要当构建体产生并且适当折叠时实现靶抗原的结合。[0050]在一个实施方案中，本发明的多抗原结合抗体包含以下列形式的对抗原A具有特异性的单链抗体和对抗原B具有特异性的单链抗体:VH-A/VL-A -接头3 - VH-B/VL-B，其中接头3的序列为SEQ ID NO:4。
[0051]在一个实施方案中，本发明的多抗原结合抗体的优选形式为:VH-A-SEQ IDNO:1-VL-B-SEQ ID NO:4-VH-B-SEQ ID N0:l-VL-Ao
[0052]或者，本发明的VH/VL构建体可以彼此功能性地连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或以另外的方式)以形成多抗原结合抗体。
[0053]本发明提供了结合多个抗原的抗体。如本文所描述，此类抗体可以与不同靶分子结合(例如，对至少两种不同蛋白具有特异性的双特异性抗体)或与相同靶分子上的不同表位结合(例如，对相同蛋白具有特异性但结合所述蛋白上的两个或更多个结合位点的二价抗体)。本领域技术人员可以根据需要来选择一个或多个具体的靶分子。
[0054]作为实例而不是限制，本发明提供了对本文实施例中所描述的VEGF和TNFa具有特异性的双特异性抗体。这样一种抗体对治疗希望抑制VEGF和TNF a的疾病有用。
[0055]在某些实施方案中，抗-VEGF/TNFa抗体可以用于以下各项的治疗中:年龄相关的黄斑变性、脉络膜新血管形成、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、晶状体后纤维增生症、乳癌、肺癌、胃癌、食管癌、结肠直肠癌、肝癌、卵巢癌、昏迷、男性细胞瘤(arrhenoblastomas)、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫内膜增生症、子宫内膜异位症、纤维肉瘤、绒毛膜癌、头颈癌、鼻咽癌、喉癌、肝母细胞瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、黑素瘤、皮肤癌、血管瘤、海绵状血管瘤、成血管细胞瘤、胰腺癌、成视网膜细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、神经鞘瘤、少突神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、甲状腺癌、肾母细胞瘤(Wilm’s tumor)、肾细胞癌、前列腺癌、与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)、梅格斯综合症(Meigs’ syndrome)、类风湿性关节炎、银屑病、动脉粥样硬化、一般炎症的慢性和/或自身免疫状态、一般免疫介导的炎症性病症、炎症性CNS疾病、累及眼睛、关节、皮肤、粘膜、中枢神经系统、胃肠道、`泌尿道或肺的炎症性疾病、一般葡萄膜炎的状态、视网膜炎、HLA-B27+葡萄膜炎、白塞氏病(Behcet’s disease)、干眼综合症、青光眼、干燥综合症
(Sjogren syndrome)、糖尿病(包括糖尿病性神经病变)、胰岛素抗性、一般关节炎的状
态、类风湿性关节炎、骨关节炎、反应性关节炎和莱特尔氏综合症(Reiter’s syndrome)、幼年型关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化、格林-巴利综合症(Guillain-Barre syndrome)、重症肌无力、肌萎缩性侧索硬化、类肉瘤病、肾小球性肾炎、慢性肾脏疾病、膀胱炎、银屑病(包括银屑病性关节炎)、化脓性汗腺炎、脂膜炎、坏疽性脓皮病、SAPHO综合症(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨质增生和骨炎)、痤疮、Sweet综合症、天疱疮、克罗恩氏病(Crohn’ sdisease)(包括肠外表现)、溃疡性结肠炎、支气管哮喘、过敏性肺炎、一般过敏、过敏性鼻炎、过敏性鼻窦炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺纤维化、韦格纳肉芽肿病(Wegener’ sgranulomatosis)、川崎综合症(Kawasaki syndrome)、巨细胞动脉炎、丘-施二氏血管炎(Churg-Strauss vasculitis)、结节性多动脉炎、灼伤、移植物抗宿主疾病、宿主抗移植物反应、器官或骨髓移植后的排斥发作、一般血管炎的全身和局部状态、系统性和盘状红斑狼疮、多肌炎和皮肌炎、硬皮病、先兆子痫、急性和慢性胰腺炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、手术后炎症如眼睛手术后(例如白内障(眼睛晶状体替换)或青光眼手术)、关节手术(包括关节镜手术)、在关节相关的结构(例如，韧带)处的手术、口腔和/或牙齿手术、微创心血管手术(例如PTCA、粥样斑块切除术、支架置入术)、腹腔镜和/或内窥镜腹内和妇科检查过程、内窥镜泌尿科检查过程(例如，前列腺手术、输尿管镜检查、膀胱镜检查、间质性膀胱炎)或一般围术期炎症(预防)、阿尔茨海默病(Alzheimer disease)、帕金森氏病(Parkinson，s disease)、亨廷顿氏病(Huntington，s disease)、贝尔氏麻痹(Bell，palsy)、克-雅病(Creutzfeld-Jakob disease)。癌症相关性骨质溶解、癌症相关性炎症、癌症相关性疼痛、癌症相关性恶病质、骨转移、急性和慢性疼痛(无论这些是否是由TNFa的中枢或外周效应所造成以及它们是否归类为炎症性、伤害性或神经性疼痛)、坐骨神经痛、下背部疼痛、腕管综合征、复合区域性疼痛综合征(CRPS)、痛风、疱疹后神经痛、纤维肌痛、局部疼痛状态、由转移性肿瘤造成的慢性疼痛综合征、痛经。细菌、病毒或真菌性脓毒症、结核病、AIDS、动脉粥样硬化、冠状动脉病、高血压、血脂异常、心功能不全以及慢性心力衰竭。
[0056]本发明的抗体与它们特异性的靶抗原的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如，生长抑制)或通过免疫印迹测定来证实。每个这些测定一般通过采用对感兴趣的复合体有特异性的标记试剂(例如，抗体)来检测特别感兴趣的蛋白质-抗体复合体的存在。或者，可以使用任何多种其它免疫测定来检测复合体。例如，抗体可以被放射性标记并且用于放射性免疫测定(RIA)中(参见，例如 Weintraub, B.，Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986，所述参考文献以引用的方式并入本文)。可以通过如使用Y计数器或闪烁计数器这样的方式或通过放射自显影术来检测放射性同位素。
[0057]出于许多目的，包括治疗性和诊断性目的，本发明的抗体是有用的。
[0058]VL和VH结构域的特征
[0059]在某些实施方案中，本发明的多抗原结合抗体的VL和VH包含来自人抗体、非人抗体(如在啮齿动物、非人灵长动物、兔类动物或任何其它适合的动物中产生的抗体)、嵌合抗体、人源化抗体以及类似的抗体的CDR。在一个具体实施方案中，CDR来自兔类动物。
[0060]术语“兔类动物”是指分类的兔形目的成员，包括兔科(例如野兔和兔)和鼠兔科(鼠兔)。在一个最优选的实施方案中，兔类动物为兔。如本文所使用的术语“兔”是指属于兔科的动物。
[0061]术语“⑶R”是指主要促成抗原结合的在抗体的可变结构域内的六个高变区之一。针对六个CDR最常使用的定义之一通过Kabat E.A.等(1991, Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Pub I i cat ion91-3242)来提供。在一些情况下，CDR 的 Kabat的定义可以仅应用于轻链可变结构域(⑶R LlXDR L2、⑶R L3、*L1、L2、L3)的⑶R1XDR2和⑶R3以及重链可变结构域(⑶R H2、⑶R H3、或H2、H3)的⑶R2和⑶R3，而重链可变结构域(⑶R Hl或Hl)的⑶Rl由以下残基(Kabat编号)定义:重链的⑶Rl始于位置26并且在位置36之前结束。这种定义基本上是如Kabat和Chothia所不同定义的⑶R Hl的融
八
口 ο
[0062]在一个实施方案中，本发明的多抗原结合scFv抗体中的VL包含与以下序列(SEQID NO:5)具有至少65%同一性、更优选地至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、更优选地99%同一性的序列:
[0063]EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC (X) n=1_50WYQQKPGRAPKLLIY (X) n=1_50GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC (X) n=1_50FGQGTKLTVLG
[0064]在另一个实施方案中，本发明的多抗原结合scFv抗体的VH包含与以下序列(SEQID NO:6)具有至少 80% 同一性、更优选地至少 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、更优选地99%同一性的序列:
[0065]EVQLVESGGGLVQPGGSLSLSCTAS (X) n=1_50ff VRQAPGKCLEff VG (X) n=1_50RFT ISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (X) n=1_50WGQGTLVTVSS
[0066]如本文所使用，X残基为CDR插入位点。X可以是任何天然存在的氨基酸；可以存在至少三个或高达50个氨基酸。SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6的框架序列被认为是没有X残基的序列。
[0067]在本发明的多抗原结合抗体中有用的适合的抗体框架包括，但不限于:人Vk I家族轻链可变区、人V λ I家族轻链可变区、人V K 3家族轻链可变区、人VH3家族重链可变区、人VHla家族重链可变区以及人VHlb家族重链可变区，其中轻链可变区具有或已被工程化具有(例如通过取代天然存在的氨基酸)AHo位置47和/或AHo位置50上的精氨酸,并且重链可变区具有或已被工程化具有(例如通过取代天然存在的氨基酸)AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的丝氨酸或苏氨酸以及AHo位置144上的丝氨酸或苏氨酸。
[0068]可以用来产生本发明的多抗原结合抗体的框架的非限制性实例包括公开在国际专利申请W02008/004834、国际专利申请W02009/155726和国际专利申请W003/097697中的那些框架，所述国际专利申请的整个内容以引用的方式并入。在此类实例中，轻链可变区可以被修饰以包括AHo位 置47和/或AHo位置50上的精氨酸，并且重链可变区可以被修饰以包括AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的丝氨酸或苏氨酸、和/或AHo位置144上的丝氨酸或苏氨酸。
[0069]如本文所使用的术语“抗体框架”或“框架”是指可变结构域VL或VH的部分，其充当用于此可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。本质上，它是不具有CDR的可变结构域。
[0070]如本文所使用，“同一性”是指在两个多肽、分子之间或在两个核酸之间匹配的序列。当两个比较的序列中的位置被相同碱基或氨基酸单体亚单元(例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的位置被赖氨酸占据)占据时，则在所述位置上各自的分子是相同的。两个序列之间的“百分比同一性”是由两个序列共有的匹配位置的数目除以所比较的位置的数目乘以100的函数。例如，如果两个序列中的10分之6的位置匹配,那么两个序列具有60%同一性。作为实例，DNA序列CTGACT与CAGGTT共有50%同一性出分之3的总位置匹配)。通常，当比对两个序列以得到最大同一性时进行比较。此类比对可以使用例如Needleman等(1970) J.Mol.Biol.坚:443-453的方法来提供，通过如比对程序(DNAstar，Inc.)的计算机程序来方便地实现。两个氨基酸序列之间的百分比同一性还可以使用已并入ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和ff.Miller (Comput.Appl.Biosc1., 4:11-17 (1988))的算法，使用 PAMl20 权重残基表、缺口长度罚分为12和缺口罚分为4来确定。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用已并入GCG软件包(在www.gcg.com上可获得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch (J.Mol.Biol.48:444-453 (1970))算法，使用 Blossum62 矩阵或 PAM250 矩阵以及缺口权重为16、14、12、10、8、6或4和长度权重为1、2、3、4、5或6来确定。
[0071 ] 在一个实施方案中，本发明的多抗原结合抗体包含兔类动物CDR和一个或多个重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下的三种、四种、五种、六种或七种=AHo位置24上的苏氨酸⑴、AHo位置25上的缬氨酸(V)、AHo位置56上的丙氨酸(A)或甘氨酸(G)、AHo位置82上的赖氨酸⑷、AHo位置84上的苏氨酸⑴、AHo位置89上的缬氨酸(V)以及AHo位置108上的精氨酸(R)。
[0072]在另一个实施方案中，本发明的多抗原结合抗体在至少一个可变轻链结构域中包含兔类动物⑶R和AHo位置I上的谷氨酸(E) ,AHo位置3上的缬氨酸(V) ,AHo位置4上的亮氨酸(L)、AHo位置10上的丝氨酸⑶、AHo位置47上的精氨酸(R)、AHo位置57上的丝氨酸(S)、AHo位置91上的苯丙氨酸(F)和/或AHo位置103上的缬氨酸(V)。
[0073]核酸分子和载体
[0074]在一个实施方案中，本发明包括用于产生本发明的多抗原结合scFv抗体的核酸分子。
[0075]术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选地是双链DNA。当核酸置于与另一个核酸序列的功能关系中时，所述核酸被“可操作地连接”。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，那么所述启动子或增强子被可操作地连接至编码序列。在某些实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，所述核酸分子编码本发明的抗体、本发明的可变轻链和/或本发明的可变重链。
[0076]在一个实施方案中，本发明的核酸分子编码一个或多个如本文所描述的VH/VL构建体。例如，本发明的核酸分子编码处于以下形式之一的VH/VL构建体:VH-A-(接头I或接头 2) -VL-B ；VH-B-(接头 I 或接头 2) -VL-A ；VH-A-(接头-1) -VL-B-(接头 3) -VH-B-(接头 2) -VL-A ；VH-A-(接头 I 或接头 2) -VL-A ；VH-B-(接头 I 或接头 2) -VL-B ；VH-A-(接头-1) -VL-A-(接头 3) -VH-B-(接头` 2) -VL-B ；VL-A-(接头 I 或接头 2) -VH-B,VL-B-(接头 I或接头 2) -VH-A ；VL-A-(接头-1) -VH-B-(接头 3) -VL-B-(接头 2) -VH-A ；VL-A-(接头 I 或接头 2) -VH-A、VL-B-(接头 I 或接头 2) -VH-B ；VL-A-(接头-1) -VH-A-(接头 3) -VL-B-(接头2)-VH-B ;或本领域技术人员想到的任何其它取向。
[0077]在另一个实施方案中，本发明包括包含根据本发明的核酸分子的载体。
[0078]术语“载体”是指能够将另一个核酸运输至它已连接的核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，所述质粒是指可以将额外的DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以被连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入到宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此类表达载体和分离表达产物的方法通常是本领域技术人员所已知的并且描述在例如Sambrook J.等，MolecularCloning,实验手册第 2 版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 中。
[0079]术语“宿主细胞”是指表达载体已被引入到其中的细胞。宿主细胞可以包括细菌细胞、微生物细胞、植物细胞或动物细胞。易受转化影响的细菌包括肠杆菌科的成员，如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌属(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科,如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);肺炎球菌属；链球菌属以及流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)。适合的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适合的动物宿主细胞系包括CHO细胞(中国仓鼠卵巢系)和NSO细胞。
[0080]用于制备结合多个抗原的抗体的某些方法描述在例如美国专利号7，838，637和美国专利号7，129，330中，所述专利的整个内容以引用的方式明确并入。
[0081]本发明的抗体可以使用重组遗传学领域中的常规技术来产生。已知多肽、编码所述多肽的cDNA的序列可以通过本领域众所周知的方法通过基因合成而产生。这些cDNA可以被克隆到适合的载体质粒中。
[0082]应该理解，本发明的抗体包含所公开的序列而不是本发明的抗体由所公开的序列组成。例如，克隆策略可能要求从N-末端处存在一个或几个额外的残基的抗体中制得构建体。确切来说，在翻译后没有被裂解的情况下，衍生自起始密码子的甲硫氨酸可以存在于最终蛋白质中。用于scFv抗体的大多数构建体在N-末端处产生额外的丙氨酸。
[0083]药物组合物
[0084]在某些实施方案中，本发明提供了包含一种或多种本发明的多抗原结合抗体连同至少一种生理上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。药物组合物可以包含例如以下各项中的一种或多种:水、缓冲液(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、乙醇、矿物油、植物油、二甲亚砜、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、佐剂、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、螯合剂如EDTA或谷胱甘肽和/或防腐剂。
[0085]载体是可以在向患者施用之前与抗体缔合的物质，经常出于控制化合物的稳定性或生物可利用性的目的。在此类制剂内使用的载体通常是生物相容的，并且还可以是生物可降解的。载体包括例如，一价分子或多价分子如血清白蛋白(例如，人或牛)、卵白蛋白、肽、聚赖氨酸和多糖 如氨基葡聚糖以及聚酰胺基胺。载体还包括固体支撑材料如珠粒和微粒，包含例如聚乳酸聚乙醇酸酯、聚(丙交酯-乙交酯共聚物)、聚丙烯酸酯、胶乳、淀粉、纤维素或葡聚糖。载体可以多种方式承载化合物，包括共价结合(直接地或经由接头基团)、非共价相互作用或混合。
[0086]药物组合物可以被配制用于任何适当方式的施用，包括例如眼部施用、鼻内施用、耳部施用、舌下施用、经皮施用、局部施用、口服施用、鼻部施用、直肠施用或肠胃外施用。在某些实施方案中，处于适合用于口服使用的形式的组合物是优选的。此类形式包括例如，丸剂、片剂、锭剂、糖锭、水性混悬剂或油性混悬剂、可分散的粉剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊、或糖浆剂或酏剂。在又另外的实施方案内，本文提供的组合物可以被配制成冻干剂。如本文所使用的术语肠胃外包括皮下注射、皮肤内注射、血管内(例如，静脉内)注射、肌肉内注射、脊柱注射、颅内注射、鞘内注射和腹膜内注射、以及任何类似的注射或输注技术。
[0087]在某些实施方案中，本发明的抗体可以通过眼部组织注射直接递送至眼睛，所述眼部组织注射如眼周注射、结膜注射、筋膜(subtenon)注射、前房内注射、玻璃体内注射、眼内注射、视网膜下注射、结膜下注射、眼球后注射或小管内注射；通过使用导管或其它放置装置如视网膜丸、眼内插入物、栓剂或包含多孔、无孔或凝胶状材料的植入物；通过局部滴眼药或药膏；或通过穹窿(cul-de-sac)中或邻近巩膜(经巩膜)植入的或在巩膜(巩膜内)中或眼睛内的缓释装置来直接施加至眼睛。前房内注射可以穿过角膜进入前房以允许药剂(agent)到达小梁网。小管内注射可以进入巩膜静脉窦的排水静脉收集通道或进入巩膜静脉窦。
[0088]针对眼部递送，本发明的抗体可以与眼科学上可接受的防腐剂、助溶剂、表面活性剂、粘度增强剂、渗透增强剂、缓冲液、氯化钠或水组合以形成水性的无菌眼用混悬液或溶液。可以例如以多剂量形式包装局部眼用产品。因此，可能要求防腐剂来防止使用期间的微生物污染。适合的防腐剂包括:氯丁醇、对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、苯乙醇、乙二胺四乙酸二钠、山梨酸、聚季铵盐-1或本领域技术人员已知的其它试剂。此类防腐剂通常在0.001%w/v至1.0%w/v的水平下采用。本发明的单位剂量组合物将是无菌的，但通常不是防腐的。因此，此类组合物通常将不包含防腐剂。
[0089]在某些实施方案中，意在向眼睛局部施用的组合物被配制成滴眼药或眼药膏，其中抗体的总量将是约0.001%至1.0%(w/w)、优选地约0.01%至约1.0%(w/w)。
[0090]在某些情况下，本发明的药物组合物将作为用于局部施用的溶液施用。基于便于配制以及患者能够借助于将一滴或两滴溶液滴注到所感染的眼睛中来容易地施用此类组合物，水溶液通常是优选的。然而，组合物还可以是混悬液、粘性或半粘性凝胶、或其它类型的固体或半固体组合物。
[0091]意在口服使用的药物组合物可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备，并且可以包含一种或多种试剂如甜味剂、调味剂、着色剂以及防腐剂以便提供诱人可口的制剂。片剂包含与适合用于制造片剂的生理上可接受的赋形剂混合的活性成分。此类赋形剂包括例如，惰性稀释剂(例如，碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠)、成粒剂和崩解剂(例如，玉米淀粉或海藻酸)、粘合剂(例如，淀粉、明胶或阿拉伯胶)以及润滑剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑石)。片剂可以是未包衣的或它们可以通过已知技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并且从而在更长时期内提供持续作用。例如，可以采用时间延迟材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
[0092]可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如，花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或矿物油如液体石蜡中来配制油性混悬液。油性混悬液可以包含增稠剂如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂(如以上列出的那些)和/或调味剂以提供可口的口服制剂。可以通过添加抗氧化剂如抗坏血酸来保存此类混悬液。
[0093]适合用于通过添加水来制备水性混悬液的可分散的粉剂和颗粒剂提供了与分散齐喊润湿剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。通过以上已经提到的那些来举例说明适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂。还可以存在额外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
[0094]药物组合物还可以处于水包油乳剂的形式。油相可以是植物油(例如，橄榄油或花生油)、矿物油(例如，液体石蜡)或其混合物。适合的乳化剂包括天然存在的树胶(例如，阿拉伯树胶或黄蓍树胶)、天然存在的磷脂(例如，大豆、卵磷脂以及衍生自脂肪酸和己糖醇的酯或偏酯)、酸酐(例如，脱水山梨醇单油酸酯)以及衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯与环氧乙烷的缩合产物(例如，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)。乳剂还可以包含一种或多种甜味剂和/或调味剂。 [0095]药物组合物可以被制备成无菌可注射的水性或油性混悬液，其中取决于所使用的媒介物和浓度，调谐剂被悬浮或溶解在媒介物中。可以根据本领域已知的使用适合的分散剂、润湿剂和/或悬浮剂如以上提到的那些来配制这样一种组合物。在可以采用的可接受的媒介物和溶剂中的是水、1，3-丁二醇、林格氏溶液(Ringer’S solution)以及等渗氯化钠溶液。另外，可以采用无菌、不挥发性油(fixed oil)作为溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，可以在可注射组合物的制备中使用脂肪酸如油酸，并且可以将佐剂如局部麻醉剂、防腐剂和/或缓冲剂溶解在媒介物中。
[0096]药物组合物可以被配制成持续释放制剂(即，施用后影响调谐剂的缓慢释放的制剂如胶囊)。此类制剂通常可以使用众所周知的技术来制备，并且通过例如经口植入、直肠植入或皮下植入或通过在希望的靶部位处植入来施用。用于在此类制剂内使用的载体是生物相容的并且还可以是生物可降解的；优选地，所述制剂提供相对恒定水平的调谐剂释放。被包含在持续释放制剂内的抗体的量取决于例如植入的部位、释放的速率和预期的持续时间以及待治疗或预防的疾病/病症的本质。
[0097]本文提供的药物组合物优选地以在体液(例如，血液、血浆、血清、CSF、滑液、淋巴液、细胞组织间液、泪液或尿液)中达到足以可检测地与一个或多个靶分子结合并且预防或抑制与一个或多个靶分子相关的疾病/病症的浓度的量施用。如果剂量产生可觉察的患者益处，那么所述剂量被认为是有效的。
[0098]本发明的抗体的适当剂量(“治疗有效量”)将取决于例如待治疗的病状、病状的严重性和进程(无论是出于预防性抑或治疗性目的而施用抗体)、先前疗法、患者的临床史和对抗体的反应、所使用的抗体的类型以及主治医师的判断。所述抗体适合地一次性或经过一系列治疗向患者施用，并且可以从诊断起任何时间向患者施用。所述抗体可以作为唯一治疗或连同适用于治疗讨论中的病状的其它药物或疗法来施用。
[0099]作为一般建议,所施用抗体的治疗有效量将在约0.lmg/kg至约100mg/kg患者体重的范围内，无论是否通过一次或多次施用，所使用抗体的典型范围为(例如)每天施用约
0.3mg/kg至约20mg/kg,更优选约0.3mg/kg至约15mg/kg。然而，其它剂量方案可为有用的。通过常规技术易于监测此疗法的进展。
`[0100]在本发明的另一个实施方案中，提供一种制品，并且任选提供其使用说明，所述制品包括容纳本发明药物组合物的水性药物制剂的容器。合适的容器包括(例如)瓶子、小瓶和注射器。容器可由多种材料(如玻璃或塑料)形成。示例性容器为3-20CC一次性使用的玻璃小瓶。或者，对于多剂量制剂，容器可为3-lOOcc玻璃小瓶。容器容纳制剂，并且容器上或与其相关联的标签可以指示使用指导。制品可进一步包括从商业和用户角度期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器以及带有使用说明的包装说明书。
[0101]在某些实施方案中，本发明提供:
[0102]1.一种多抗原结合抗体分子，其包含:
[0103]a)对抗原A具有特异性的重链可变结构域(VH-A)，其通过肽接头I与对抗原B具有特异性的轻链可变结构域(VL-B)连接以形成VH-A/VL-B构建体；
[0104]b)对抗原B具有特异性的重链可变结构域(VH-B)，其通过肽接头2与对抗原A具有特异性的轻链可变结构域(VL-A)连接以形成VH-B/VL-A构建体；
[0105]其中所述多抗原结合抗体缺乏恒定结构域，VL-A和VL-B中的至少一个包含AHo位置50上的精氨酸，和/或VH-A和VH-B中的至少一个包含以下至少一种:AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的丝氨酸或苏氨酸以及AHo位置144上的丝氨酸或苏氨酸。
[0106]2.如I所述的多抗原结合抗体，其中VL-A和VL-B中的至少一个包含与SEQ IDNO:5的序列具有至少65%同一性的框架序列。
[0107]3.如I所述的多抗原结合抗体，其中VH-A和VH-B中的至少一个包含与SEQ IDNO:6的序列具有至少80%同一性的框架序列。
[0108]4.如I所述的多抗原结合抗体，其中VL-A/VH-B和VH-B/VL-A构建体中的至少一个包含人V K I家族轻链可变区、人V λ I家族轻链可变区或人V K 3家族轻链可变区。
[0109]5.如I所述的多抗原结合抗体，其中VL-A/VH-B和VH-B/VL-A构建体中的至少一个包含人VH3家族重链可变区、人VHla家族重链可变区或人VHlb家族重链可变区。
[0110]6.如I所述的多抗原结合抗体，其中所述VH结构域和所述VL结构域包含来自兔类动物的⑶R。
[0111]7.如I所述的多抗原结合抗体，其中VH-A和/或VH-B包含AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的苏氨酸以及AHo位置144上的苏氨酸。
[0112]8.如I所述的多抗原结合抗体，其中VL-A和/或VL-B的所述AHo位置50上的精氨酸通过取代引入。
[0113]9.如I所述的多抗原结合抗体，其中VH-A和/或VH-B的AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的丝氨酸或苏氨酸以及AHo位置144上的丝氨酸或苏氨酸中的至少一个通过取代引入。
[0114]10.如I所 述的多抗原结合抗体，其中肽接头I和肽接头2各具有I至10个氨基酸。
[0115]11.如I所述的多抗原结合抗体，进一步包含肽接头3，其将VH-A/VL-B构建体与VH-B/VL-A构建体连接，肽接头3具有10至30个氨基酸。
[0116]12.如11所述的多抗原结合抗体，其中肽接头I和肽接头2各具有3至7个氨基酸，并且肽接头3具有15至20个氨基酸。
[0117]13.如12所述的多抗原结合抗体，其中肽接头I和肽接头2各具有5个氨基酸，并且肽接头3具有20个氨基酸。
[0118]14.如13所述的多抗原结合抗体，其中肽接头I包含GGGGS (SEQ ID NO:1)的序列，肽接头2包含GGGGS (SEQ ID NO:1)的序列，并且肽接头3包含(GGGGS)4(SEQ ID NO:4)的序列。
[0119]15.如14所述的多抗原结合抗体，其形式为VH-A-SEQ ID N0:1-VL-B-SEQ IDN0:4-VH-B-SEQ ID N0:1-VL_A。
[0120]16.如I所述的多抗原结合抗体，其中所述抗体为二价的。
[0121]17.如I所述的多抗原结合抗体，其中所述抗体为双特异性的。
[0122]18.一种包含如I所述的多抗原结合抗体的药物组合物。
[0123]19.如I所述的多抗原结合抗体用于诊断和/或治疗疾病的用途。
[0124]20.一种编码如I所述的VH-A/VL-B构建体和/或VH-B/VL-A构建体的核酸分子。
[0125]21.一种包含如20所述的核酸分子的载体。
[0126]22.一种包含如21所述的载体的分离的宿主细胞。
[0127]23.一种编码如11所述的抗体的核酸分子。[0128]24.一种包含如23所述的核酸分子的载体。
[0129]25.一种包含如24所述的载体的分离的宿主细胞。
[0130]26.—种多抗原结合抗体，其包含:
[0131]a)包含对抗原A具有特异性的重链可变结构域(VH-A)的单链抗体，所述对抗原A具有特异性的重链可变结构域通过肽接头3与对抗原A具有特异性的轻链可变结构域(VL-A)连接以形成scFv-A ；
[0132]b)包含对抗原B具有特异性的重链可变结构域(VH-B)的单链抗体，所述对抗原B具有特异性的重链可变结构域通过肽接头3与对抗原B具有特异性的轻链可变结构域(VL-B)连接以形成scFv-B ；
[0133]其中scFv-A通过肽接头I与scFv_B连接，并且VL-A和VL-B中的至少一个包含AHo位置50上的精氨酸，并且VH-A和VH-B中的至少一个包含以下至少一种:AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的丝氨酸或苏氨酸以及AHo位置144上的丝氨酸或苏氨酸。
[0134]27.如26所述的多抗原结合抗体，其中VH-A和/或VH-B包含AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的苏氨酸以及AHo位置144上的苏氨酸。
[0135]28.如26所述的多抗原结合抗体，其中VL-A和/或VL-B的所述AHo位置50上的精氨酸通过取代引入。
[0136]29.如26所述的多抗原结合抗体，其中VH-A和/或VH-B的AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的丝氨酸或苏氨酸以及AHo位置144上的丝氨酸或苏氨酸中的至少一个通过取代引入。
[0137]30.如26所述的多抗原结合抗体`，其中肽接头I具有I至10个氨基酸。
[0138]31.如26所述的多抗原结合抗体，其中肽接头3具有10至30个氨基酸。
[0139]32.如26所述的多抗原结合抗体，其中肽接头I具有3至7个氨基酸，并且肽接头3具有15至20个氨基酸。
[0140]33.如26所述的多抗原结合抗体，其中肽接头I具有5个氨基酸，并且肽接头3具有15个氨基酸。
[0141]34.如26所述的多抗原结合抗体，其中VL-A或VL-B中的至少一个包含与SEQ IDNO:6的序列具有至少65%同一性的框架序列。
[0142]35.如26所述的多抗原结合抗体，其中VH-A或VH-B中的至少一个包含与SEQ IDNO:7的序列具有至少80%同一性的框架序列。
[0143]36.如26所述的多抗原结合抗体，其中scFv-A和scFv-B中的至少一个包含人V K I家族轻链可变区、人V λ I家族轻链可变区或人V K 3家族轻链可变区。
[0144]37.如26所述的多抗原结合抗体，其中scFv-A和scFv-B中的至少一个包含人VH3家族重链可变区、人VHla家族重链可变区或人VHlb家族重链可变区。
[0145]38.如26所述的多抗原结合抗体，其中所述VH结构域和所述VL结构域包含来自兔类动物的CDR。
[0146]39.—种多抗原结合抗体分子，其包含:
[0147]a)来自兔类动物的⑶R ；
[0148]b)对抗原A具有特异性的重链可变结构域(VH-A)，其通过肽接头I与对抗原B具有特异性的轻链可变结构域(VL-B)连接以形成VH-A/VL-B构建体；[0149]c)对抗原B具有特异性的重链可变结构域(VH-B)，其通过肽接头2与对抗原A具有特异性的轻链可变结构域(VL-A)连接以形成VH-B/VL-A构建体；以及
[0150]d)具有10至30个氨基酸的肽接头3，其将VH-A/VL-B构建体与VH-B/VL-A构建体连接；
[0151]其中至少一个所述重链可变结构域包含以下的至少三种:AHo位置24上的苏氨酸(T)、AHo位置25上的缬氨酸(V)、AHo位置56上的丙氨酸⑷或甘氨酸(G)、AHo位置82上的赖氨酸⑷、AHo位置84上的苏氨酸⑴、AHo位置89上的缬氨酸(V)以及AHo位置108上的精氨酸(R)，并且肽接头I和肽接头2各具有I至10个氨基酸。
[0152]40.如39所述的多抗原结合抗体，其中VL-A和VL-B中的至少一个包含与SEQ IDNO:5的序列具有至少85%同一性的框架序列。
[0153]41.如39所述的多抗原结合抗体，其中VH-A和VH-B中的至少一个包含与SEQ IDNO:6的序列具有至少90%同一性的框架序列。
[0154]42.如39所述的多抗原结合抗体,其在至少一个可变轻链结构域中进一步包含AHo位置I上的谷氨酸(E)、AHo位置3上的缬氨酸(V)、AHo位置4上的亮氨酸(L)、AHo位置10上的丝氨酸(S)、AHo位置47上的精氨酸(R)、AHo位置57上的丝氨酸(S)、AHo位置91上的苯丙氨酸(F)和/或AHo位置103上的缬氨酸(V)。
[0155]43.如39所述的多抗原结合抗体，其中所述重链可变结构域中的至少一个包含以下至少一种:AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的丝氨酸或苏氨酸以及AHo位置144上的丝氨酸或苏氨酸。
[0156]44.如43所述的多抗原结合抗体，其中VH-A和/或VH-B的AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的 丝氨酸或苏氨酸以及AHo位置144上的丝氨酸或苏氨酸中的至少一个通过取代引入。
[0157]45.如39所述的多抗原结合抗体，其中肽接头I和肽接头2各具有5个氨基酸。
[0158]46.如45所述的多抗原结合抗体，其中肽接头3具有15至20个氨基酸。
[0159]47.如46所述的多抗原结合抗体，其中肽接头I包含GGGGS (SEQ ID NO:1)的序列，肽接头2包含GGGGS (SEQ ID NO:1)的序列，并且肽接头3包含(GGGGS)4(SEQ ID NO:4)的序列。
[0160]48.如47所述的多抗原结合抗体，其形式为VH-A-SEQ ID N0:1-VL-B-SEQ IDN0:4-VH-B-SEQ ID N0:1-VL_A。
[0161]49.如39所述的多抗原结合抗体，其中所述抗体为二价的。
[0162]50.如39所述的多抗原结合抗体，其中所述抗体为双特异性的。
[0163]51.一种包含如39所述的多抗原结合抗体的药物组合物。
[0164]52.如39所述的多抗原结合抗体用于诊断和/或治疗疾病的用途。
[0165]53.一种编码如39所述的VH-A/VL-B构建体和/或VH-B/VL-A构建体的核酸分子。
[0166]54.一种包含如53所述的核酸分子的载体。
[0167]55.一种包含如54所述的载体的分离的宿主细胞。
[0168]本说明书通篇引用的任何专利、专利申请以及文献的内容在此以引用的方式整体并入。[0169]除非上下文另外要求，否则本文使用的单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
实施例
[0170]通过以下实施例进一步说明本公开，所述实施例不应解释为另外限制。本申请通篇引用的所有附图以及所有文献、专利和公布的专利申请的内容明确地以引用的方式整体并入本文。
[0171]实施例1
[0172]衍生自兔抗体的双特异性抗体和二价抗体的分子设计、克隆以及表达。
[0173]编码双特异性抗体和二价抗体的DNA序列通过由数字基因序列进行寡核苷酸合成以及所得片断的后续退火，使用重叠延伸技术而生成。所有序列均针对大肠杆菌密码子使用、GC含量、mRNA 二级结构、密码子和基序重复以及限制性位点进行优化。使用不同氨基酸接头(参见表1)连接来自兔抗体、具有不同特异性的人源化VL结构域与VH结构域。
[0174]表1
【权利要求】
1.一种多抗原结合抗体分子，其包含: a)两个重链可变结构域，一个对抗原A具有特异性(VH-A)并且一个对抗原B具有特异性(VH-B)，以及 b)两个轻链可变结构域，一个对抗原A具有特异性(VL-A)并且一个对抗原B具有特异性(VL-B)， 其中所述两个重链可变结构域中的至少一个包含以下至少一种:AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的丝氨酸或苏氨酸以及AHo位置144上的丝氨酸或苏氨酸；和/或 其中所述两个轻链可变结构域中的至少一个包含AHo位置50上的精氨酸。
2.如权利要求1所述的多抗原结合抗体，其中VH-A通过肽接头I与VL-B连接以形成VH-A/VL-B构建体，并且VH-B通过肽接头2与VL-A连接以形成VH-B/VL-A构建体。
3.如权利要求2所述的多抗原结合抗体，其中所述VH-A/VL-B构建体处于VH-A-(接头D-VL-B 取向。
4.如权利要求2所述的多抗原结合抗体，其中所述VH-B/VL-A构建体处于VH-B-(接头2)-VL-A 取向。
5.如权利要求2所述的多抗原结合抗体，其中肽接头I和肽接头2各具有I至10个氨基酸。
6.如权 利要求5所述的多抗原结合抗体，其中肽接头I的序列为GGGGS(SEQ ID NO:1)并且肽接头2的序列为GGGGS (SEQ ID NO:1)。
7.如权利要求2所述的多抗原结合抗体，其中VH-A/VL-B构建体通过肽接头3进一步与VH-B/VL-A构建体连接。
8.如权利要求7所述的多抗原结合抗体，其中肽接头3具有10至30个氨基酸。
9.如权利要求8所述的多抗原结合抗体，其中肽接头3的序列为(GGGGS)4(SEQIDNO:4)。
10.如权利要求1所述的多抗原结合抗体，其具有形式VH-A-SEQID NO: 1-VL-B-SEQ IDN0:4-VH-B-SEQ ID N0:1-VL_A。
11.如权利要求1所述的多抗原结合抗体，其中所述VH-A与VL-A连接以形成对抗原A具有特异性的单链抗体(scFv A)，并且VH-B与VL-B连接以形成对抗原B具有特异性的单链抗体(scFv B) ο
12.如权利要求11所述的多抗原结合抗体，其中所述scFv-A以下列形式与所述scFv-B 连接:VH-A/VL-A-接头 3-VH-B/VL-B。
13.如权利要求12所述的多抗原结合抗体，其中所述接头3的序列为SEQID N0:4。
14.如权利要求1所述的多抗原结合抗体，其中所述两个轻链可变结构域中的至少一个为人V K I家族轻链可变区或衍生自人V K I家族轻链可变区。
15.如权利要求1所述的多抗原结合抗体，其中所述两个重链可变结构域中的至少一个为人VH3家族重链可变区或衍生自人VH3家族重链可变区。
16.如权利要求1所述的多抗原结合抗体，其中所述VH结构域和所述VL结构域包含来自兔类动物的CDR。
17.如权利要求1所述的多抗原结合抗体，其中VH-A和/或VH-B包含AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的苏氨酸以及AHo位置144上的苏氨酸。
18.如权利要求1所述的多抗原结合抗体，其中VL-A和/或VL-B的所述AHo位置50上的精氨酸通过取代引入。
19.如权利要求1所述的多抗原结合抗体，其中VH-A和/或VH-B的AHo位置12上的丝氨酸、AHo位置103上的丝氨酸或苏氨酸以及AHo位置144上的丝氨酸或苏氨酸中的至少一个通过取代引入。
20.如权利要求1所述的多抗原结合抗体，其中所述抗体为二价的。
21.如权利要求1所述的多抗原结合抗体，其中所述抗体为双特异性的。
22.如权利要求1所述的多抗原结合抗体，其中至少一个所述重链可变结构域包含以下至少三种:AHo位置24上的苏氨酸(T)、AHo位置25上的缬氨酸(V)、AHo位置56上的丙氨酸⑷或甘氨酸(G)、AHo位置82上的赖氨酸⑷、AHo位置84上的苏氨酸⑴、AHo位置89上的缬氨酸(V)以及AHo位置108上的精氨酸(R)。
23.一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的多抗原结合抗体。
24.如权利要求1所述的多抗原结合`抗体用于诊断和/或治疗疾病的用途。
【文档编号】C07K16/46GK103890005SQ201280051247
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年10月19日 优先权日:2011年10月20日
【发明者】A·C·里格勒尔, L·博拉斯, R·索马维拉 申请人:艾斯巴技术-诺华有限责任公司