用于制备具有毒素、佐剂、检测标签和药代动力学半衰期延长剂的蛋白质的岩藻糖连接位 ...的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及一种用于生产在其糖部分和/或氨基酸上具有非典型的岩藻糖类似物之分子的真核细胞。本发明还涉及用于生产具有在其糖部分上的非典型岩藻糖类似物和/或氨基酸之分子的方法并涉及通过所述方法获得的分子。它还涉及一种用于生产包含具有在其糖部分上的非典型岩藻糖类似物和/或氨基酸之分子和药物活性化合物之缀合物的方法，以及通过所述方法获得的缀合物。此外，本发明涉及特定的缀合物。
【专利说明】用于制备具有毒素、佐剂、检测标签和药代动力学半衰期延长剂的蛋白质的岩藻糖连接位点特异性缀合物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及真核细胞，其用于生产具有在其糖部分上的非典型岩藻糖类似物和/或氨基酸的分子。本发明还涉及用于生产具有在其糖部分上的非典型岩藻糖类似物和/或氨基酸的分子的方法以及通过所述方法获得的分子。本发明还涉及用于生产缀合物的方法，所述缀合物包含具有在其糖部分上的非典型岩藻糖类似物和/或氨基酸之分子和药物活性化合物，以及本发明涉及可通过所述方法获得的缀合物。此外，本发明涉及特定的缀合物。
【背景技术】
[0002]目前，插入活性部分的预定连接点对于生物学产物的有效结合起关键作用。蛋白质和功能化合物的缀合通常通过将功能化合物连接至氨基酸残基的侧链来实现。已知的经典生物缀合技术以非位点限制的方式进行，这使得难以避免在关键氨基酸残基处的不期望缀合并且由于缀合反应结局的固有异质性也导致了有关批次间一致性的风险。借助与蛋白质连接的碳水化合物结构之羟基基团的非选择性化学偶联需要苛刻的反应条件并且具有蛋白质的氨基酸侧链中不 希望之修饰的风险。非期望的偶联或修饰可影响的关键残基包含对于维持产物热稳定性和聚集倾向性来说重要的氨基酸侧链。对于抗体来说，不想要的在互补性决定区(CDR)内或邻近的氨基酸侧链的缀合可导致亲和力和异质性抗原结合特性的降低。化学偶联通常是通过蛋白质连接的官能团来实现，例如伯胺、巯基、羰基、碳水化合物、羧酸和羟基。用于经此类官能团偶联的反应性基团包括芳基叠氮化物、碳二亚胺、羰基、双吖丙啶(diazirine)、酰肼、羟甲基膦、亚氨酸酯、异氰酸酯、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-酯)、五氟苯基酯(PFP-酯)、补骨脂素(psoralen)和吡啶基二硫化物。
[0003]可以很容易地在疏基处引导缀合。然而，由于疏基的反应性，在表达的蛋白质中几乎不存在自由巯基。因而自由巯基的直接标记主要是依靠现有二硫键(S-S)的还原。在过去，作为治疗性蛋白质的主要群体之一的抗体已经通过巯基与功能性化合物相偶联。由于重链与轻链之间二硫键的还原发生的频率约为重链与重链之间二硫键还原频率的两倍，所以这种部分还原的方法具有由于轻链丢失而导致蛋白质破碎的风险(Sun，等人，Bioconjug Cheml6:1282-1290 (2005).)。特别的，关键的抗体CH2结构域的热稳定性可能会受到层间二硫键还原的负面影响。从这样的随机型巯基偶联反应生产均质产品是一个相当复杂和低效的过程。cACIO抗体药物缀合物的早期临床前版本一巯基连接的免疫缀合物一涉及每个抗体8个细胞毒性药物分子的连接(Doronina等，Nat.Biotechnol.21 (7):778-84(2003))。通过四个链内二硫键的还原获得实现偶联的半胱氨酸残基(Doronina等人，Nat.Biotechnol.21(7):778-84(2003))。二硫键的不完全还原导致了具有负载的少于八个药物分子/抗体的不完整缀合物的异质混合物(Hamblett等人Effects of drugloading on the antitumor activity of a monoclonal antibody-drug conjugate.Clinical Cancer Research，2004，10 (20):7063-70)。已证实对于巯基偶联的缀合物来说很难实现产品的均一'I"生，并且总产率相当低(Hamblett等人2004)。
[0004]通过赖氨酸残基的氨基进行的偶联也是生产蛋白质和功能性化合物之生物缀合物的常用模式。就在最近，含巯基美登木素生物碱(maytanSinoid)，DMl (美登木醇的N-甲基-N-[3-巯基-1-氧代丙基]-L-丙氨酸酯，临床研究药物美登素(maytansine)的类似物)被用于通过二硫键将美登木素生物碱与抗体相连(Barginear和Budman, 2009)。对于曲妥珠单抗-DM1，使用双功能试剂SMCC(N-琥珀酰亚胺基-4-马来酰亚胺基甲基-环己烷羧酸酯)将DMl连接到曲妥珠单抗。SMCC首先添加到蛋白质上的赖氨酸残基，以产生接头修饰的抗体。SMCC的琥珀酰亚胺基与赖氨酸残基的偶联以随机的方式发生，靶向于抗体所有表面暴露的赖氨酸残基。随后DMl中的巯基与接头的马来酰亚胺基团反应形成不可还原的硫醚键(Barginear和Budman, 2009)。在pH6.5-7.5时，马来酰亚胺与巯基反应形成稳定的硫醚键。然而，在卩11值> 7.5时，马来酰亚胺也与伯胺反应，其可导致产生不希望的共价蛋白质寡聚体。此外，SMCC与抗体的随机偶联导致非均质的生物缀合物产物。抗体重链的C-端赖氨酸容易在上游细胞培养生产期间发生剪切，并因此由于差异性剪切的C-末端赖氨酸残基还可导致偶联异质性。每个曲妥珠单抗-DMl的抗体平均含有3.5个药物分子(Smith SV.Technology evaluation, Hun901_dml, immunogen.Curr Opin Mol Ther2005 ；7:394-401.)，反映了每个抗体0到8个药物分子的典型分布(Blattler WA, Chari RVJ，Vite GD, Altmann KH, Eds.Anticancer Agents-Frontiers in Cancer Chemotherapy,American Chemical Society, Washington2001 ;317_38.)。抗体和功能化合物的化学计量摩尔比是治疗活性和缀合物稳定性的重要决定因素。Kulkarni等(Cancer Research41:2700-2706(1981))发现，对甲氨蝶呤来说所获得的最高效的抗体对毒素比例为每个抗体约10个甲氨蝶呤分子，并且增加药物抗体摩尔比例超过这一阈值的尝试降低了免疫缀合物的产量并且破坏了抗体活性。类似的结果已经由Kanellos等(JNC75:319-329(1985))报道。
[0005]随机偶联的生物缀合物产物的固有不均一性对稳定性研究、批次间一致性和过程中(in-process)分析带来了挑战。只有付出大量的下游努力并且伴随了产率的大量损失才能实现从随机偶联反应生产均质的生物缀合物产物。因此需要具有一个或更多个预定位点的抗体用以按化学计量比连接功能化合物。
[0006]最近,Seattle Genetics Inc.(美国专利申请2008/0305044)描述了这样的用于预定的定点(site-directed)巯基偶联的抗体。尽管这种偶联模式具有定点方法的所有优点，但是三级结构的微小破坏很可能会影响整体产品的热稳定性。
[0007]美国专利申请2010/0254943AMIN0 ACID SUBSTITUTED MOLECULES 以及相关的属于同一专利家族的申请公开了用于获得蛋白质的位点特定缀合物的方法，所述方法通过向蛋白质序列中并入能够实现偶联的非天然氨基酸，并且利用这样的非天然氨基酸残基作为用于进一步化学或生物修饰的锚定位点。非天然氨基酸并入的氨基酸位置由以下密码子来指定:通常用于指定天然氨基酸的密码子(如摆动密码子(wobble codon)、偏好密码子(bias codon)、第六盒密码子(sixth box codon)、4盒密码子(4box codon)或者任意其他宿主细胞或者体外转录系统可以用于指定非天然氨基酸并入位点的有义密码子)，或者由通常是终止密码子(如琥珀(amber)、赭石(ochre)、或蛋白石(opal))或移码密码子。当框内终止密码子用于人工并入非天然氨基酸时，细胞需要敲除同源释放因子(或翻译终止因子)。鉴于现有翻译终止因子之间的冗余性，细胞总是会产生含有所并入的非天然氨基酸的正确全长蛋白质和过早截短版本的靶蛋白两者。这使得生产此类实现偶联之蛋白的方法非常低效，特别是在真核表达系统中，在真核表达系统中释放因子eFRl用作全能的释放因子并识别所有三种终止密码子。尽管这种方法适用于生产能实现位点引导且限定之偶联的蛋白质，但是仍然需要以远远更高的生产效率来生产此类限定的实现偶联的蛋白质。
[0008]连接至天然占据N糖基化位点的聚糖结构通常使得蛋白质构象稳定。所连接的聚糖的尺寸表观上对蛋白质的热稳定性只有极轻微的影响(Shental-Bechor和Levy, 2009),这使得天然N聚糖成为用于缀合功能化合物的理想接头-即使这样的化合物具有大的分子量。据此，美国专利7138371和美国专利申请2010/0048456公开了通过蛋白质连接的糖结构将多肽与聚乙二醇相缀合的方法。这两个文献以及相关的申请和专利都仍然没有解决导致偶联异质性的问题。
[0009]因此，仍然需要均一且稳定的蛋白质-药物活性化合物-缀合物，其中所述药物活性化合物通过精确限定的部分与所述蛋白质偶联。特别地，通过预定的糖连接位点将药物活性化合物与蛋白质定点偶联是理想的。仍然需要用于以高产率生产蛋白质的细胞，所述蛋白质包含此精确限定的偶联部分，并且其允许以高度均一并有效的偶联药物活性化合物，还仍然需要使用所述细胞生产此类蛋白质的方法，以及仍然需要生产包含此类蛋白质和药物活性化合物之缀合物的方法。
[0010]本发明的发明人出乎意料地发现，通过引入到分子(例如脂类或蛋白质)的糖结构中的人工核心岩藻糖类似物可实现将药物活性化合物均一、高效、稳定且定点的与所述分子偶联。他们还出人意料地发现通过连接到已并入或连接至蛋白质(例如糖蛋白)之氨基酸序列的蛋白质-O-岩藻糖基化位点的人工岩藻糖分子可实现将药物活性化合物均一、高效、稳定且定点的与所述蛋白质偶联。特别地，他们提供了允许以高产率生产所述分子(例如蛋白质或脂质)以及所述分子(例如蛋白质或脂质)和药物活性化合物之缀合物的细胞和方法。所生成的缀合物是热稳定的且均一的。该分子可以是糖基化改造的蛋白质、治疗性蛋白质、抗体、疫苗组分、甚至是包含在有包膜病毒的包膜中的蛋白质。有利的总的发明构思是通过下述细胞产生所述分子(例如蛋白质或脂质)，所述细胞为了降低其蛋白质组的固有岩藻糖基化而被改造使得外源添加的岩藻糖优先地在特定位点并入并且这些外源添加的岩藻糖是化学激活的使得药物活性化合物可进一步选择性共价连接到所述分子。添加的药物活性化合物可以是增强或改变所述分子(例如蛋白质如抗体或脂质)性质的化合物，例如其可增加细胞毒性、提高生物半衰期、诱导所述分子靶向特定的组织、防止降解或聚集、诱导或增强固有或获得性免疫、或者提高或降低活病毒的感染性。
[0011]在下文所描述的本发明的一个或更多个方面、实施方案、优选实施方案或更优选的实施方案中，包含分子(例如蛋白质或脂质)的特定岩藻糖类似物，或者具有定点连接的分子(例如蛋白质或脂质)和药物活性化合物的特定的岩藻糖类似物连接的缀合物(例如免疫缀合物)可以具有下列一个或更多个优点:
[0012](I)与蛋白质的几丁二糖核心的岩藻糖基化位点相连的岩藻糖类似物允许偶联有限的且限定数目的药物活性化合物，并且因此使得能够生产均一偶联的缀合物。这有利地影响产品的产率、批次间一致性、治疗效果以及产品的可比性。
[0013](II)所述岩藻`糖类似物对整体蛋白质的热稳定性只有极轻微的影响。因此，可以通过避免无活性的化合物提高治疗效果。[0014](III)由于在合适的天冬酰胺残基附近引入了单个点突变而实现的其他所限定N-糖基化位点的人工引入允许每个蛋白质分子进一步定点偶联其他药物化合物。
[0015](IV)通过与几丁二糖核心的岩藻糖基化位点相连的岩藻糖类似物连接药用活性化合物是有利的，这是因为聚糖的远端部分易受到酶促降解，因此在那些远端位置偶联将导致缀合物的不稳定。将药物活性化合物直接偶联到岩藻糖类似物单糖实现了所述缀合物的化学均一性和偶联稳定性，所述岩藻糖类似物单糖与多肽链中(C聚糖或O-聚糖)或者聚糖结构中限定的位置相连。对于N-连接聚糖，核心岩藻糖(即α-1，6-连接至N-聚糖之几丁二糖核心之第一 N-乙酰葡糖胺残基的还原端的特定岩藻糖残基)构成针对此类N-连接-糖缀合物的可能最短的限定的且均一的糖接头(glyco-linker)。
[0016](V)岩藻糖类似物可添加到培养基中。然后其被常规的细胞摄取并进一步代谢。然而，从丰富的单糖甘露糖(即自身是N聚糖的一部分)起始的岩藻糖从头合成途径(denovo synthetic pathaway)的有效性提供了 90%的⑶P岩藻糖库,甚至是在存在外源岩藻糖的情况下亦如此，以及阻止了岩藻糖类似物有效并入糖蛋白并且不可避免地导致糖蛋白的异质混合物，使得岩藻糖引导偶联处于低水平。出人意料的是，本发明的发明人发现，在含有特定的实现偶联之岩藻糖类似物的培养基中生长的具有中断的岩藻糖生物合成途径的细胞有效地将所述岩藻糖类似物并入在所述细胞中产生的糖蛋白。这导致了均一的糖蛋白混合物，其使得岩藻糖引导偶联处于高水平。此外，本发明人发现了与在未掺入实现偶联的岩藻糖类似物之培养基中生长未修饰亲代细胞系相类似的生长和表现参数。
[0017](VI)与其他依赖于将实现偶联的人工氨基酸或糖并入所产生的蛋白质的偶联技术不同，本文所描述的技术不会遭受此类经修饰蛋白质常见的使得产率下降的相关过程。特别是，本发明人并没有观察到如之前关注岩藻糖炔基或叠氮基岩藻糖之专利申请所描述的核心岩藻糖基化的阻断。与此相反，本发明人观察到叠氮基岩藻糖的意想不到的有效并入。
[0018](VII)结合了岩藻糖类似物的蛋白质和所缀合的药物活性化合物之间的共价化学键是稳定的，对温和还原不 敏感，因此降低了不期望的缀合之部分全身性释放的风险。
[0019](VIII)除了通过所连接的毒素杀伤靶细胞的抗体药物缀合物之外，细胞介导的细胞毒性、抗体依赖的细胞毒性(ADCC)是治疗性抗体(例如IgGl型治疗性抗体)发挥作用的主要机制。这样的抗体分子应当允许偶联毒素或装备成为了有效ADCC。还期望药物缀合的分子无法ADCC，以避免针对效应细胞的毒性。因此,希望毒素连接的缀合物在单一药物中将两种作用原理相结合，特别是如果抗体偶联效率达不到100%。本发明可以提供一种解决方案:经岩藻糖类似物连接的药物会消除效应子功能(例如ADCC)，在本文所公开的细胞中产生的抗体组合物内未偶联的抗体将缺乏岩藻糖并因此提供增强的ADCC。
[0020](IX)如果直接连接到蛋白质之多肽链中的岩藻糖类似物能够实现所述蛋白质和药物活性化合物之间化学上均一的偶联是特别有利的。这在不修饰天然含有单个或多个蛋白质-O-岩藻糖基化位点之蛋白质的情况下实现。对于不含有蛋白质-O-岩藻糖基化位点或含有少于期望的蛋白质-O-岩藻糖基化位点的蛋白质来说，本发明的发明人发现并入EGF样重复(代表这样的位点)是非常理想的。
【发明内容】
[0021]在第一方面，本发明涉及用于生产包含岩藻糖类似物之分子的真核细胞，其中
[0022](i)在所述细胞中从⑶P-D-甘露糖起始的⑶P-L-岩藻糖合成途径被阻断，并且
[0023](ii)所述细胞包含⑶P-L-岩藻糖类似物。
[0024]在第二方面，本发明涉及用于生产包含岩藻糖类似物之分子的方法，包括以下步骤:
[0025](i)提供根据第一方面的真核细胞，和
[0026](ii)从i)中的细胞分离包含岩藻糖类似物的分子。
[0027]在第三方面，本发明涉及包含可通过第二方面的方法获得的岩藻糖类似物的分子。
[0028]在第四方面，本发明涉及用于生产缀合物的方法，所述缀合物包含含有岩藻糖类似物和药物活性化合物的分子，所述方法包括下列步骤:
[0029](i)实施第二方面的方法，和
[0030](ii)通过岩藻糖类似物将药物活性化合物共价地偶联到包含所述岩藻糖类似物的分子。
[0031]在第五方面，本发明涉及通过第四方面获得的包含含有岩藻糖类似物和药物活性化合物之分子的缀合物。
[0032]在第六方面，本发明涉及缀合物，其包含含有一个或更多个以下结构的蛋白质或多肽:
[0033]-NG-cF * -Y0-C,
[0034]其中，每个连接到所述蛋白质或多肽中所包含的N-糖基化位点，
[0035]NG是所述蛋白质或多肽的N-连接的糖部分，
[0036]CF *是核心岩藻糖类似物，
[0037]Y是间隔子单元，其中，O为整数O或1，以及
[0038]C是药物活性化合物。
[0039]在第七方面中，本发明涉及包含蛋白质或多肽的缀合物，所述蛋白质或多肽含有一个或更多个EGF样重复，所述重复包含连接有以下结构的丝氨酸和/或苏氨酸残基:
[0040]-F * -Yp-C，
[0041]其中
[0042]F *是直接O-连接至所述丝氨酸和/或苏氨酸残基的岩藻糖类似物部分，
[0043]Y是间隔子单元，其中P是整数O或1，且
[0044]C是药物活性化合物。
[0045]本
【发明内容】
并没有描述本发明的所有特征。
[0046]发明详述
[0047]在下面对本发明进行详细描述之前，应当理解，本发明不限于本文中描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以有所变化。还应当理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而非意在限制本发明的范围(其仅由所附权利要求所限定)。除非另有定义，本文中使用的所有科技术语均具有与本领域普通技术人员通常所理解相同的含义。
[0048]优选地，本文使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms: (I UPAC Recommendations)”，Leuenberger, H.G.ff, Nagel, B.和 KiHbl，H.编(1995)，, Helvetica Chimica Acta, CH_4010Basel, Switzerland 中所述地定义。
[0049]本说明书全文中引用了几篇文献。本文中引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明、GenBank登录号序列提交等)，无论在上文或下文中，均通过引用以整体并入本文中。本文中的任何内容均不应看作是承认本发明无权借助在先发明而使本发明早于这些公开物。
[0050]下面将描述本发明的要素。这些要素通过具体的实施方案列出，然而，应当理解，它们可以以任意方式和任意数量进行组合以获得额外的实施方案。多方面描述的实施例和优选实施方案不应看作是将本发明仅仅限制为明确描述的实施方案。这种描述应当理解为支持并且涵盖了将明确描述的实施方案与任意数量的公开和/或优选的要素进行组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所描述的所有要素的任意排列和组合应当认为已被本申请的描述公开。本发明的中心在于一种用于高效生产位点特异性岩藻糖连接的糖蛋白缀合物的方法。然而，通过该方法可实现的独特类型产品的特定特征也是重要的并且在实施例1中特别的考虑。
[0051]本说明书和随后的权利要求全文中，除非上下文另有要求，词语“包含”及其变化形式例如“包含”和“包括”，将被理解为暗示包括所声明的整数或步骤或者整数组或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或者其他整数组或步骤组。如本说明书和所附的权利要求书中所使用的，没有数词修饰的指代包括复数指代，除非内容另有明确规定。[0052]在本发明的上下文中，术语“肽”是指通过肽键连接的氨基酸的短聚合物。它具有与蛋白质中的那些相同的肽键，但在长度上通常较短。最短的肽是二肽，由通过单个肽键连接的两个氨基酸组成。也可以有三肽，四肽，五肽等。肽优选为小于约30个氨基酸长以及更优选小于约20个氨基酸长的肽。
[0053]如本文所使用的术语“多肽”，是指由通过肽键连接在一起的氨基酸的单一线性链构成的蛋白质的一部分。所述氨基酸链优选为大于约30个氨基酸长或长于30个氨基酸。
[0054]如本文所使用的术语“蛋白质”,是指包含一个或更多个复原(resume) 二级和三级结构之多肽的蛋白质以及另外指由一些形成四级结构的氨基酸链(例如一些亚基)构成的蛋白质。蛋白质有时具有连接的非肽基团，其可以被称作辅基(prosthetic group)或辅因子(cofactor)。
[0055]如在本发明的上下文中使用的术语“多肽片段”，是指与全长多肽相比于具有缺失(例如氨基末端缺失、和/或羧基末端缺失、和/或内部缺失)的多肽。
[0056]在本发明的上下文中，术语“融合蛋白”指包含与异源氨基酸序列相偶联之多肽或多肽片段的蛋白质。因为可以构建成包含来自两种或更多种不同蛋白质的两个或更多个所需功能元件，所以融合蛋白是有用的。
[0057]在本发明的上下文中，术语“抗体”、“免疫球蛋白”、“Ig”和“Ig分子”可互换使用。每条重链的CH2结构域包含单个位于天冬酰胺残基的用于N-连接糖基化的位点，其将N-聚糖连接至抗体分子,通常在残基Asn-297处(Kabat等人，Sequence of proteins ofimmunological interest, Fifth Ed., U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication N0.91-3242)。该术语的范围包括 Ig 类，即 IgG, IgA, IgE, IgM 和 IgD0该术语的范围还包括IgG的亚型，即IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。该术语取其广义的含义，包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、单链抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)。
[0058]本发明上下文中使用的术语“抗体片段”是指含有重链免疫球蛋白恒定区CH2结构域的至少一部分(其包含CH2结构域的N-连接糖基化位点)的抗体片段。它还可以是能够特异性结合抗原，即至少一条\链和/或Vh链或其结合部分。
[0059]如本文使用的术语“Fe结构域”和“Fe区”，是指抗体重链的C-末端部分，其与称作Fe受体的细胞表面受体以及补体系统的某些蛋白相互作用。这个性质允许抗体激活免疫系统。
[0060]在本发明的上下文中，术语“糖蛋白”是指含有寡糖链(聚糖)的蛋白质，所述寡糖链与所述蛋白质的多肽侧链共价连接。在共翻译或翻译后修饰中，所述碳水化合物与所述蛋白质相连接。该过程被称为“糖基化”，例如N-糖基化或O-糖基化。
[0061]“N-糖基化”是指糖链添加至天冬酰胺侧链上的酰胺氮。“O-糖基化”是指糖链添加至羟赖氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸侧链上的羟基氧。
[0062]本发明上下文中使用的术语“糖脂”是指与碳水化合物相连的脂质。其出现于碳水化合物链与细胞膜的胞质外面(exoplasmic surface)上的磷脂相连处。在所有真核细胞膜的外表面上发现了碳水化合物。糖脂的碳水化合物结构受糖基转移酶(其添加脂质)和糖基水解酶(其对添加后的聚糖进行修饰)的调控。糖脂还出现于有包膜病毒(包括用作减毒活疫苗的病毒)的表面上。
[0063]在本发明的上下文中，术语“聚糖”或“糖部分”可互换使用，其是指多篮或寡篚。术语“寡糖”是指含有小数目(通常3~10个)组成糖(component sugar,也称为“简单糖”或“单糖”)的糖聚合物。术语“多糖”是指由通过糖苷键连接的重复单元(单糖或二糖，通常> 10个)形成的多聚碳水化合物结构。聚糖可被发现与蛋白质相连接(如在糖蛋白中)或者与脂质相连接(如在糖脂中)。该术语涵盖了 N-聚糖(例如，高甘露糖型N-聚糖、复合型N-聚糖或杂合型N-聚糖)、O-聚糖或者。
`[0064]在本发明的上下文中，下列单糖缩写如下:葡萄糖=Glc，半乳糖=Gal，甘露糖=Man,岩藻糖=Fuc或F, N-乙酰半乳糖胺=GalNAc,或N-乙酰葡糖胺=GlcNAc,岩藻糖类似物=Fuc *或F *。
[0065]“N-聚糖”是指N-连接的多籃或寡糖。N-连接的寡糖是例如连接了或者通过N-乙酰葡糖胺残基连接了蛋白质中天冬酰胺残基的酰胺氮的寡糖。N-糖蛋白上发现的主要的糖类有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如N-乙酰-神经氨酸(NANA))。对糖基团的加工与翻译共同发生在ER腔中，并且对于N-连接的糖蛋白来说在高尔基体中继续进行。N-聚糖具有共同的Man3GlcNAc2五糖核心(“Man”是指甘露糖，“Glc”是指葡萄糖，以及“NAc”是指N-乙酰基，GlcNAc是指N-乙酰葡糖胺)。N-聚糖根据分支(“触角”)数目而不同，所述分支包含添加至Man3GlcNAc2核心结构(也称为“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“寡甘露糖(paucimannose)核心”)的外周糖(例如GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)。N-聚糖根据其分支组成而分类(例如高甘露糖型、复合型或杂合型)。
[0066]“高甘露糖型N-聚糖”是指具有五个甘露糖残基(Man5)或更多甘露糖残基(例如Man6> Man7或Man8)的N-连接多糖或寡糖。
[0067]“复合型N-聚糖”是指通常具有与“三甘露糖”核心的1，3甘露糖臂连接的至少一个GlcNAc以及与“三甘露糖”核心的1，6甘露糖臂连接的至少一个GlcNAc的N-连接多糖或寡糖。复合型N-聚糖还可以具有任选地用唾液酸或其衍生物(例如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神经氨酸，“Ac”是指乙酰基)进行修饰的半乳糖(“Gal”)或N-乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)残基。复合型N-聚糖还可以具有链内替换，包括“二等分型”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)。本发明上下文中的复合型N-聚糖可包含O个(G0)、1个(Gl)或2个(G2)半乳糖以及与还原端上第一个GlcNAc相连的一个岩藻糖(分别表不为GOF、GIF、G2F)。
[0068]“杂合型N-聚糖”是指在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂末端上具有至少一个GlcNAc以及在所述三甘露糖核心的1，6甘露糖臂上的O个或更多个甘露糖的N-连接的多糖或寡糖。
[0069]本发明上下文中描述糖结构时使用的缩写如下:
[0070]核心=Man3GlcNAc2
[0071]GO = GlcNAc2 Man3 GlcNAc2
[0072]GO-GIcNAc =缺少 I 个 GlcNAc 的 GO 结构(即，GlcNAc Man3 GlcNAc2)
[0073]Gl =含有I个额外的半乳糖残基的GO结构(即，Gal GlcNAc2 Man3GlcNAc2)
[0074]G2 =含有2个额外的半乳糖残基的GO结构(即，Gal2 GlcNAc2 Man3GlcNAc2)
[0075]GOF =含有I个额外的岩藻糖残基的GO结构，所述岩藻糖残基与五糖核心的第一个 GlcNAc 残基相连(即，GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 Fuc)
[0076]GOF-GlcNAc =含有I个额外的岩藻糖残基的G0_GlcNAc结构，所述岩藻糖残基与五糖核心的第一个GlcNAc残基相连(即，GlcNAc Man3GlcNAc2Fuc)
[0077]GlF =含有I个额外的岩藻糖残基的Gl结构，所述岩藻糖残基与五糖核心的第一个 GlcNAc 残基相连(即，Gal GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 Fuc)
[0078]G2F =含有I个额外的岩藻糖残基的G2结构，所述岩藻糖残基与五糖核心的第一个 GlcNAc 残基相连(即，Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 Fuc)
[0079]Man4 =含有I个额外的甘露糖残基的核心结构(即，Man Man3 GlcNAc2)
[0080]Man5 =含有2个额外的甘露糖残基的核心结构(即，Man2 Man3 GlcNAc2)
[0081]Man6 =含有3个额外的甘露糖残基的核心结构(即，Man3 Man3 GlcNAc2)
[0082]Man7 =含有4个额外的甘露糖残基的核心结构(即，Man4 Man3 GlcNAc2)
[0083]Man8 =含有5个额外的甘露糖残基的核心结构(即，Man5 Man3 GlcNAc2)
[0084]为了示例性的描述包含岩藻糖类似物的糖结构，上述F(岩藻糖)可以简单地用F* (岩藻糖类似物)替代。例如，某种情况下，使用本发明的方法产生具有包含核心岩藻糖类似物(cF * )的N-聚糖结构的抗体。
[0085]“O-聚糖”是指O-连接的多籃或寡糖。O-连接的聚糖通常通过丝氨酸或苏氨酸残基与肽链相连。O-连接的糖基化是真正的翻译后事件，其发生于高尔基体中，并且其不需要共有的序列且蛋白质转运不需要寡糖前体。O-连接的聚糖的最常见类型包含初始GalNAc残基(或Tn表位)，这些常被称为粘蛋白(mucin)型聚糖。其它的O-连接聚糖包括葡糖胺、木糖、半乳糖、岩藻糖或甘露糖作为初始糖与Ser/Thr残基结合。O-连接的糖蛋白通常是大的蛋白(> 200kDa)，其常常是双“触角”型的，且分支相对少于N-聚糖。
[0086]动物和人细胞有岩藻糖基转移酶，其将岩藻糖残基添加至蛋白质上N-聚糖的还原性末端处的GlcNAc残基或者糖脂上的其他新生糖结构。蛋白质或脂质所连接的糖部分的岩藻糖基化需要核苷酸糖GDP-L-岩藻糖作为供体，并且还存在特定的岩藻糖基转移酶，其将岩藻糖基残基从供体转移到接受体分子(Becker和Lowe，1999)。在真核细胞(例如脊椎动物细胞)中，GDP-L-岩藻糖可以通过两种不同的途径合成，通过较主要的岩藻糖从头途径(de novo pathway)或通过次要补救途径(Becker和Lowe, 1999)。补救途径或“清道夫(scavenger) ”途径是GDP-L-岩藻糖的次要来源(大约10% )，来自细胞培养基的游离岩藻糖和岩藻糖基化之糖蛋白的缺乏可轻易地阻断该来源。补救途径从细胞外岩藻糖起始，通过岩藻糖特异性质膜转运体(transporter)可以将细胞外岩藻糖转运入胞质区室。或者，从内吞的糖蛋白切除的岩藻糖可以进入胞质。岩藻糖激酶将胞质L-岩藻糖磷酸化为岩藻糖-1-磷酸，然后GDP-岩藻糖焦磷酸化酶将其转变为GDP-L-岩藻糖(图1，右图)。细胞培养实验提示补救途径对胞衆GDP-L-岩藻糖池(pool)来说贡献相对较小(Becker andLowe,1999)。
[0087]更加占据优势地位的岩藻糖从头途径从GDP-D-甘露糖起始并且由GDP-甘露糖脱水酶(⑶P-mannose dehydratase, GMD)和⑶P-酮-脱氧-甘露糖-差向异构酶 /GDP-丽-脱氧-半乳糖-还原酶(GDP-keto-deoxy-mannose-epimerase/GDP-keto-deoxy-galactose-reduct ase, GMER,在人中也称作 Fx)组成，二者均位于细胞质，其共同将⑶P-甘露糖转变为⑶P-L-岩藻糖(图1，左图)。随后，⑶P-L-岩藻糖通过位于高尔基体膜中的⑶P-岩藻糖转运体被转运至高尔基体。一旦⑶P-L-岩藻糖已进入高尔基体腔内区室，岩藻糖基转移酶可以将⑶P-L-岩藻糖共价连接至高尔基内的新生糖部分。特别地，岩藻糖基转移酶(FutS)通过1，6_连接将岩藻糖残基转移至在N-聚糖还原末端的GlcNAc残基的6位。
[0088]如上所述，将药物活性化合物以稳定、特异、均一、有效的方式偶联至蛋白质(例如抗体)在医学领域中是非常期望的。特别地，经预定连接位点的缀合物的定点偶联是期望的。
[0089]本发明的发明人出人意料地确定，通过引入分子(例如脂质或蛋白质(例如糖蛋白例如抗体))糖结构中的人工核心岩藻糖类似物可以实现药物活性化合物与所述分子的均一、有效、稳定且定点的偶联。他们还出人意料地发现，通过连接到蛋白质-O-岩藻糖基化位点的人工岩藻糖类似物可实现将药物活性化合物与蛋白质(例如糖蛋白例如抗体)的均一、有效、稳定且定点的偶联，所述蛋白质-O-岩藻糖基化位点并入或连接至所述蛋白质的氨基酸序列。此外，所述岩藻糖类似物相比于天然岩藻糖分子有特定的优势，所述岩藻糖类似物允许药物活性化合物特异性地偶联至岩藻糖类似物所连接的分子(例如蛋白质或脂质)。
[0090]此外，本发明的发明人出人意料地发现，在起始自GDP-D-甘露糖的GDP-L-岩藻糖合成途径(从头途径)被阻断的细胞中，可以以高产量产生在其糖部分或氨基酸包含有岩藻糖类似物以取代天然岩藻糖的分子。其原因是在这样的糖改造的(gycoengineered)细胞中天然岩藻糖的任何竞争性并入被完全消除。使用无岩藻糖培养基和岩藻糖从头合成途径被阻断的细胞使得岩藻糖类似物作为此类细胞中存在的岩藻糖基转移酶的唯一底物。此外，由于天然GDP-岩藻糖`(岩藻糖从头合成途径的产物)是补救途径岩藻糖激酶的竞争性抑制剂，从头合成的阻断另外地加速补救途径的效率，由此加速了岩藻糖类似物的代谢的⑶P形式(metabolized⑶P form)的产生,其可并入所述细胞中存在的分子(例如并入蛋白质的新生糖结构中)。因此，使用岩藻糖从头合成途径被阻断并且包含岩藻糖类似物的细胞，可以以化学计量上有效的方式产生在其表面上带有岩藻糖类似物的分子(例如蛋白质或脂类)。
[0091]这样，在第一方面，本发明提供用于生产包含岩藻糖类似物之分子的真核细胞，其中
[0092](i)在所述细胞中从⑶P-D-甘露糖起始的⑶P-L-岩藻糖合成途径被阻断，并且
[0093](ii)所述细胞包含⑶P-L-岩藻糖类似物。
[0094]本发明的上下文中所使用术语“包含岩藻糖类似物的分子”指在本发明的真核细胞(优选脊椎动物细胞)中产生的任意化合物，所述细胞能够将岩藻糖类似物(替代天然岩藻糖)添加至所述化合物(如添加至其其糖部分或氨基酸)，即具有将岩藻糖类似物(替代天然岩藻糖)添加至所述所述化合物(如添加至其糖部分或氨基酸)的能力，所述化合物包含至少一个岩藻糖类似物(例如在其糖部分或氨基酸上)。这样的分子包含聚糖转移酶所识别的至少一个或更多个序列模体，例如包含Asp、Ser或Thr残基，优选三肽序列Asn-X-Ser/Thr,其中X是除Pro之外的任意氨基酸。在本发明的细胞中包含的所述聚糖转移酶还能够将(如果天然岩藻糖不可用)岩藻糖类似物连接至所述分子(例如其糖部分或氨基酸)。换句话说，在未改变的细胞中产生后可天然地包含岩藻糖分子(例如在其糖部分或氨基酸上)的分子在本发明的细胞中产生后包含岩藻糖类似物(例如在其糖部分或氨基酸上)。产生包含具有天然岩藻糖之氨基酸或糖部分的细胞为例如CHO、AGE1.HN, AGE1.CR、AGE1.CR.PIX 或 AGE1.CS 细胞。
[0095]技术人员可容易地通过实验确定在特定分子(例如抗体分子)的糖部分上岩藻糖类似物的存在和/或岩藻糖类似物的量，其通过(i)在产生目的分子的条件下培养本发明的细胞，(?)从所述细胞分 离所述分子和(iii)针对连接至所述分子糖部分的岩藻糖残基分析所述分子的糖链结构，并确定岩藻糖残基的类型和/或计算所述分子的糖链结构上存在的岩藻糖残基的平均值，以及(iv)将结果与在用无岩藻糖类似物的模式产生所述分子的相同细胞中产生的相同分子(例如抗体分子)的结果比较。优选地，在两个实验中使用的细胞是相同的，差别仅在于其一的细胞(本发明的细胞)在岩藻糖类似物的存在下培养。优选地，两者的细胞在相同培养条件下培养以排除可以由培养条件的不同导致的岩藻糖基化的变化。相同的方法可用于通过实验确定在特定分子(例如抗体分子)的氨基酸结构上岩藻糖类似物的存在和岩藻糖类似物的量。
[0096]可以通过二维糖链作图法容易地分析分子(例如抗体分子)中的糖链结构(Anal.Biochem., 171,73 (1988), Biochemical Experimentation Methods23-Methodsfor Studying Glycoprotein Sugar Chains(Japan Scientific Societies Press)Reiko Takahashi编辑(1989))。由二维糖链作图法推断出的结构可以通过进行每个糖链的质谱(例如MALDI (基质辅助激光解吸/电离，Matrix Assisted Laser Desorption/1nisation)-T0F-MS)来确定。
[0097]本文所使用的术语从⑶P-D-甘露糖起始的⑶P-L-岩藻糖合成途径(从头途径)被“阻断”指所述途径被阻断至少50 %，优选地至少60 %或70 %，更优选地至少80 %或90%,以及最优选地至少 95%或 100%，例如至少 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。技术人员可以容易地通过实验确定从头途径(de novo pathway)阻断的等级,其通过确定在从⑶P_D_甘露糖起始的⑶P-L-岩藻糖合成途径(从头途径)被阻断或扰乱的细胞中所产生的⑶P-L-岩藻糖水平并将其与在从GDP-D-甘露糖起始的GDP-L-岩藻糖合成途径(从头途径)未被阻断或扰乱的细胞中所产生的GDP-L-岩藻糖水平进行比较。在本文中，例如GDP-L-岩藻糖的水平相比于在对照细胞中确定的GDP-L-岩藻糖的水平降低50%意味着从头途径阻断50%，以及GDP-L-岩藻糖的水平相比于在对照细胞中确定的GDP-L-岩藻糖的水平降低100%意味着从头途径阻断100%。优选地，在两个实验中使用的细胞是相同的，差别仅在于其一的细胞(本发明的细胞)包含例如至少一种使用⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖作为底物的酶，其中所述酶不催化将GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖转变为GDP-L-岩藻糖的反应从而阻断从头途径。优选地，两者的细胞都在相同培养条件(例如细胞培养基或培养时间)下培养以排除可以由培养条件的不同导致的岩藻糖基化的变化。特别优选的是两者的细胞都在缺乏外部岩藻糖源的条件下培养，以消除补救途径对在所述细胞中产生的GDP-L-岩藻糖之量的影响。此外，技术人员知道如何确定GDP-L-岩藻糖的水平以计算从头途径之阻断的水平/等级。
[0098]可以任意方式或者在从头途径中任意步骤(例如在一个或更多个步骤)实现阻断从GDP-D-甘露糖起始的GDP-L-岩藻糖合成途径(从头途径)，只要在所述细胞中(参见上文)从⑶P-D-甘露糖产生⑶P-L-岩藻糖的水平降低(至少50% )，优选地没有⑶P-L-岩藻糖。这可以通过以下来实现:(i)所述途径中所涉及酶的突变使得其酶活性降低或消除，(?)敲除或部分敲除基因或调节所述基因的启动子区域，使得不产生所述通路中所涉及的具有酶活性的酶或者使得所述通路中所涉及的具有酶活性的酶产生减少，和/或(iii)用miRNA技术敲低或部分敲低编码所述酶的mRNA，使得不产生所述通路中所涉及的具有酶活性的酶或使得所述通路中所涉及的具有酶活性的酶产生减少(参见图1，左图)。所述酶可以是例如⑶P-甘露糖脱水酶(GMD)和/或⑶P-岩藻糖合成酶(GFS)。
[0099]在真核细胞(例如脊椎动物细胞)中包含糖部分的分子(例如蛋白质或脂质)的岩藻糖基化需要核苷酸糖(GDP-L-岩藻糖)做为供体并且还存在特定的岩藻糖基转移酶，其将岩藻糖基残基从供体转移到接受体分子。如上所述，在真核细胞(例如脊椎动物细胞)中可以通过两种不同的途径合成GDP-L-岩藻糖，通过较主要的岩藻糖从头途径或次要的补救途径。
[0100]在一个优选的实施方案中，从GDP-D-甘露糖起始的GDP-L-岩藻糖合成途径(从头途径)被阻断，优选地阻断80%，更优选地阻断90%和最优选地阻断95%或100%，其由于在真核细胞(例如脊椎动物细胞)中存在下述酶，所述酶使用GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖作为底物，但不催化将⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖转变为⑶P-L-岩藻糖的反应。从这方面讲，应当注意术语“⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖”与术语“⑶P-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖”是同义词。二者在本文可以交换使用。
[0101]在真核细胞(例如脊椎动物细胞)中存在的所述酶可以是使用GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖作为底物的任意酶，前提是所述酶不催化将GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖转变为GDP-L-岩藻糖的反应。在真核细胞(例如脊椎动物细胞)中所述酶将GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖转变为无法再用于⑶P-L-岩藻糖合成的产物。优选地包含于真核细胞(例如脊椎动物细胞)的酶是通常不存在于所述细胞中的酶，即异源或人工酶，例如来自其他界生物(例如原核生物，优选细菌)的酶。作为替代地，所述酶也可以是通常可以在真核细胞(例如脊椎动物细胞)中存在的酶，但其不将底物GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖转变为GDP-L-岩藻糖，而是转变为不同的产物，例如由于突变的存在。
[0102]所述酶(优选地存在与真核细胞(例如脊椎动物细胞)中)可以通过例如蛋白质显微注射(microinjection)、蛋白质电穿孔(electroporation)或蛋白质脂质体转染(Iipofection)引入所述细胞。也可以通过例如DNA显微注射、DNA电穿孔或DNA脂质体转染将编码所述酶的核酸序列引入，优选地整合在表达载体中，至脊髓动物细胞中，其随后在真核细胞(例如脊椎动物细胞)中分别转录并翻译为各蛋白质。本领域的技术人员熟知用于将蛋白质或编码蛋白质的核酸序列引入真核细胞(例如脊椎动物细胞)的分子生物学技术，例如显微注射、电穿孔或脂质体转染，并且知道如何操作这些技术。
[0103]优选地，在真核细胞(例如脊椎动物细胞)中存在两个或更多个(即2、3、4、5、6或7)使用⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖作为底物但不催化⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖转变为GDP-L-岩藻糖的酶，从而有效地阻断所述细胞中岩藻糖从头途径。
[0104]优选地，所述使用⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖作为底物的酶选自⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖还原酶(与⑶P-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖还原酶同义，简称RMD)、⑶P-过骨胺合成酶(perosamine synthetase) (Per)、⑶P-6_脱氧_D_塔洛糖合成酶(GTS)、⑶P-岩藻糖合成酶Cysl09Ser- (GFS-Cys 109Ser)突变体、⑶P_4_酮-6-脱氧甘露糖_3_脱水酶(ColD)，优选地⑶P-4-酮-6-脱氧甘露糖-3-脱水酶(ColD)结合⑶P-L-可立糖合酶(ColC)，以及其变体，优选地所述酶来自细菌或源自这样的细菌酶。更优选地，所述使用⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖作为底物的酶⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖还原酶(RMD)、⑶P-岩藻糖合成酶Cysl09Ser-(GFS-Cysl09Ser)突变体和/或⑶P-过骨胺合成酶(Per)。
[0105]⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-`己酮糖还原酶(RMD)将底物⑶P_6_脱氧-D-来苏_4_己酮糖还原为GDP-D-鼠李糖。在细菌中GDP-D-鼠李糖是D-鼠李糖基化的核苷酸糖供体，其不存在于真核细胞(例如脊椎动物细胞)中。真核细胞(例如脊椎动物细胞)中还缺乏特异性鼠李糖基转移酶，以致于GDP-D-鼠李糖不能掺入到真核细胞(例如脊椎动物细胞)内糖蛋白或糖脂的新生糖结构中。
[0106]⑶P-6-脱氧-D-塔洛糖合成酶(GTS)将底物⑶P_6_脱氧-D-来苏_4_己酮糖还原成GDP-脱氧-D-塔洛糖。GDP-脱氧-D-塔洛糖是细菌中6-脱氧-D-塔洛糖基化的核苷酸糖供体，其不存在于真核生物(例如脊椎动物)中。真核细胞(例如脊椎动物细胞)中还缺乏特异性脱氧塔洛糖基转移酶，以致于GDP-脱氧-D-塔洛糖不能掺入到脊椎动物细胞内的新生糖结构中。
[0107]此外，⑶P-过骨胺合成酶(Per)将底物⑶P_6_脱氧_D_来苏_4_己酮糖还原并且转氨基成⑶P-D-过骨胺(⑶P-D-perosamine)(⑶P_D_4_氨基-4，6- 二脱氧-D-甘露糖)。⑶P-D-过骨胺是细菌(例如大肠杆菌(E.coli)中过骨胺化的核苷酸糖供体。⑶P-D-过骨胺通常不存在于真核细胞(例如脊椎动物细胞)中。真核细胞(例如脊椎动物细胞)还缺乏特异性过骨胺基转移酶，以致于⑶P-D-过骨胺不能与真核细胞(例如脊椎动物细胞)内的新生糖结构相连接。
[0108]因此，异源酶GTS和/或Per (i)耗尽真核细胞(例如脊椎动物细胞)中的底物⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖，以及(ii)导致不能再用于合成⑶P-L-岩藻糖的人工产物(即，在GTS情况下的GDP-脱氧-D-塔洛糖，以及在Per情况下的GDP-D-过骨胺)的合成。
[0109]因此，对于在从头途径没有被阻断的真核细胞中在其糖部分和/或氨基酸上通常包含(天然)岩藻糖的分子来说，在本发明的真核细胞中(例如在包含GTS和/或Per和岩藻糖类似物的真核细胞中)所产生的分子在其糖部分和/或氨基酸上缺乏(天然)岩藻糖，取而代之的是包含(天然)岩藻糖的岩藻糖类似物。
[0110]⑶P-4-酮-6-脱氧甘露糖-3-脱水酶(ColD)使用底物⑶P_6_脱氧-D-来苏_4_己酮糖，并将其转化成⑶P-4-酮-3，6- 二脱氧-D-甘露糖。由于中间产物⑶P-4-酮-3，6- 二脱氧-D-甘露糖在真核细胞(例如脊椎动物细胞)中不稳定，因此优选ColD与GDP-L-可立糖合酶(ColC)联用。酶ColC属于⑶P-4-脱氢-6-脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶类。酶ColC还将中间产物⑶P-4-酮-3，6- 二脱氧-D-甘露糖转化成稳定的终产物⑶P-L-可立糖。由于所述细胞缺乏将⑶P-4-酮-3，6- 二脱氧-D-甘露糖和/或⑶P-L-可立糖转移至所述细胞中存在之分子的糖部分的相应糖基转移酶，因此这两种产物都不能掺入到真核细胞(例如脊椎动物细胞)内的新生糖结构中。因此，优选地ColD与ColC相组合地存在于真核细胞(例如脊椎动物细胞)中。
[0111]⑶P-岩藻糖合成 酶(⑶P-Fucose synthetase，GFS)(也称为“⑶P-4-酮_6_脱氧-D-甘露糖差向异构酶/还原酶”，GMER)在真核细胞(例如脊椎动物细胞)中将⑶P-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖转化成⑶P-L-岩藻糖。GFS反应涉及C-3 "和C-5 "的差向异构化，随后在C-4羰基处发生NADPH依赖性还原反应。本发明中使用活性位点突变体(优选GFS-Cys 109Ser)，其将⑶P-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖转化成不同于⑶P-L-岩藻糖的产物，即 GDP-6-脱氧-D-阿卓糖(参见 Lau S.T.B., Tanner, Μ.Ε.2008.Mechanism andactive site residues of GDP—Fucose Synthase, Journal of the American ChemicalSociety, Vol.130，N0.51，17593-17602 页)。
[0112]优选地，真核细胞(例如脊椎动物细胞)中存在两种或更多种(即，2、3、4、5、6或7种)选自与⑶P-L-可立糖合酶(ColC)相组合的⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖还原酶(MD)、⑶P-过骨胺合成酶(Per)、⑶P_6_脱氧-D-塔洛糖合成酶(GTS)、⑶P-岩藻糖合成酶Cysl09Ser-(GFS-Cysl09Ser)突变体、⑶P-4-酮-6-脱氧甘露糖_3_脱水酶(ColD)的酶(优选GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖-3-脱水酶(ColD))及其变体。
[0113]本发明中优选的RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶的变体与其所来源的RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶的不同在于氨基酸序列中多至150个(SP，多至 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或150个)氨基酸改变(即替换、插入、缺失、N-末端截短和/或C-末端截短)。氨基酸替换可以是保守性或非保守性的。本发明中优选的RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶的变体可以作为替代地或额外地具有如下特征，即，与其所来源的RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶具有一定程度的序列同一性。因此，本发明中优选的RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶的变体与相应的参照RMD、Per、GTS、GFS_Cysl09Ser、ColD或ColC酶具有至少80%、至少81 %、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96 %、至少97 %、至少98%或至少99 %的序列同一性。优选地，序列同一性是针对40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300或更多个氨基酸的连续序列的，优选地是针对相应参照RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶的全长的。特别优选地，序列同一性是针对各参照RMD、Per、GTS、GFS_Cysl09Ser、ColD或ColC酶全长的至少80%、针对全长的至少85%、针对全长的至少90%、针对全长的至少95%、针对全长的至少98%或针对全长的至少99.5%。还特别优选地，序列同一性是针对各参照RMD、Per、GTS、GFS_Cysl09Ser、ColD或ColC酶中至少200或250个氨基酸的至少80%、针对至少200或250个氨基酸的至少85%、针对至少200或250个氨基酸的至少90%、针对至少200或250个氨基酸的至少95%、针对至少200或250个氨基酸的至少98%或针对至少200或250个氨基酸的至少99.5%。
[0114]RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶的片段(或缺失变体)优选地在其N-末端和 / 或 C-末端和 / 或内部具有多至 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140 或 150 个氨基酸的缺失。
[0115]此外，如果与所述参照酶具有如上所示之程度的相关性的RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶表现出各参照酶活性之至少30%程度的相关生物学活性，才将其视作变体。本发明上下文中相关的“生物学活性”是“酶活性”，即RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶的变体利用底物⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖并将其分别转化成⑶P-D-鼠李糖、⑶P-D-过骨胺(4-氨基-4，6- 二脱氧-D-甘露糖)、⑶P-脱氧-D-塔洛糖、⑶P-6-脱氧-D-阿卓糖、⑶P-4-酮-3，6- 二脱氧-D-甘露糖或⑶P-L-可立糖的活性。本领域技术人员可容易地评估RMD、Per、GTS、GFS_Cysl09Ser、ColD或ColC酶的变体是否具有各参照酶RMD、Per、GTS、GFS_Cysl09Ser、ColD或ColC之酶活性的至少30%的酶活性。本领域技术人员已知用于确定与各参照酶之酶活性相比的酶变体之“酶活性”的合适测定(例如酶活性测定)。
[0116]优选地，GDP-6-脱氧-D-来苏_4_己酮糖还原酶(GDP-6-deoxy-D-lyxo-4-hexulose reductase, RMD)来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) (SEQ ID NO: I) ? GDP-6-脱氧-D-塔洛糖合成酶(GDP-6-deoxy-D-talosesynthetase,GTS)优选地来自伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)(SEQ ID NO:2)。优选地，GDP-过骨胺合成酶(GDP-perosamine synthetase, Per)来自霍乱弧菌(Vibrio cholerae) (SEQ ID NO:3)。优选地，⑶P_4_酮-6-脱氧甘露糖-3-脱水酶(GDP-4-keto-6-deoxymannose-3-dehydratase,ColD)来自大肠杆菌(E.coli) (SEQ ID NO:4)。优选地,还使用来自大肠杆菌的⑶P-L-可立糖合酶(⑶P-L-colitose synthase,ColC)(SEQ ID NO:7)。野生型⑶P-岩藻糖合成酶(⑶P-Fucose synthetase,GFS)来自中国仓鼠(Cricetulus griseus)(中国仓鼠)(SEQ ID NO:5)。来自中国仓鼠(Cricetulus griseus)(中国仓鼠)的 GDP-岩藻糖合成酶 Cysl09Ser-(GDP_Fucose synthetase CyslO9Ser-,GFS-Cys 109Ser)突变体具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
[0117]如上所述，本发`明涵盖了利用⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖作为底物的酶的变体。因此，本发明还涵盖了上述序列识别号的变体，即SEQ ID NO:1的变体、SEQ ID NO:2的变体、SEQ ID NO:3 的变体、SEQ ID NO:4 的变体、SEQ ID NO:5 的变体、SEQ ID NO:6 的变体以及SEQ ID NO:7的变体。至于所述变体的结构和/或功能定义，参考前述段落。
[0118]核酸序列的相似性，例如序列同一性的百分比，可以通过序列比对确定。这样的比对可以用一些本领域已知算法进行，优选使用以下算法=Karlin和Altschul(Karlin&Altschul (1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5877)、hmmalign (HMMER package, http//:hmmer.wustl.edu/)或 CLUSTAL 算法(Thompson, J.D.，Higgins, D.G.&Gibson, T.J.(1994) Nucleic acids Res.22,4673-80)例如在 http: //www.eb1.ac.uk/Tools/clustalw/ 或在 http: //eb1.ac.uk/Tools/clustalw2/index, html 上或在 http://npsa-pbil.1bcp.fr/cg1-bin/npsa automat.pl? page = /NPSA/npsa clustalw.html上可得的。优选使用的参数为如其在http://www.eb1.ac.uk/Tools/clustalw/或 http: //www.eb1.ac.uk/Tools/clustalw2/index, html 上所设置的黒犬认参数。序歹丨J 同一性(序列匹配)的级别可以使用例如BLAST或BlastZ (或BlastX)计算。类似的算法被并入 BLASTP 程序(Altschul 等(1990) J.Mol.Biol.215:403-410)。
[0119]优选地，RMD、Per、GTS、ColD、ColC或GFS_Cysl09Ser的核酸序列是经密码子优化的。本发明上下文中使用的术语“经密码子优化”是指例如去除内部TATA盒、chi位点、核糖体进入位点、RNA不稳定性模体、重复序列、紧密(intense)的RNA 二级结构和隐蔽剪接位点以及使用真核(例如脊椎动物)细胞中较高利用度(higher utilization)的密码子或者利用真核(例如脊椎动物)细胞中高表达基因的密码子。
[0120]真核细胞(例如脊椎动物细胞)的酶另外地或作为替代地包含⑶P-D-鼠李糖、⑶P-D-过骨胺、⑶P-脱氧-D-塔洛糖、⑶P-6-脱氧-D-阿卓糖、⑶P-4-酮_3，6_ 二脱氧-D-甘露糖和/或⑶P-L-可立糖，以抑制或阻止⑶P-L-岩操糖合成，因为本发明人已出乎意料地发现补充(特别是胞浆补充)(例如通过胞质内注射)人工糖⑶P-D-鼠李糖、⑶P-D-过骨胺、⑶P-脱氧-D-塔洛糖、⑶P-6-脱氧-D-阿卓糖、⑶P-4-酮-3，6- 二脱氧-D-甘露糖和/或GDP-L-可立糖对抑`制真核细胞(例如脊椎动物细胞)中岩藻糖的转移有积极的贡献。特别优选补充人工糖:GDP-6-脱氧-D-阿卓糖、GDP-D-鼠李糖和/或⑶P-D-过骨胺。
[0121]优选地，利用⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖作为底物但不催化将⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖转化成GDP-L-岩藻糖之反应的酶表达自瞬时存在于或者稳定维持于脊椎动物细胞中(例如作为附加体或在染色体上)的核酸序列。
[0122]将编码酶(优选⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖还原酶(RMD)、⑶P-过骨胺合成酶(Per)、⑶P-6-脱氧-D-塔洛糖合成酶(GTS)、⑶P-岩藻糖合成酶Cysl09Ser-(GFS-Cysl09Ser)突变体、⑶P_4_酮-6-脱氧甘露糖-3-脱水酶(ColD)或GDP-L-可立糖合酶(ColC))的核酸序列整合在用于转化细胞的表达载体中。
[0123]合适的表达载体包括质粒、粘粒(cosmid)、细菌人工染色体(BAC)和病毒载体。优选地，使用非病毒表达载体。
[0124]编码酶之核酸的表达受表达控制序列的控制。术语“表达控制序列”是指影响与其有效连接之编码序列在真核细胞(例如脊椎动物细胞)中表达的核苷酸序列。表达控制序列是控制核酸序列的转录(例如启动子、TATA盒、增强子)、转录后事件(例如多聚腺苷酸化)以及翻译的序列。优选地，编码上述酶的核酸序列受组成型启动子的控制，优选地受人转运延伸因子2(EF2)启动子的调控。其他在本领域已知的组成型启动子。
[0125]优选地，表达载体中编码酶RMD、Per、GTS、GFS_Cysl09Ser、ColD或ColC的核酸序列与真核(例如脊椎动物)特异性表达控制序列有效连接，这使得编码RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC的核酸序列能够在真核细胞(例如脊椎动物细胞)中表达。因此，在本发明的真核细胞(例如脊椎动物细胞)中以有利于期望效果的产量表达RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser和/或ColD (ColD优选与ColC组合)。取决于用于表达的酶和细胞的性质，这些产量可以为高、中或低水平的。本领域技术人员很容易选择合适的真核(例如脊椎动物)特异性表达控制序列来实现高、中或低水平的表达。
[0126]因此，对于在从头途径没有被阻断的真核细胞中在其糖部分和/或氨基酸上通常包含(天然)岩藻糖的分子，在本发明的真核细胞中(例如在包含GTS和/或Per和岩藻糖类似物的真核细胞中)产生的分子在其糖部分和/或氨基酸上缺乏(天然)岩藻糖，取而代之的是包含(天然)岩藻糖的岩藻糖类似物。
[0127]如上所提及的，包含岩藻糖类似物之分子的有效产生显著地受益于岩藻糖从头途径的缺乏。阻断从头途径避免了天然岩藻糖的竞争性结合并且大大增加岩藻糖类似物的并入效率。以下描述破坏或阻断从头途径的其他一些优选实施方案。[0128]⑶P-甘露糖脱水酶(GMD)是通常催化将⑶P-甘露糖转变为⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖之反应的酶，并且⑶P-岩藻糖合成酶(GFS)是使用⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖作为底物并且将其转变为⑶P-L-岩藻糖的酶(参见图1，左图)。这样，如果在所述细胞中没有具有酶活性的GMD和/或GFS存在，或如果在所述细胞中存在酶活性降低的GMD和/或GFS，则从⑶P-D-甘露糖起始的⑶P-L-岩藻糖合成途径(从头途径)被阻断。
[0129]因此，作为替代地或额外地，优选地本发明的真核细胞:
[0130](i)不包含具有酶活性的⑶P-甘露糖脱水酶(GMD)或包含酶活性降低的⑶P-甘露糖脱水酶(GMD)，和/或
[0131](ii)不包含具有酶活性的⑶P-岩藻糖合成酶(GFS)或包含酶活性降低的⑶P-岩藻糖合成酶(GFS)。
[0132]术语GMD或GFS的“酶活性降低的”意味着减少或降低GMD或GFS的生物学活性(即GMD利用底物⑶P-甘露糖并将其转变为⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖的活性或GFS利用底物⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖并将其转变为⑶P-L-岩藻糖的活性)。优选地，GMD或GFS的生物学活性降低50 %或60 %，更优选至少70 %或80 %，最优选至少90 %、95% 或 99%，例如至少 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。可以由于向氨基酸序列引入突变如一个或更多个(例如1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)添加、缺失、插入和/或替换来实现所述酶活性降低。技术人员可以容易地评估GMD或GFS (例如GMD或GFS突变体)的活性相比于完全(100% )活性的GMD或GFS(例如非突变的野生型GMD或GFS)是否降低。合适的酶活性实验为本领域的技术人员已知。然而，如上所提及的，GMD和/或GFS的酶活性降低必须达到下述程度/水平，即:使得从GDP-D-甘露糖起始的GDP-L-岩藻糖合成途径(从头途径)阻断至少50 %，优选至少60 %或70 %，更优选至少80 %或90 %，最优选至少95 %或100 %(见上文)。
[0133]因此，对于在从头途径没有被阻断的真核细胞中其糖部分和/或氨基酸上通常包含(天然)岩藻糖的分子，在本发明的真核细胞中(例如在包含GMD和/或GFS和岩藻糖类似物的真核细胞中)产生的分子在其糖部分和/或氨基酸上缺乏(天然)岩藻糖，取而代之的是包含(天然)岩藻糖的岩藻糖类似物。
[0134]在一些优选的实施方案中，所述细胞不包含具有酶活性的GDP-甘露糖脱水酶(GMD)，这是由于
[0135](i)所述GMD被突变使得其无法催化将⑶P-甘露糖转变为⑶P-6-脱氧-D-来苏
4-己酮糖的反应，
[0136](ii)编码GMD的基因被部分地或全部敲除使得不表达具有酶活性的GMD，所述具有酶活性的GMD能够催化将⑶P-甘露糖转变为⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖的反应，或者
[0137](iii)调节GMD基因表达的启动子区被部分地或全部缺失使得不表达具有酶活性的GMD，所述具有酶活性的GMD能够催化将⑶P-甘露糖转变为⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖的反应，和/或
[0138]所述细胞不包含具有酶活性的⑶P-岩藻糖合成酶(GFS)，这是由于
[0139](i)所述GFS被突变使得使得其不能使用⑶P-6-脱氧-D-来苏_4_己酮糖作为底物并将其转变为GDP-L-岩藻糖，
[0140](ii)编码GFS的基因被部分地或全部敲除使得不表达具有酶活性的GFS，所述具有酶活性的GFS能使用GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖作为底物并将其转变为GDP-L-岩藻糖，或
[0141](iii)调节GFS基因表达的启动子区被部分地或全部缺失使得不表达具有酶活性的GFS，所述具有酶活性的GFS能使用GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖作为底物并将其转变为⑶P-L-岩藻糖。
[0142]优选地，还敲低或部分敲低GMD和/或GFS的酶活性。GMD和/或GFS的酶活性敲低可以由特异性siRNA或miRNA的组成型和稳定表达(例如在所述细胞中以附加体形式存在)实现，所述siRNA或miRNA在mRNA水平阻断/抑制GMD和/或GFS的表达。
[0143]可以通过蛋白质显微注射、蛋白质电穿孔或蛋白质脂质体转染将所述GMD和/或GFS突变体引入本发明的真核细胞中。也可以通过DNA显微注射、DNA电穿孔或DNA脂质体转染将编码GMD突变体的核酸序列和/或编码GFS突变体的核酸序列(优选整合在表达载体中)引入本发明的真核细胞中。在一些优选的实施方案中，所述GMD突变体和/或GFS突变体表达自在本发明的真核细胞中瞬时存在或稳定存在的核酸序列。
[0144]还优选，在所述真核细胞中岩藻糖补救途径被另外地阻断。由此，当培养本发明的真核细胞(例如脊椎动物细胞)时，优选使用不合岩藻糖和岩藻糖基化糖蛋白的培养基。
[0145]取而代之地，生长培养基或培养培养基中掺入岩藻糖类似物，其被本发明的真核细胞(例如脊椎动物细 胞)所摄取(例如通过主动运输或被动扩散)，所述岩藻糖类似物被本发明的真核细胞(例如脊椎动物细胞)耐受并经补救途径代谢，并且所述岩藻糖类似物稳定的足以在上游细胞培养过程中替代天然岩藻糖连接至糖部分和/或氨基酸。[0146]优选地，本发明的真核细胞(例如脊椎动物细胞)还包括至少一个(接受体(acceptor))分子，其是/能够作为岩藻糖基转移酶的底物(例如蛋白质或脂质)。
[0147]本发明上下文中使用的术语“是/能够作为岩藻糖基转移酶底物的(接受体)分子”是指如果在具有未经改变之岩藻糖基化活性的细胞中产生则包含与至少一个岩藻糖残基连接之糖部分和/或氨基酸的任何目的化合物(例如，蛋白质、多肽、肽、脂质、脂质片段或融合蛋白)。这种化合物是岩藻糖基转移酶的合适底物。因此，优选的(接受体)分子为糖蛋白、糖多肽、糖肽、糖脂、糖脂片段或者糖基化的融合蛋白。本发明上下文中使用的术语“能够作为岩藻糖基转移酶底物的(接受体)分子”还表示任何目的化合物(例如，蛋白质、多肽、肽、脂质、脂质片段或融合蛋白)，前提是如果在具有未经改变之岩藻糖基化活性的细胞中产生则其为与至少一个岩藻糖残基连接的预期糖基化化合物(例如糖蛋白、糖多肽、糖肽、糖脂、糖脂片段或经糖基化的融合蛋白)。优选地，所述蛋白质不是原核生物来源的。特别优选地，所述蛋白质是哺乳动物蛋白质或由其来源的蛋白质。 [0148]在本发明的真核细胞(例如脊椎动物细胞)中(即在从头途径被阻断并且另外优选地由于在缺乏岩藻糖但包含岩藻糖类似物的培养基中培养补救途径被抑制的细胞中)存在能够作为岩藻糖基转移酶之底物的分子导致产生在其糖部分和/或氨基酸上不包含(天然)岩藻糖但在其糖部分和/或氨基酸上包含岩藻糖类似物的分子。
[0149]因此，所述分子(例如蛋白质或脂质)可以是下述分子:即所述分子(i)在其糖部分上天然地包含(天然)岩藻糖和/或(ii)在其结构(例如氨基酸序列)中包含蛋白质-O-岩藻糖基转移酶识别位点。
[0150]所述蛋白质-O-岩藻糖基转移酶识别位点可以是天然的识别位点例如在所述分子结构(例如氨基酸序列)中天然存在的，或者可以是非天然(人工)识别位点例如另外地引入所述分子(例如蛋白质或脂质)的分子结构(例如氨基酸序列)的识别位点。
[0151]优选地，所述分子(例如蛋白质)包含(例如天然地和/或人工地)一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个，优选地I或2个)EGF样重复，所述EGF样重复包含丝氨酸和/或苏氨酸残基，其被蛋白质-O-岩藻糖基转移酶(优选地，P0FUT1)识别。所述酶可以以O-连接将岩藻糖糖类添加至在所述EGF样重复中第二个和第三个保守的半胱氨酸之间的丝氨酸或苏氨酸残基。所述蛋白质是反向(inverting)岩藻糖基转移酶,其意味着所述酶使用GDP-L-岩藻糖作为供体底物并将O-连接的岩藻糖转移到蛋白质从而产生岩藻糖-α -O-丝氨酸/苏氨酸。在本发明的真核细胞中(即在从头途径被阻断并且另外优选地由于在缺乏岩藻糖但包含岩藻糖类似物的培养基中培养补救途径被抑制的细胞中)，所述酶，即蛋白质-O-岩藻糖基转移酶(优选地P0FUT1)将岩藻糖类似物而不是(天然)岩藻糖结合至其识别位点。
[0152]更优选地，所述EGF样重复是具有SEQ ID NO: 10或其变体之氨基酸序列的EGF样重复，所述变体与所述氨基酸序列有至少80 %或85 %，更优选地90 %或95 %，最优选地 98 % 或 99 %，例如 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98，或99%的同一性。在一些优选的实施方案中，所述序列同一性是针对至少10、12、15、17、20、22或更多个氨基酸的连续延伸，优选地针对各自参考序列(SEQ ID NO:10)的整个长度。在一些特别优选的实施方案中，所述序列同一性是针对各自参考序列多肽(SEQ IDNO:10)之全长的至少95%、针对全长的至少96%、针对全长的至少97%、针对全长的至少98%或针对全长的至少99%。还特别优选上述变体是功能活性变体。这意味着一个或更多个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸替换、添加、缺失或插入之形式的变化位于允许蛋白质-O-岩藻糖基化位点的识别和/或通过蛋白质-O-岩藻糖基转移酶将岩藻糖类似物连接至至所述位点的以上所述的氨基酸位置之外。本领域的技术人员清楚如何评估岩藻糖类似物是否仍然可以连接至包含于上述分子中之EGF样重复变体的技术。一种合适的技术为例如 MALD1-TOF/TOF。
[0153]最优选地，所述EGF样重复(例如SEQ ID NO:10或其变体)结合在/包含于所述分子(例如蛋白质)的C末端和/或N末端。
[0154]另外地或作为替代地，还优选所述分子(例如蛋白质)包含(例如天然地和/或人工地)一个或更多个血小板反应蛋白(thrombospondin)重复,所述血小板反应蛋白重复包含被蛋白质-O-岩藻糖基转移酶(优选地P0FUT2)识别的丝氨酸和/或苏氨酸残基。所述酶可以以O连接将岩藻糖糖类添加至血小板反应蛋白重复。所述蛋白质是反向岩藻糖基转移酶，其意味着所述酶使用GDP-L-岩藻糖作为供体底物并将岩藻糖以O连接转移至所述蛋白质从而产生岩藻糖-α -O-丝氨酸/苏氨酸。在本发明的真核细胞中，即在从头途径被阻断并且补救途径优选地另外被抑制的细胞中，由于在缺乏岩藻但包含岩藻糖类似物的培养基中培养，所述酶，即蛋白质-O-岩藻糖基转移酶(优选地P0FUT2)，将岩藻糖类似物而不是(天然)岩藻糖结合至其识别位点。
[0155]本发明上下文中使用的术语“在其糖部分上天然地包含岩藻糖的分子”是指在能够将岩藻糖加至糖部分(即，具有未经改变的将岩藻糖加至糖部分的能力)的真核细胞(例如脊椎动物细胞)中产生后包含含有至少一个岩藻糖残基之糖部分的任何化合物。这种分子包含被聚糖转移酶识别的至少一个或更多个序列模体，例如包含Asp、Ser或Thr残基(优选三肽序列Asn-X-Ser/Thr，其中X是除Pro以外的任意氨基酸)。产生包含具有岩藻糖之糖部分的细胞(例如真核细胞，如脊椎动物细胞)的优选实例有CH0、AGE1.HN、AGE1.CR、AGE1.CR.PIX*AGE1.CS。优选地，这种化合物是融合蛋白或脂质。优选地，所述蛋白质是真核(优选脊椎动物，`最优选哺乳动物来源或由其衍生的)的。在本发明的真核细胞中，即在从头途径被阻断并且优选地补救途径另外被抑制的细胞中，由于在缺乏岩藻但包含岩藻糖类似物的培养基中培养，所述分子在其糖部分上包含(优先或仅仅)岩藻糖类似物，而不是(天然)岩藻糖。
[0156]所述能够作为岩藻糖基转移酶之底物的分子也可以是病毒组分。所述的病毒组分可以是任何糖基化的实体，例如包含于包膜活病毒(无论减毒的还是野生型)、灭活的或裂开的死包膜病毒、分离的或纯化的病毒糖蛋白或病毒糖脂、或由生产细胞所感染的病毒表达载体编码并产生的糖蛋白。为了获得已将岩藻糖类似物并入其病毒组分的病毒，必须使用根据本发明的细胞，即经改造的阻断了岩藻糖的从头合成并且优选地消除了 α-1，3_岩藻糖基转移酶活性的细胞。
[0157]优选地，能够作为岩藻糖基转移酶之底物的分子为蛋白质或多肽，优选内源或外源蛋白质或多肽。术语“外源蛋白质或多肽”是指来自相应细胞外部的任何蛋白质或多肽或者在细胞内部由导入相应细胞中的核酸表达的任何蛋白质或多肽。术语“内源蛋白质或多肽”是指由细胞基因组编码的任何蛋白质。优选地，目的蛋白质或多肽(即，期望的糖蛋白或糖多肽)在真核细胞中重组表达。优选地，所述蛋白质或多肽由瞬时存在或稳定维持于真核细胞中的核酸序列表达。合适的表达载体和表达控制序列已在上文有关酶的描述中有述。这些可以等同地用于编码目的蛋白质之核酸的表达的情况中。
[0158]因此，在本发明的一个优选实施方案中，所述真核细胞(例如脊椎动物细胞)包含:
[0159](i)至少一种多核苷酸,其包含编码酶⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖还原酶(MD)、⑶P-过骨胺合成酶(Per)、⑶P_6_脱氧-D-塔洛糖合成酶(GTS)、⑶P-岩藻糖合成酶Cysl09Ser-(GFS-Cysl09Ser)突变体、⑶P-4-酮-6-脱氧甘露糖_3_脱水酶(ColD)或GDP-L-可立糖合酶(ColC)的核酸序列，所述核酸序列与允许编码所述各个酶的核酸序列表达的特异性表达控制序列有效连接，和
[0160](ii)至少一种多核苷酸，其包含编码目的蛋白(即，期望的糖蛋白，例如抗体，如IgGl)的核酸序列，所述核酸序列与导致编码所述目的蛋白(例如抗体，如IgGl)的核酸序列在所述细胞中表达的特异性表达控制序列有效连接。
[0161]因此，(i)酶觀0、？61'、6了5、6?5-078109561'和/或(:010，优选地(:010与(:01(:的组合，和(ii)目的蛋白质(即期望的糖蛋白，例如抗体，如IgGl)在本发明的真核细胞(例如脊椎动物细胞)中表达。
[0162]以上所提到的多核苷酸可以通过转染、电穿孔或脂质体转染引入细胞。所述转染、电穿孔或脂质体转染可以根据本领域的技术人员已知的标准流程进行。在引入外源核酸之后，可以通过向培养基添加例如抗生素(例如G418、嘌呤霉素、新霉素或遗传霉素)来施加选择压力从而筛选经转染、经电穿孔或经脂质体转染的细胞。合适的选择系统在本领域内是公知的。
[0163]优选地，所述蛋白质或多肽为抗原结合蛋白或多肽，优选地是抗体，更优选地为IgGl抗体，抗体片段，更优选地包含抗体的Fe区的抗体片段，抗体融合蛋白，更优选地是包含抗体Fe区的抗体融合蛋白，病毒蛋白，病毒蛋白片段，或抗原。另一个优选的蛋白质是酶、细胞因子、淋巴因子、激动剂、拮抗剂或激素。
[0164]期望的蛋白质或多肽的特定实例包括但不限于，胰岛素、胰岛素样生长因子、hGH、tPA、细胞因子例如白介素(IL)(如 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-1U IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18)、干扰素(IFN) a、IFN^、IFNy、IFNco、或 IFN tau、肿瘤坏死因子(TNF)例如 TNFa 和 TNFP、TNF Y、TRAIL、G_CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1和VEGF。还包括产生促红细胞生成素或任何其它激素生长因子。优选地，上述分子具有治疗和/或诊断用途。
[0165]所述抗体可以是单克隆抗体(包括全长抗体)或多克隆抗体。优选地，所述抗体或抗体片段选自=IgG(例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA、IgE、IgMjP IgD、单链抗体、单结构域抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、scFv、dsFv、scFab、maxibody、纳米抗体、transbody、双抗体、adnectin、evibody、DARpin、亲和体(affibody)、锚蛋白(ankyrin)、iMab、骆驼科动物(camelid)抗体、衍生自骆驼科动物仅重链抗体的糖基化单结构域抗原结合片段、工程化脂质运载蛋白型蛋白质例如Anticalin、Affilin或Kunitz结构域和knottin,随后是免疫球蛋白(优选地人来源)的至少一个优选两个恒定结构域(Fe)。
[0166]优选地，所述抗体或抗体片段为
[0167](i)天然抗体或抗体片段[0168](ii)非天然抗体或抗体片段,优选抗体突变体或抗体片段突变体。
[0169]所述抗体突变体或抗体片段突变体也可以被指定为经修饰抗体或经修饰抗体片段。所述天然抗体或天然抗体片段也可以被指定为未经修饰抗体或未经修饰抗体片段。
[0170]在一些优选的实施方案中，(天然的或经修饰)抗体包含两条重链或者(天然的或经修饰)抗体片段包含重链，更优选地重链的恒定结构域(CH结构域)。
[0171]特别优选地，所述天然抗体包含两条重链，其中每条重链具有在天冬酰胺N297处的天然N-糖基化位点(根据Kabat编号系统编号)，或者所述天然抗体片段包含重链，更优选地重链的恒定结构域(CH结构域)，其具有在天冬酰胺N297处的天然N-糖基化位点(根据Kabat编号系统编号)。
[0172]还特别优选地，所述经修饰抗体包含两条重链，其中每条重链具有在天冬酰胺N159处的人工N-糖基化位点，特别地由于S161替换G161而产生，和/或在天冬酰胺N276处的人工N-糖基化位点，特别地由于S278替换Y278而产生(全部根据Kabat编号系统编号)，或者该经修饰抗体片段包含重链，更优选地，重链的恒定结构域(CH结构域)，其在天冬酰胺N159处具有人工N-糖基化位点，特别地由于S161替换G161而产生，和/或在天冬酰胺N276处具有人工N-糖基化位点，特别地由于S278替换Y278而产生(全部根据Kabat编号系统编号)。
[0173]优选地，上述经修饰抗体或经修饰抗体片段与其对应的野生型/非经修饰抗体或抗体片段的差异在于经修饰抗体或经修饰抗体片段每条重链(更优选地重链的每个恒定结构域(CH结构域))包含一个或更多个例如1、2、3、4、5、6、7或8个(优选地1、2、3或4个)另外的功能性N-糖基化糖连接用肽段(N-glycosylation sequon)。这对于另外的人工N-聚糖的连接是特别有用的。因此，所述经修饰抗体或经修饰抗体片段可提供每个抗体分子多于两个的通常可存在的N-糖基化糖连接用肽段(每条重链或CH结构域一个)。这又允许每个抗体分子偶联多于两个的岩藻糖类似物(每条重链或CH结构域一个)，其可以与另外的人工N-聚糖连接。
`[0174]本文所使用的术语“糖连接用肽段(sequon) ”指在蛋白质或多肽中的3个连续氨基酸的序列，其可以作为多糖(糖)连接位点(称为N-连接-聚糖)。其为通过在天冬酰胺(Asn)侧链中的氮原子与蛋白或多肽相连的多糖。糖连接用肽段可以是Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
[0175]因此，还特别优选，所述经修饰抗体包含两条重链，其中每条重链在天冬酰胺N297处有天然的N糖基化位点并且还在天冬酰胺N159处有人工N糖基化位点(特别地，由于S161替换G161而产生)和/或在天冬酰胺N276处有人工N-糖基化位点(特别地，由于S278替换Y278而产生)(全部根据Kabat编号系统编号)，或者所述经修饰抗体片段包含重链优选重链的恒定结构域(CH结构域)，其在天冬酰胺N297处有天然的N糖基化位点并且还在天冬酰胺N159处有人工N糖基化位点(特别地，由于S161替换G161而产生)和/或在天冬酰胺N276处有人工N-糖基化位点(特别地，由于S278替换Y278而产生)(全部根据Kabat编号系统编号)。
[0176]因此，在一个优选的实施方案中，包含两条重链的抗体或包含重链(H)(优选重链的恒定结构域(CH结构域))的抗体片段包含一个或更多个选自以下的N-糖基化位点--天冬酰胺N297、天冬酰胺N159和天冬酰胺N276 (全部根据Kabat编号系统编号)。在一个特别优选的实施方案中，包含两条重链的抗体每条重链包含1、2或3个选自以下的N-糖基化位点:天冬酰胺N297、天冬酰胺N159和天冬酰胺N276 (全部根据Kabat编号系统编号)，或者包含重链(H)(优选重链的恒定结构域(CH结构域))的抗体片段包含1、2或3个选自以下的N-糖基化位点:天冬酰胺N297、天冬酰胺N159和天冬酰胺N276 (全部根据Kabat编号系统编号)。如上所述，在天冬酰胺N159处的N糖基化位点特别地由于S161替换G161而产生，以及在天冬酰胺N276处的N-糖基化位点特别地由于S278替换Y278而产生(全部根据Kabat编号系统编号)。
[0177]更优选地，所述抗体或抗体片段包含抗体重链恒定结构域，所述结构域具有根据SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核酸序列，其中氨基酸G161 (CH)和/或Y278 (CH)(根据Kabat编号系统编号)被丝氨酸所替换。这些替换允许在天冬酰胺N159和/或N276处N糖基化(参见上文)。所述抗体或抗体片段还可包含在天冬酰胺N297处(CH)(根据Kabat编号系统编号)的功能性天然N糖基化位点。因此，这样的经修饰抗体可以实现所限定的两个至六个岩藻糖类似物的连接，或者这样的经修饰抗体片段可以实现所限定的一个至三个岩藻糖类似物的连接。
[0178]还优选根据SEQ ID NO:8 (IgGlCH等位基因01，人)之氨基酸序列的变体，其中氨基酸G161 (CH)和/或Y278 (CH)(根据Kabat编号系统编号)被丝氨酸替换，其与所述氨基酸序列有至少90%，更优选地至少95%，最优选地至少99%，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的同一性；或者根据SEQ ID NO:9 (IgGlCH等位基因02，人)之氨基酸序列的变体，其中氨基酸G161 (CH)和/或Y278 (CH)(根据Kabat编号系统编号)被丝氨酸替换，其与所述氨基酸序列有至少90%，更优选地至少95%，最优选地至少99%，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的同一性。在一些优选的实施方案中，序列同一性是针对20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、120个或更多个氨基酸的连续延伸，优选地针对各参考多肽的全长。在一些特别优选的实施方案中，针对相应参考多肽的整个长度，同一性为至少95%、针对整个长度至少96%、针对整个长度至少97%、针对整个长度至少98%或针对整个长度至少99%。
[0179]还特别优选,之前提到的变体是功能活性变体。这意味着上文所示范围中一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)氨基酸替换、添加、插入或缺失之形式的变化位于允许N-糖基化位点的识别和额外人工N-聚糖和/或天然N-聚糖连接至所述位点的以上所述的氨基酸位置之外或不同于上文所述氨基酸位置。这意味着(i)根据SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之氨基酸序列的功能活性(functionally active)变体(其中S161替换了 G161从而在天冬酰胺N159处生成N-糖基化位点)在这些位置没有氨基酸变化，可以在以上限定的范围内的另外的氨基酸位置发生变化，(ii)根据SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之氨基酸序列的功能活性变体(其中S278替换了 Y278从而在天冬酰胺N276处生成N-糖基化位点)在这些位置没有氨基酸变化，可以在以上限定的范围内的另外的氨基酸位置发生变化，(iii)根据SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之氨基酸序列的功能活性变体(其中G161替换了 S161从而在天冬酰胺N159处生成N-糖基化位点并且S278替换了 Y278从而在天冬酰胺N276处生成N-糖基化位点)在这些位置没有氨基酸变化，可以在以上限定的范围内的另外的氨基酸位置发生变化。所述功能活性变体还可包含在未突变的天冬酰胺N297处的N-糖基化位点(全部根据Kabat编号系统编号)。[0180]换句话说，在上述功能活性变体中，聚糖转移酶所识别的序列模体(例如包含Asp、Ser或Thr残基,优选三肽序列Asn-X-Ser/Thr,其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)仍然存在并且未突变。
[0181]本领域的技术人员清楚用于以下的技术:如何评估N-聚糖是否仍可连接另外的人工N-聚糖和/或在上述抗体或抗体片段变体中包含的天然N-聚糖，并因此评估是否仍可偶联岩藻糖类似物。一种合适的技术是例如MALD1-T0F/T0F。
[0182]对于Kabat 编号方案，可参见 Kabat 等，1983E.A.Kabat, Τ.Τ.W u, H.Bilofsky,M.Reid-MiIIer和H.Perry,Sequence of Protein of Immunological Interest,NationalInstitutes of Health,Bethesda(1983))。尽管Fe区的边界可以变化,但是人IgG重链Fe区通常被定义为包含残基C226或P230至其羧基末端，其中根据如EU指数编号，如描述于Kabat 等(1991, NIH PubIication91-3242, National Technical Information Service,Springfield, Va.)。“EU指 数按照Kabat设置”指人IgGlEU抗体按照在Kabat等中的描述编号。
[0183]优选地，病毒蛋白或病毒蛋白片段包含于有包膜病毒的包膜中。特别优选的是，该病毒蛋白是来自呼吸道合胞病毒的G或F蛋白并且所述病毒蛋白片段是所述蛋白质的细胞外片段。本发明的另一个方面是包含所述病毒蛋白或病毒蛋白片段的病毒。
[0184]还优选所述能够作为岩藻糖基转移酶底物的分子是脂质。优选地，所述脂质是甘油糖脂，最优选半乳糖脂、硫脂(SQDG)或鞘糖脂，最优选脑苷脂(例如半乳糖脑苷脂或葡萄糖脑苷脂)、神经节苷脂、红细胞糖苷、硫脑苷脂或糖磷酸鞘脂(glycophosphosphingolipid)。
[0185]特别优选鞘糖脂(glycosphingolipid,GSL)。鞘糖脂含有疏水性神经酰胺锚定部分N-酰基鞘氨醇以及由糖组成的亲水性头部基团。其通常存在于细胞膜的外表面。糖部分的组成是细胞类型特异性的，其取决于生物体的发育阶段，或者可以随细胞的致癌状态而改变。
[0186]特别优选包含于包膜病毒的包膜中的脂质。
[0187]本发明的又一方面是包含所述脂质的病毒。本发明的另一方面是包含所述脂质和所述蛋白质的病毒。最优选地，所述蛋白质或脂质包含于包膜病毒的包膜中。如以上已经提及的，所述蛋白质或脂质可以是包含于包膜病毒之包膜中的病毒蛋白质或脂质。优选地，所述包膜病毒被完整地或部分地用作病毒疫苗的活性组分。术语“病毒疫苗”指被减弱或杀死的病毒制剂，其在施用后能刺激抗体的生产或针对病毒的细胞免疫，但无法引起严重感染。
[0188]上文所述的病毒可以通过病毒感染导入真核细胞(例如脊椎动物细胞)中。还可以通过导入编码待产生病毒之所有或一部分的核酸而将病毒导入真核细胞(例如脊椎动物细胞)中。在有必要提供复制、装配等所需蛋白质的情况下，这通常通过利用能够表达一种或更多种病毒蛋白的病毒产生细胞系来实现。例如，HEK293、Per.C6和AGE1.HN细胞表达腺病毒ElA蛋白，并因此能够补偿缺乏El编码区的DNA。
[0189]在真核细胞(例如脊椎动物细胞)中包含糖部分之分子(例如蛋白质或脂质)的岩藻糖基化需要核苷酸糖(GDP-L-岩藻糖)作为供体并且还需要存在特定的岩藻糖基转移酶，所述酶将岩藻糖基残基从供体转移至接受体分子。在来自真核细胞(例如脊椎动物细胞)的聚糖中，岩藻糖可通过α -1，3连接(末端岩藻糖)连接至触角GlcNAc,或通过α 1，6连接(核心岩藻糖)连接至连接了天冬酰胺的GlcNAc。
[0190]为了实现将岩藻糖类似物均一、稳定、定点地结合至所述分子(例如蛋白质例如抗体)，优选通过α 1，6连接将岩藻糖类似物(而不是天然岩藻糖)结合至几丁二糖核心。因此，本发明的真核细胞(例如脊椎动物细胞)优选地包含具有酶活性的α-1，6_岩藻糖基转移酶。在本发明的真核细胞(例如脊椎动物细胞)中，如果想要产生仅包含1，6岩藻糖基化位点的结合岩藻糖类似物的蛋白质(例如天然的，未修饰的抗体)，那么(仅)存在具有酶活性的α-1，6-岩藻糖基转移酶是特别优选的。这还可以另外提高通过α-1，6_岩藻糖基转移酶N-糖基化位点偶联至蛋白质的岩藻糖类似物的电荷均一性。
[0191]作为替代地或另外地，本发明的真核细胞优选地包含具有酶活性的蛋白质-O-岩藻糖基转移酶。蛋白质-O-岩藻糖基转移酶(POFUTl)是通常负责将岩藻糖糖类以O-连接添加至丝氨酸或苏氨酸残基的酶。该蛋白是反向糖基转移酶，这意味着所述酶使用GDP-P-L-岩藻糖作为供体底物并将岩藻糖以O-连接转移到蛋白质产生岩藻糖基- α -O-丝氨酸/苏氨酸。在本发明的真核细胞，它可以以O-连接将岩藻糖类似物而不是天然岩藻糖添加到包含于分子结构的丝氨酸或苏氨酸残基。在本发明的真核细胞(例如脊椎动物细胞)中，如果想要产生包含一个或更多个例如1、2、3或4个EGF样重复的偶联岩藻糖类似物的蛋白质，所述EGF样重复包含丝氨酸和/或苏氨酸残基，其中所述残基被蛋白质-O-岩藻糖基转移酶所识别，那么(仅)存在蛋白质-O-岩藻糖基转移酶是特别优选的。这还可以提高通过蛋白质-O-岩藻糖基化位点偶联至蛋白质之岩藻糖类似物的电荷均一性。
[0192]在另一个优选的实施方案中，本发明的真核细胞不包含具有酶活性的α-1，3_岩藻糖基转移酶。优选地，α-1，3-岩藻糖基转移酶活性被消除，由于α-1，3-岩藻糖基化抑制因子(suppressor)例如组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase5, Hdac5)的过表达，更优选组成型和/或稳定过表达。还优选所述细胞不包含具有酶活性的-1，3-岩藻糖基转移酶，这是由于(i)所述酶被突变使得其不再有功能活性，(ii)编码所述酶的基因被部分或全部敲除使得不表达具有功能活性的酶，或(iii)调控所述酶之基因表达的启动子区被部分或完全缺失使得不表达具有功能活性的酶。也可以使用miRNA和/或siRNA敲低所述α-1，3-岩藻糖基转移酶。
[0193]在本发明的真核细胞(例如脊椎动物细胞)中，如果想要产生除天然N-糖基化位点之外包含人工引入的N-糖基化位点(例如在抗体中在氨基酸位置Ν276和/或Ν159处弓丨入的人工N-糖基化位点，和在氨基酸位置Ν297处的天然N-糖基化位点(根据Kabat系统编号))的偶联岩藻糖类似物的蛋白质(例如抗体)，则不存在具有酶活性的α-1，3_岩藻糖基转移酶是特别优选的。α-1，3-岩藻糖基转移酶和α-1，6-岩藻糖基转移酶可接近所述人工N糖基化位点(由于该位置处的特定聚糖结构)，而α-1，6-岩藻糖基转移酶可接近天然N糖基化位点(由于该位置处的特定聚糖结构)。因此，为了允许产生具有高结合稳定性和同质性的分子-药物活性化合物-缀合物，优选(仅)存在具有酶活性的α-1，6-岩藻糖基转移酶并且缺乏具有酶活性的α -1，3-岩藻糖基转移酶。
[0194]使用优选地缺乏α-1，3_岩藻糖基转移酶的本发明的真核细胞导致仅保留蛋白质-O-岩藻糖基转移酶和`α -1，6-岩藻糖基转移酶活性，并且因此留下蛋白质-O-连接氨基酸位点和α -1,6-连接核心岩藻糖基化位点作为仅有的岩藻糖类似物可以结合的位点。这允许产生具有高结合稳定性和同质性的结合了岩藻糖类似物的蛋白质，特别地产生抗体，其包含可以被α -1，6-岩藻糖基转移酶识别的N-糖基化位点和可以被蛋白质-O-岩藻糖基转移酶识别的氣基酸残基二者。
[0195]优选地，所述真核细胞是脊椎动物细胞。特别优选的是脊椎动物细胞为哺乳动物、鱼类、两栖类、爬行类的细胞或鸟类细胞。
[0196]更优选为:
[0197](i)哺乳动物细胞是人、小鼠、大鼠、仓鼠、狗或猴细胞，更特别地中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、叙利亚仓鼠成纤维(BHK21)细胞(ATCC CCL-10)、SP2/0_Agl4细胞(ATCCCRL-1581)、NSO 细胞(ECACC 号 85110503)、人宫颈癌(HELA)细胞(ATCC CCL2)、人 PER.C6细胞或人AGE1.HN细胞，
[0198](ii)鱼类细胞是斑点叉尾麵(Ictalurus punctatus)(河It)细胞，更特别地斑点叉尾鮰(河鲶)卵巢(CCO)细胞(ATCC CRL-2772)，
[0199](iii)两栖动物细胞是非洲爪蟾(Xenopus Iaevis)细胞，更特别地非洲爪蟾肾细胞(ATCC CCL-102)，
[0200](iv)爬行动物的细胞是绿鬣蜥(Iguana iguana)细胞，更特别地绿鬣蜥心脏(IgH-2)细胞(ATCC CCL-108)，或
[0201](V)鸟类细胞是鸟视网膜细胞，特别地AGE1.CR.PIX细胞，或鸟体节细胞。
[0202]细胞系AGE1.CR.PIX于2005年11月24日保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, MascheroderWeglb，3812姐raunschweig，Germany)，保藏号为 DSM ACC2749。细胞系 AGEl.HN 于 2005 年 11月4日保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weglb, 38124Braunschweig, Germany),保藏号为 DSMACC2744。
[0203]如上所述，特别优选所述细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。CHO细胞是最初于1952年分离的细胞。亲本谱系CHO pro-的衍生物(特别是CH0-K1)(其可以在本文使用)为CHO-S和CHO-SV细胞。该谱系的一个变体(DUKX Bll)经修改从而仅含有一个被突变失活的dhfr基因等位基因。另一个CHO亚系(DG44)从共同的祖先更早的脱离并缺乏两个dhfr等位基因(Urlaub 等，1986，Proc Natl Acad Sci USA.83 (2):337-341)。在本发明的一些最优选实施方案中，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为CHO-Kl或CH0-DG44细胞。
[0204]CHO-Kl或CH0-DG44细胞在生产重组蛋白质和抗体中广泛使用。除了 CHO通常的高灵活性(flexibility)，CHO-Kl或CH0-DG44细胞均有各自的独特特征。CHO-Kl细胞生长至更高的峰值细胞密度，而DG44细胞通常表现出更高的单位生产力(specificproductivity)。通常情况下,培养基无法兼容这两个细胞系。优选的细胞系总结在下表1:
[0205]表1
[0206]
【权利要求】
1.一种真核细胞，其用于产生包含岩藻糖类似物的分子，其中 (i)在所述细胞中从GDP-D-甘露糖起始的GDP-L-岩藻糖合成途径被阻断，并且 (?)所述细胞包含⑶P-L-岩藻糖类似物。
2.根据权利要求1所述的细胞,其中所述细胞包含至少一种使用GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖作为底物的酶，其中所述酶不催化将GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖转变成⑶P-L-岩藻糖的反应。
3.根据权利要求2所述的细胞，其中所述使用GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖作为底物的酶选自:⑶P-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖还原酶(RMD)、⑶P-过骨胺合成酶(Per)、⑶P-6-脱氧-D-塔洛糖合成酶(GTS)、⑶P-岩藻糖合成酶Cysl09Ser-(GFS-Cysl09Ser)突变体、⑶P-4-酮-6-脱氧甘露糖-3-脱水酶(ColD)，优选⑶P-4-酮-6-脱氧甘露糖_3_脱水酶(ColD)联合GDP-L-可立糖合酶(ColC)，及其变体。
4.权利要求2或3所述的细胞，其中所述酶由瞬时存在或稳定维持于所述细胞中的核酸序列表达。
5.权利要求1至4所述的细胞，其中所述细胞 (i)不包含具有酶活性的⑶P-甘露糖脱水酶(GMD)或包含酶活性降低的⑶P-甘露糖脱水酶(GMD)，和/或 (?)不包含具有酶活性的⑶P-岩藻糖合成酶(GFS)或包含酶活性降低的⑶P-岩藻糖合成酶(GFS)。
6.根据权利要求1至5所述的细胞，其中所述细胞还包含至少一种能够作为岩藻糖基转移酶底物的分子。
7.根据权利要求6所述的细`胞，其中所述分子是蛋白质或脂质。
8.根据权利要求7所述的细胞，其中所述蛋白质是内源性或外源性蛋白质。
9.根据权利要求8所述的细胞，其中所述外源性蛋白质由瞬时存在或稳定维持于所述细胞中的核酸序列表达。
10.权利要求7至9所述的细胞，其中所述蛋白质为抗原结合蛋白，优选抗体，更优选IgGl抗体，病毒蛋白或抗原。
11.权利要求1至10所述的细胞，其中所述细胞不包含具有酶活性的α-1，3-岩藻糖基转移酶。
12.权利要求1至11所述的细胞,其中所述细胞是脊椎动物细胞。
13.权利要求12所述的细胞，其中所述脊椎动物细胞是哺乳动物、鱼、两栖类、爬行类的细胞或鸟类细胞。
14.权利要求13所述的细胞，其中 (i)所述哺乳动物细胞是人、仓鼠、狗或猴细胞，优选中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、叙利亚仓鼠成纤维(BHK21)细胞(ATCC CCL-10)、SP2/0-Agl4 细胞(ATCC CRL-1581)、NSO 细胞(ECACC 号 85110503)、人宫颈癌(HELA)细胞(ATCC CCL2)、人 PER.C6 细胞或人 AGE1.HN 细胞， (?)所述鱼细胞是斑点叉尾麵(Ictalurus punctatus)(河It)细胞,优选斑点叉尾鮰(河鲶)卵巢(CCO)细胞(ATCC CRL-2772)，(iii)所述两栖类细胞是非洲爪蟾(XenopusIaevis)细胞，优选非洲爪蟾肾细胞(ATCC CCL-102)， (iv)所述爬行类细胞是绿鬣蜥(Iguanaiguana)细胞,优选绿鬣蜥心脏(IgH_2)细胞(ATCC CCL-108);或者 (V)所述鸟类细 胞是鸟视网膜细胞，优选AGE1.CR.PIX细胞或鸟体节细胞。
15.权利要求1至14所述的细胞，其中所述GDP-L-岩藻糖类似物包含一个或更多个反应性或活化的取代。
16.权利要求1至15所述的细胞，其中所述GDP-L-岩藻糖类似物是从L-岩藻糖类似物合成的。
17.根据权利要求16的细胞，其中L-岩藻糖类似物是全乙酰化的岩藻糖类似物，优选1，2，3，4-四乙酰基-叠氮基-岩藻糖的吡喃糖形式。
18.一种用于生产包含岩藻糖类似物之分子的方法，包括以下步骤: (i)提供根据权利要求1至17所述的真核细胞，和 (?)从来自i)的细胞中分离包含岩藻糖类似物的分子。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞在步骤(ii)分离所述分子之前培养于缺乏天然岩藻糖或天然岩藻糖代谢前体的细胞培养基中。
20.可由权利要求18或19所述方法获得的包含岩藻糖类似物的分子。
21.根据权利要求20所述的分子，其中所述岩藻糖类似物包含用于结合药物活性化合物的一个或更多个反应性或活化的取代。
22.用于生产包含分子和药物活性化合物之缀合物的方法，所述分子包含岩藻糖类似物，所述方法包括以下步骤: (i)实施权利要求18或19所述的方法，和 (?)通过岩藻糖类似物将药物活性化合物共价地偶联到包含所述岩藻糖类似物的分子。
23.可由权利要求22所述方法获得的包含含岩藻糖类似物之分子和药物活性化合物的缀合物。
24.包含蛋白质或多肽缀合物，所述蛋白质或多肽包含一个或更多个以下结构:-NG-cF * -Y0-C, 其中每一个连接到在所述蛋白质或多肽中包含的N-糖基化位点， NG是所述蛋白质或多肽的N-连接的糖部分， CF *是核心岩藻糖类似物， Y是间隔子单元，其中，ο为整数O或1，以及 C是药物活性化合物。
25.权利要求24所述的缀合物，其中所述糖部分是复合型的N-连接糖部分。
26.权利要求24或25所述的缀合物，其中所述多肽是抗体重链(H)。
27.包含两个如权利要求26中所定义之缀合物的抗体。
28.包含蛋白质或多肽的缀合物，所述蛋白质或多肽包含一个或更多个EGF样重复，所述重复包含与以下结构相连接的丝氨酸和/或苏氨酸残基:_F * -Yp-C, 其中F *是直接连接到所述丝氨酸和/或苏氨酸残基的岩藻糖类似物部分，Y是间隔子单元，其中P是整数O或1，且C是药物活性化合物。
29.权利要求28所述的缀合物，其中所述多肽是抗体重链(H)。
30.包含两个如权利要求29中所定义之缀合物的抗体。
【文档编号】C07K16/00GK103732619SQ201280038331
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年5月31日 优先权日:2011年5月31日
【发明者】汉斯·亨宁·冯霍尔斯滕, 沃尔克·桑迪希, 英戈·乔丹, 卡斯滕·温克勒 申请人:普罗拜奥金股份有限公司