用于诱导植物的对疾病的抗性的方法
【专利摘要】本发明涉及用于通过同时激活与水杨酸的途径、与茉莉酸/乙烯的途径和超敏反应相关的基因来刺激植物的天然防御和诱导对疾病的抗性的方法。本发明还涉及油菜素类固醇用于预防性和治愈性处理植物以抵抗由病原体引起的植物疾病的用途。本发明还涉及用于预防和治疗柑桔的黄龙病的方法。
【专利说明】用于诱导植物的对疾病的抗性的方法
发明领域
[0001]本发明涉及农业生物【技术领域】，具体地涉及植物的天然防御的刺激和对疾病的抗性的诱导，以避免由病原体引发的疾病或抵抗所述疾病。
[0002]先前技术
[0003]在最近数十年中，已进行了许多关于植物-病原体相互作用(从形态学、生理学、生物化学和分子的观点来看)的研究。然而，迄今获得的结果未满足世界上大多数研究小组的需要和知识，通过农作物的稳定和高效的保护获得的高产率未实现。尽管在全球范围内为综合的作物保护采取了许多措施，但每年报导，因疾病造成的主要作物损失达到产量的80%，特别是在发生疾病流行的状况下(Gao等人(2000) NatureBiotechnol.18:1307-1310)。
[0004]植物和病原体已共同进化数百万年。在该相互作用过程中，已出现允许植物识别潜在的侵入性病原体并且触发成功防御的策略。同样地，病原体已发展了使得它们能够逃避和/或抑制植物防御反应的机制。该选择压力对植物的影响已导致它们防御机制的改善。作为结果，病原体引发疾病的成功，远非规则，而是例外(Staskawicz (2001)PlantPhysiologyI25:73-76)。
[0005]植物对特异性和一般性诱发物的感知不仅允许识别病原体，而且还允许转导用以激活反应机制的信号。其中被激活的各种信号转导途径是由中间体例如活性氧、水杨酸、乙烯和茉莉酸介导的信号转导途径。这些植物激素信号转导途径之间的交叉提供了调控潜在可能，其允许激活应答的最佳组合，这取决于具体病原体。与致病性(PR)和通常为被产生来直接攻击病原体的植物抗毒素、防御素、酚类和黄酮类的抗微生物化合物的合成相关的基因的表达也被激活(Baker等人(1997) Science276:726-733)。
[0006]存在在植物中起作用 的其它反应机制，其作用在感染后持续相对长的时期。这类机制称为:获得性局部反应和系统性获得性反应。在一圈5-10mm厚的围绕由超敏反应引起的损伤的细胞中观察到获得性局部反应。该区域的特征在于发病机制相关性蛋白质(主要为碱性蛋白质)的大量积累(Fritig等人(1998) Current Opinion ofImmunologylO: 16-22)和酶例如甲基转移酶(Legrand 等人(1978) Plantal44:101-108)、类苯基丙烧(phenylpropanoid)途径的刺激,所述途径参与抗生素例如莨菪亭的产生,其不为病原体提供适当的环境，阻止它们在整个植物中的扩散。系统性获得性反应给植物提供较高水平的抗相同病原体的随后感染的抗性。其不仅在患病组织中产生，而且还在整个植物中产生。其特征在于PR蛋白质(特别是酸性PR蛋白质)的积累，这与水杨酸的信号转导机制相关(Cordelier 等人(2003)Plant Molecular Biology51:109-118)。
[0007]植物具有合成许多种用作激素的类固醇的能力。然而，直至1979年才在植物中确认类固醇激素的存在。在这一年，美国科学家公布了关于从甘蓝型油菜(Brassica napusL.)花粉分离的称为油菜素内酯(brassinolide)的新型甾体内酯的数据(Grove等人(1979)Nature281:216-217)。油菜素类固醇已被公认为在生长调控中起重要作用的新的一类植物激素(Azpiroz等人(1998)Plant Celll0:219-230)。油菜素类固醇的生理学性质允许我们认为它们在不影响环境的应用中是非常有前景的。天然物质可以适合广泛地应用于植物保护和农业上效率的提高。
[0008]从一开始，油菜素类固醇就被认为是应用于农业的有前景的化合物，因为它们显示了在植物生长和发育中不同类型的调控活性以及其作为性能的支持者的经济价值(Khripach等人(2000)Ann.Botany86:441-447)。重要特性是油菜素类固醇以极低浓度起作用的能力。该现象的间接确认是植物中的油菜素类固醇的低浓度。对于生长植物，用于农业的常用量为每公顷 5 至 50mg(Khripach 等人(2000) Ann.Botany86:441-447)。
[0009]油菜素类固醇还可在植物对病原体的反应中起作用。油菜素类固醇已经在水稻和烟草中诱导了对细菌和真菌病原体的抗性，该抗性与增加的水杨酸的积累或与系统性获得性抗性相关的基因的增加的表达无关(Nakashita等人(2003) PlantJournal33:887-898)。
[0010]由细菌亚洲黄龙病菌(Candidatus iLiberibacter asiaticus，)引起的“黄龙病(Huanglongbing) ”(HLB)因其症状的严重性、其传播速度和影响所有商业柑桔种类而成为世界上最具毁灭性的柑桔疾病。其是仍未被治愈的疾病(Gottwald(2010)Annu.Rev.Phytopathol.48:6.1-6.21)。该疾病最早在19世纪晚期在亚洲被检测到，随后在20世纪早期报导了其在南非的存在，多年来帮助了在两个洲的传播(Gottwald(2010) Annu.Rev.Phytopathol.48:6.1-6.21)。目前该疾病的3个变体已被识别(亚洲、非洲和美洲)。致病生物体为“挑剔的(fastidious)”革兰氏阴性细菌，其不能在人工培养基上通过纯培养获得。该生物局限在芸香科的韧皮部，虽然其具有在木虱(psyllid)载体(亚洲柑橘木虱-柑桔木風(Diaphorina citri))的血淋巴和唾液腺中繁殖的能力。在昆虫中，取决于菌株的毒力，其在1-3周的时间内穿过肠壁经由血淋巴到达唾液腺。
[0011]症状随受影响的植物的种类和年龄而变化，因为在幼小的生命力旺盛的树中明显地观察到这些症状，然而在发育后感染的那些树显示不太明显的症状。在成熟的叶中，沿着主脉和二级脉的组织变黄，并且坏死在 侧脉上扩散直至叶子掉落(da Graca(1991)Annu.Rev.Phytopathol.29:109-36)。该过程在尺寸仍然较小的幼小叶中更严重。植物在感染后数年显示相当多的具有尖端死亡的落叶，斑纹和黄化也是普遍的。它们产生苍白和斑驳的具有小叶的丛生芽(multiple shoot)。在感染过程中，坐果较少,这些果实的早期掉落和仍然在树上的那些果实较小并且是不对称的，仅在暴露于阳光的一侧显示正确的颜色，而另一侧显示浓郁的橄榄绿着色(Bov6J (2006) Plant Pathol.88:7_37)。果实具有少量果汁，以及低浓度的可溶性固形物和糖，变成高度酸性，不适合于工业使用(Gottwald(2010) Annu.Rev.Phytopathol.48:6.1-6.21)。
[0012]HLB的存在在柑桔生产国造成的经济影响逐年增加，由于减少的产量和果实质量而造成的损失估计为约30-100%。直至现在，在世界上不存在HLB被充分控制以及疾病不存在的地区，这促进了其严重性和发病率的增加(Go ttwal d (2010) Annu.Rev.Phytopathol.48:6.1-6.21)。
[0013]最近，系统性获得性抗性的用途已通过使用与微量营养素组合的化合物例如水杨酸和亚磷酸盐(以使HLB感染的树维持在生产状态)进行了评价。然而，在一些情况下，在HLB、落果、产量和质量的减少方面，在处理的与未处理的树之间不存在显著差异(Gottwald(2010)Annu.Rev.Phytopathol.48:6.1-6.21)。[0014]因此，农业中仍然存在的重要问题是植物疾病的控制，其限制世界范围内每年的农业产量。
[0015]发明详述
[0016]本发明通过提供用于刺激植物的天然防御和诱导对疾病的抗性的有效方法，通过应用在植物中同时激活与水杨酸、茉莉酸/乙烯的途径和超敏反应(hypersensitiveresponse)相关的基因的化合物来帮助解决上述问题。
[0017]对疾病的抗性的诱导是目前非常重要和吸引人的方法，所述方法允许使用已存在于植物中生物化学和分子机制来用于疾病控制。植物对疾病的防御包括一系列与定义为植物的先天免疫力的识别、信号转导和反应相关的事件。该先天免疫力可通过许多因素激活，其决定性地促成疾病控制。由植物激活的防御机制之一是抗微生物植物抗毒素、防御素和发病机制相关性蛋白质的合成。这类反应通过与水杨酸、茉莉酸/乙烯和超敏反应相关的基因的激活介导。
[0018]在本发明中，第一次实现了壳多糖酶、β -1, 3葡聚糖酶、谷胱甘肽过氧化物酶、苯丙氨酸氨裂解酶、超氧化物歧化酶和丙二烯氧合酶的同时激活，所述酶为水杨酸、茉莉酸/乙烯和超敏反应的信号转导途径的部分。该激活与抗细菌、卵菌和真菌的保护作用相关。
[0019]此外，我们还显示了一组新的基因(属于水杨酸、茉莉酸/乙烯的途径和超敏反应)的同时激活，所述基因的激活与抗细菌、卵菌和真菌的保护作用相关。这些基因已通过基因表达的系列分析(SuperSAGE)的技术鉴定和表征。在考虑现有技术水平后，令人惊讶地，属于水杨酸、茉莉酸/乙烯和超敏反应的途径的基因的激活响应于天然化合物的施用而同时发生。
[0020]在本发明的说明书中，所述化合物，除其它化合物外，可以是植物激素、核酸、脂质或肽。
[0021]在本发明的一个实施方案中，通过同时激活与水杨酸、茉莉酸/乙烯和超敏反应相关的基因刺激植物的天然防御和诱导对疾病的抗性在对此类植物施用植物激素之后进行。在具体的实施方案中，植物激素是天然油菜素类固醇或其类似物。在本发明的说明书中，其被认为是油菜素类固醇的类似物，例如始于天然油菜素类固醇的环的结构的改变(以增强其活性)而合成的化合物。
[0022]本发明中公开的方法允许通过同时激活与水杨酸、茉莉酸/乙烯的途径和超敏反应相关的基因预防性和治愈性处理由细菌、卵菌和真菌引起的植物疾病。在本发明的一个实施方案中，被治疗或预防的疾病是由细菌亚洲黄龙病菌在柑桔中产生的“黄龙病”(HLB)。在另一个实施方案中，被治疗或预防的疾病是由番爺早疫病菌(Alternaria solani)在番爺培养物中引起的疾病或由烟草黑胚病菌(Phytophthora parasitica)在烟草培养物中产生的疾病。
[0023]本发明还第一次公开了天然油菜素类固醇(及其类似物)允许有效控制植物疾病的浓度和施用频率。在本发明的一个实施方案中，浓度范围在0.01至20 μ M内的天然油菜素类固醇或类似物的施用允许通过经由患病植物的治疗减少细菌、卵菌或真菌的拷贝数而显著地减少引起细菌和真菌来源的疾病的试剂。本发明中提及的方法可用于通过定期施用天然油菜素类固醇及其类似物来预防健康植物的感染。在本发明的具体实施方案中，油菜素类固醇对植物的施用每月进行至少一次。在另一个实施方案中，油菜素类固醇对患病植物的施用以每月至少2次的频率进行。对于天然和类似物，待施用的油菜素类固醇浓度的范围视待保护或治疗的作物以及还视施用技术而变化。如由该【技术领域】的技术人员所已知的，当使用低容量施用法(Low Volume Application)或超低容量施用法(Ultra-LowVolume Application)时,化合物的有效浓度可大大减小。
[0024]在本发明的一个实施方案中，刺激植物的天然防御和诱导对疾病的抗性的方法包括施用与杀虫剂组合的油菜素类固醇或类似物。
[0025]本发明的另一个目的是用于刺激植物的天然防御和诱导对疾病的抗性的组合物，其包含同时激活与水杨酸、茉莉酸/乙烯的途径和超敏反应相关的基因的化合物，并且其中所述化合物为植物激素。
[0026]在优选实施方案中，所述组合物包含天然油菜素类固醇或油菜素类固醇类似物。在本发明的具体实施方案中，天然油菜素类固醇和类似物通过化学合成获得。为了本发明的目的，油菜素类固醇可通过溶液、悬浮液、乳剂、粉剂、颗粒、可乳化的浓缩剂、气雾剂、浸溃颗粒、佐剂、糊剂或通过胶囊化来配制。
[0027]在本发明的一个实施方案中，在用于预防或治愈植物疾病的组合物中，天然油菜素类固醇或油菜素类固醇类似物在0.01至20 μ M的范围内，或为用于低或超低容量的它的
=I里。
[0028]本发明的另一个目的是使用油菜素类固醇制备用于刺激植物的天然防御和诱导对疾病的抗性的组合物，其中定期施用所述组合物。在本发明的一个实施方案中，可利用油菜素类固醇的该新型用途预防或治疗的植物疾病由细菌、真菌或卵菌引起。
[0029]本发明的另一个方面涉及用于预防或治疗柑桔的黄龙病(HLB)的方法，其中对植物定期施用油菜素类固醇，每月至少一次。在所述方法中，油菜素类固醇可以是天然化合物或油菜素类固醇类似物。
[0030]附图概述
[0031]图1.利用油菜素类固醇类似物(25R)-3_羟基-C-高-11-氧杂-5-螺甾烷-12-酮处理的柑桔植物的与针对疾病的防御反应相关的基因的相对表达。其显示了编码壳多糖酶(A)、β -1, 3-葡聚糖酶(B)、谷胱甘肽过氧化物酶(C)、苯丙氨酸氨裂解酶(D)，超氧化物歧化酶(E)、丙二烯氧合酶(F)的基因的相对表达。曲线上的条棒表示每一次测试的10株植物的平均值的标准差。测试的基因与通过水杨酸、茉莉酸/乙烯和超敏反应的植物的抗性相关。
[0032]图2.在利用油菜素类固醇的类似物的处理过程中激活的通过SuperSAGE技术鉴定的新基因的相对表达。条棒代表每一个时间点上每个植物的10片叶子的平均值的标准差。基因被分组成下列分类:与植物的抗一般病原体的防御反应相关的基因(A);与植物的抗细菌的防御反应相关的基因(B);与植物的抗疾病的防御相关的转录因子(C);进行防御反应的信号转导(D);和与植物抗毒素生物合成相关的基因(E)。
[0033]图3.油菜素类固醇类似物对处于发育(A)和成熟(B)阶段的柑桔植物的HLB的减少的作用，测量为通过聚合酶链式反应(PCR)测定的每反应的HLB细菌的拷贝数。曲线上的条棒代表每一次测试的10片叶子的平均值的标准差。
[0034]图4.利用油菜素类固醇类似物处理(A)和未利用油菜素类固醇类似物处理(B)的HLB感染的植物的叶子的电子显微镜照片。在不同的放大倍数下对分析的每一个样品拍摄20幅电子显微照片。我们研究了每个样品总共10个网。每一个铜网具有400个用于观察的孔。
[0035]图5.天然油菜素类固醇和类似物对HLB的减少的作用(测量为每反应的HLB细菌的拷贝)的评估。曲线上的条棒代表每一次测试的10株植物的平均值的标准差。
[0036]图6.油菜素类固醇类似物(25R)-3-羟基-C-高-11-氧杂-5-螺甾烷-12-酮的施用频率对减少HLB的作用，测量为每PCR反应的HLB细菌的拷贝。曲线上的条棒代表每一次测试的植物的10片叶子的平均值的标准差。
[0037]图7.油菜素类固醇类似物(25R)-3-羟基-C-高-11-氧杂-5-螺甾烷-12-酮对柑桔的HLB的保护作用，测量为每PCR反应的HLB细菌的拷贝。每月进行一次产品施用。曲线上的条棒代表每一次测试的每个植物10片叶子的平均值的标准差。
实施例
[0038]实施例1.在利用油菜素类固醇类似物处理后与植物对疾病的天然抗性相关的基因的同时激活
[0039]利用20 μ M的油菜素类固醇类似物(25R) _3_羟基-C-高_11_氧杂_5_螺留烧 _12-酮处理柑桔植物甜澄(Citrus sinensis) (Iglesias 等人(1998) SyntheticCommunications28:75-81)。在喷雾施用后0、1、5、10、24和48小时收集5株植物的叶子。按照制造商的说明书使用RNeasy试剂盒(Qiagen, Valencia, CA)从叶子提取总RNA,这包括DNase处理。按照制造商的说明书,使用寡_dT引物和反转录试剂盒SuperScriptIII (Invitrogen, Carlsbad, CA)合成 cDNA。使用 RotorGene3000PCR 仪(Corbett, Australia)和QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)进行实时定量PCR。与柑桔植物的抗疾病防御相关的基因的引物的所有序列不于表1中。实时PCR的反应条件为:在95°C进行15分钟的初始变性步骤，随后进行40个循环“在95°C进行15秒的变性，在60°C进行30秒的退火步骤和在72°C进行30秒的 延伸步骤”。使用RotorGene3000软件(Corbett, Australia)进行分析，每一个样品使用一式5份。重复实验2次。
[0040]表1.实验中使用的寡核苷酸的列表
[0041]
【权利要求】
1.一种用于刺激植物的天然防御和诱导对疾病的抗性的方法，其特征在于给所述植物施用同时激活与水杨酸、茉莉酸/乙烯的途径和超敏反应相关的基因的化合物。
2.权利要求1的方法，其用于植物疾病的预防性和治愈性处理。
3.权利要求1的方法，其中同时激活与水杨酸、茉莉酸/乙烯的途径和超敏反应相关的基因的化合物为植物激素。
4.权利要求3的方法，其中所述植物激素为油菜素类固醇。
5.权利要求2至4的任一项的方法，其中被预防或治疗的疾病包括由亚洲黄龙病菌在柑桔中引起的疾病(黄龙病)、由番茄早疫病菌在番茄中引起的疾病以及由烟草黑胫病菌在烟早中引起的疾病。
6.权利要求4或5的方法，其中对植物定期施用油菜素类固醇，每月至少一次。
7.权利要求6的方法，其中，另外将杀虫剂施用于所述植物。
8.一种用于刺激植物的天然防御和诱导对疾病的抗性的组合物，其包含同时刺激与水杨酸、茉莉酸/乙烯的途径和超敏反应相关的基因的化合物，并且其中所述化合物为植物激素。
9.权利要求8的组合物，其中所述植物激素是天然油菜素类固醇或油菜素类固醇类似物。
10.权利要求9的组合 物，其中所述天然油菜素类固醇或油菜素类固醇类似物通过化学合成获得。
11.权利要求9的组合物，其中所述天然油菜素类固醇或油菜素类固醇类似物在0.01-20 μ M的范围内，或为用于低或超低容量施用的它的当量。
12.油菜素类固醇用于制备组合物的用途，所述组合物用于刺激植物的天然防御和诱导对疾病的抗性，其中定期施用所述组合物。
13.权利要求12的用途，其中所述植物疾病由细菌、真菌或卵菌引起。
14.权利要求13的用途，其中所述疾病包括由由亚洲黄龙病菌在柑桔中引起的疾病(黄龙病)、由番茄早疫病菌在番茄中引起的疾病以及由烟草黑胫病菌在烟草中引起的疾病。
15.权利要求12的用途，其中所述油菜素类固醇是天然化合物或油菜素类固醇类似物。
16.权利要求15的用途，其中所述天然油菜素类固醇或类似物以0.01-20 μ M的浓度或用于低或超低容量施用的它的当量施用，并且每月施用至少一次。
17.一种用于预防或治疗柑桔植物的黄龙病(HLB)的方法，其特征在于给所述植物定期施用油菜素类固醇。
18.权利要求17的方法，其中所述油菜素类固醇是天然化合物或类似物，并且其每月施用至少一次。
【文档编号】C07J9/00GK103476261SQ201280017832
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年2月27日 优先权日:2011年2月28日
【发明者】O·博拉斯伊达尔戈, E·卡纳里斯洛佩兹, M·普约尔费雷尔, C·G·博洛托诺德罗, Y·科尔加西亚 申请人:遗传工程与生物技术中心