通过欧洲越橘细胞培养物制备多酚的利记博彩app

通过欧洲越橘细胞培养物制备多酚的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了被构造为在液体培养基的悬浮培养物中生长的欧洲越橘(Vaccinium?myrtillus)的细胞培养物。所述细胞源自一个或多个欧洲越橘植物部分，例如可食用的植物部分(如，叶部分或浆果部分)或茎部分。所述细胞适于在相对短的一段时间(如，约7天)内生长至高密度。此外，所述细胞适于产生高浓度的多酚和／或原花青素，并且基本上不含花青素。本发明还公开了用于从生长在悬浮培养物中的欧洲越橘细胞制备多酚和／或原花青素的方法。
【专利说明】通过欧洲越橘细胞培养物制备多酚
【背景技术】
[0001]来自欧洲越橘(Vaccinium myrtillus)(更一般来说,称为越橘)果实的提取物长期以来用于治疗目的。在欧洲，数百年来一直使用它治疗腹泻和痢疾，以及肺部、肝脏和胃的疾病。此外，据信英国的战斗机飞行员在二战中食用越橘果酱来帮助提高其夜视力。最近以来，来自欧洲越橘植物的果实的提取物已被证实具有潜在的抗癌活性。欧洲越橘作为饮食补充剂和治疗剂两者的临床疗效归因于越橘中存在含量丰富的类黄酮和花青素。这些抗氧化化合物清除体内称为自由基的破坏性粒子，从而有助于抑制或扭转对细胞的损坏。已证实抗氧化剂可帮助抑制多种长期疾病，例如心脏疾病、癌症和黄斑变性。欧洲越橘果实还包含单宁酸，已知单宁酸可同时充当抗炎剂和收敛剂。
[0002]多酚广泛分布于植物、水果和蔬菜中，并因其在人和动物健康中的生理功能(包括抗氧化活性、抗诱变活性和癌症预防活性)而受到了相当多的重视(Salvia et al.，J.Agric.Food Chem.39:1549-1552, 1991 (Salvia等人，《农业和食品化学杂志》,第39卷,第 1549-1552 页，1991 年)；Bomser et al., Cancer Lett.，135:151-157，1999 (Bomser 等人， 《癌症快报》，第 135卷，第 151-157 页，1999年);Zhao et al.，Carcinogenesis, 20:1737-174 5，1999(Zhao等人，《致癌作用》，第20卷，第1737-1745页，1999年))。流行病学研究已暗示多酹中的类黄酮可能会降低心脏疾病的风险(Hertog et al., Lancet342:1007-1011, 1993 (Hertog等人，《柳叶刀》，第342卷，第1007-1011页，1993年))。另外，已显示膳食黄烷-3-醇和/或原花青素在实验动物中降低了动脉粥样硬化症和冠心病的发病率(Tijburg et al.，Atherosclorosis, 135:37-47，1997 (Ti jburg 等人，《动脉粥样硬化》,第 135 卷，第 37-47 页，1997 年)；Yamakoshi et al., Atherosclerosis, 142:139-149，1999 (Yamakoshi 等人，《动脉粥样硬化》，第142卷，第139-149页，1999年))。负责这些效果的机制之一涉及它们对于低密度脂蛋白(LDL)氧化的抑制(Steinberg, Circulation, 85:2337-2344，199 2 (Steinberg,《循环》，第 85 卷，第 2337-2344 页，1992 年))。
[0003]越橘(Vaccinium)属的衆果已显示出在各种体外模型中具有自由基清除能力， 所述体外模型使用氧自由基吸收能力(ORAC)、三价铁还原抗氧化能力(FRAP)、总氧化剂清除能力(TOSC)和抗2，2- 二苯基-1-苦肼基(DPPH)自由基的自由基清除能力以及在抑制亚油酸甲酯、脂质体和人类低密度脂蛋白(LDL)氧化方面的抗氧化能力的测定法 (Maata-Riihinen等人)。培植的蔓越橘(大果越橘(V.macrocarpon Ait.))和野生的红豆越橘包含A型和B型原花青素两者(Gu等人、Morimoto等人、Foo等人),而在野生的(狭叶越橘(V.angustifolium Ait.))和培植的蓝莓(北高丛越橘(V.corymbosum L.)、兔眼越橘 (V.ashei L.))中鉴 别出的主要为B型原花青素(Foo等人、Prior等人、Schmidt等人)。在野生的红豆越橘、蔓越橘、北欧越橘和笃斯越橘中检测到稀少的A型低分子量原花青素，并且其以高于更常见的B型原花青素的含量存在(Maata-Riihinen等人)。已知的是稀少的A 型原花青素充当细菌纤毛附着到内皮细胞层的阻碍物，从而帮助抑制尿路感染(Nowack和 Schmidt ;Foo等人2)。它是已知存在于越橘中的常规抗炎剂，几十年以来一直用于治疗肠炎。另外，欧洲越橘叶具有35种不同的黄酮-3-醇、原花青素、黄酮醇及其糖苷，以及各种酹酸共轭物(Hokannen等人)。
[0004]欧洲越橘难以生长，因此很少培植。因此，一般在野生植株有限的生长期(五月至九月)内采集其果实，该有限的生长期必须既潮湿又温暖。由此，浆果的供应是不可靠的，并且可获得的浆果数量有限。此外，与相关的蓝莓相比，该果实更软且更多汁，使得其必须手工收获，并且运输难度大，这就导致从欧洲越橘植株收获的新鲜果实成本高昂。另外，由于对成熟果实的要求高，所以未成熟的果实和叶子不是要收集的经济上可行的产物。这些是植株中含有最高量的原花青素的部分。根据欧洲越橘的临床疗效和培植这些植物的难度， 需要开发出一种针对这些植物的细胞的持续性体外培养系统。

【发明内容】

[0005]本发明涉及被构造为在液体培养基的悬浮培养物中生长的欧洲越橘的细胞培养物。所述细胞源自一个或多个欧洲越橘植物部分，例如可食用的植物部分(如，叶部分或浆果部分)或茎部分。细胞适于在相对短的一段时间(如，约7天)内生长至高密度。此外，细胞适于产生高浓度的多酚和/或原花青素，并且基本上不含花青素。还公开了用于由生长在悬浮培养物中的欧洲越橘细胞制备多酚和原花青素的方法。
[0006]在一个实施例中，描述了细胞培养物。细胞培养物包括悬浮细胞培养物中的多个易碎欧洲越橘细胞。悬浮培养物中的细胞源自下列中的一者或多者:幼苗的子叶下轴、子叶、叶段、茎段或根段；或成熟植株的浆果、茎段(包括节点或节间)或叶段。在一个实施例中，细胞可源自可食用植物部分，例如叶部分或浆果部分。细胞被选择为能够在7天的生长中获得至少55%的收集细胞 体积，其中多个欧洲越橘细胞的干质量的至少10%由多酚构成， 且多个欧洲越橘细胞的干质量的至少5%由原花青素构成。
[0007]优选地，多个欧洲越橘细胞的干质量的至少12.5%、15%、20%或更多由多酚构成。 优选地，多个欧洲越橘细胞的干质量的至少7.5%、10%、15%,20%或更多由原花青素构成。另外优选的是，细胞的质量基本上不含花青素。例如，优选的是多个欧洲越橘细胞的干质量包含少于0.5%、0.1%、0.01%, 0.001%或更少的花青素。
[0008]在另一个实施例中，描述了一种制备欧洲越橘细胞的细胞培养物的方法。该方法包括:(1)制备源自下列中的一者或多者的欧洲越橘细胞的细胞愈伤组织:幼苗的子叶下轴、子叶、叶段、茎段或根段；或成熟植株的浆果、茎段(包括节点或节间)或叶段，(2)将源自愈伤组织的一个或多个细胞引入液体培养基，(3)搅拌液体培养基中的一个或多个细胞，
(4)用新鲜液体培养基替换该液体培养基或将细胞转移至新鲜液体培养基，以形成欧洲越橘的悬浮细胞培养物，(5)使欧洲越橘的悬浮细胞培养物生长到收集细胞体积为至少55%， 以及(6)挑选悬浮细胞培养物，其中多个欧洲越橘细胞的干质量的至少10%由多酚构成，和 /或所述细胞的干质量的至少5%由原花青素构成。
[0009]在另一个实施例中，描述了一种促进欧洲越橘细胞在悬浮细胞培养物中的生长的方法。该方法包括:(I)提供欧洲越橘细胞的悬浮细胞培养物，(2)在悬浮培养物的液体培养基中培养细胞，以及(3)挑选收集细胞体积(PCV)大于45%的悬浮细胞培养物。
[0010]在一个实施例中，促进欧洲越橘细胞在悬浮细胞培养物中的生长的方法还包括挑选具有响应于液体培养基中糖浓度的增大而提高的多酚和原花青素积聚的悬浮细胞培养物。在一个实施例中，液体培养基中的糖浓度包含大约30-60g/L的蔗糖。在一个实施例中，原花青素在悬浮培养物中的细胞内的积聚从20g/L蔗糖下的约l_2g/L PCV增大至30g/L 蔗糖下的约3-7g/L PCV。在一个实施例中，多酚在悬浮培养物中的细胞内的积聚从20g/L 鹿糖下的约2-4g/L PCV增至60g/L鹿糖下的约5-10g/L PCV。
[0011]在又一个实施例中，描述了一种增加由培养物中的欧洲越橘细胞制备的多酚的方法。该方法包括:(I)挑选多个适于在悬浮培养物中生长的欧洲越橘细胞，(2)并且将细胞在存在足量糖的悬浮培养物中培养以增加多酚制备。
[0012]在一个实施例中，足量的糖为具有大于20g/L糖、20g/L-30g/L糖或大于30g/L糖的液体培养基。在一个实施例中，糖为蔗糖。在另一个实施例中，糖为葡萄糖。在一个实施例中，糖以足以使多酚制备增至超过3g/L收集细胞体积(PCV)的量存在。在另一个实施例中，糖以足以使多酚制备增至至少7g/L收集细胞体积(PCV)的量存在。
[0013]在又一个实施例中，描述了一种从培养物中的欧洲越橘细胞提取多酚的方法。该方法包括:(I)挑选多个适于在悬浮培养物中生长的欧洲越橘细胞，并且(2)使用溶剂从细胞中提取多酚，其中多个欧洲越橘细胞的干质量的至少10%由多酚构成，且多个欧洲越橘细胞的干质量的至少5%由原花青素构成。
[0014]在一个实施例中，溶剂包括丙酮、乙酸和水。在一个实施例中，溶剂包括70%丙酮 (v/v)和 0.5% 乙酸(v/v)。
[0015]本发明的这些和其他目标以及特征通过下列说明和所附权利要求将更为完全地显现出来，或其可通过实践下文示出的权利要求而进行学习。
【专利附图】

【附图说明】
[0016]为了进一步阐明本发明的上述以及其他优点和特征，本发明主题的更具体说明将通过参考在附图中示出的其具体实施例来呈现。应当理解，这些附图仅示出本发明的示例性实施例，并且因此被认为不对其范围构成限制。本发明的主题将通过使用附图进行更具体和详细的描述和阐释，其中:
[0017]图1示出了糖的消耗，其中生物质在一周内从初始的25%生物质增加至50%。
[0018]图2示出了在不同的摇床速度下的生长(a)、RI(b)和产量(C)。将500ml烧瓶全部以20%PCV接种，并且在6天生长之后对PCV、RI和产品收得率进行测量。
[0019]图3示出了荧光检测器模式下来自源于茎、子叶下轴、叶和子叶外植体的悬浮细胞的提取物的HPLC色谱图。标签I至12分别指原花青素的聚合度:1，单体；2，二聚体；3， 三聚体；4，四聚体；5，五聚体；6，六聚体；7，七聚体；8，八聚体；9，九聚体。
[0020]图4示出了荧光检测器模式下来自越橘和可可的悬浮细胞的提取物的HPLC色谱图。标签I至12分别指原花青素的聚合度:1，单体；2，二聚体；3，三聚体；4，四聚体；5，五聚体；6，六聚体；7，七聚体；8，八聚体；9，九聚体。该附图通过以下事实证实越橘中的峰为原花青素低聚体:2个细胞系以相同的方式提取，并且在相同条件下运行，并且它们针对每种低聚体具有相同的保留时间。
[0021]图5示出了可可(a)和越橘(b)提取物在280nm处的紫外吸收图案，从而证实越橘中存在原花青素且对其进行了检测。
【具体实施方式】[0022]本发明涉及被构造为在液体培养基的悬浮培养物中生长的欧洲越橘的细胞培养物。所述细胞源自一个或多个欧洲越橘植物部分，例如可食用的植物部分(如，叶部分或浆果部分)或茎部分。细胞适于在相对短的一段时间(如，约7天)内生长至高密度。此外，细胞适于产生高浓度的多酚和/或原花青素，并且基本上不含花青素。本发明的主题将通过使用以下实例进行更具体和详细的描述和阐释。
[0023]SM
[0024]实例1:表面灭菌和种子萌发
[0025]从俄勒R州的Horizon Herbs公司(Horizon Herbs, Oregon)获得欧洲越橘种子。从俄勒冈州科瓦利斯(Corvallis, Oregon)的国家无性种质资源库(National Clonal Germplasm Repository(NCGR))收集用于本实例以及下面的实例的欧洲越橘(爱尔兰越橘) 的叶、茎段和未成熟浆果。
[0026]将叶、茎段和未成熟浆果置于流动水中清洗20分钟，然后置于75%乙醇中清洗I 分钟。随后将茎切成较小的片。随后将茎、叶和未成熟浆果置于25%次氯酸钠(v/v)中洗涤15分钟，然后置于无菌蒸馏水中清洗5次。
[0027]对种子(得自俄勒R州的Horizon Herbs公司(Horizon Herbs, Oregon))进行表面灭菌，方式为:首先在75%乙醇中清洗I分钟。随后在25%次氯酸钠(v/v)中洗涤15分钟，然后在无菌蒸馏水中清洗5次。接下来使种子悬浮在0.1%琼脂糖中，再将其放置到1 00X25_ 的培养皿上(每个平板大约100粒种子)。使它们在含有7g/L琼脂的MS (Murashige and Skoog)培养基(4.43g/L)上，在23°C以及16小时光照和8小时黑暗交替的光周期下萌发 4周。
[0028]实例2.由体外生长的欧洲越橘幼苗进行愈伤组织诱导
[0029]增殖性更强的生长和易碎愈伤组织是成功细胞系的极其重要的特性。本实例描述了经优化以引发并保持来自源于体外生长的欧洲越橘幼苗的各种外植体的愈伤组织的方法和培养基条件。
[0030]从体外生长的幼苗的子叶下轴、子叶、叶、茎段或根引发愈伤组织。将植物部分切成5mm的小段。除非另外指明，否则将所有培养基通过高温灭菌在121°C和15PSI (磅/平方英寸)下灭菌20分钟。除非另外指明，否则对所有生长调节剂进行过滤灭菌并且在高温灭菌后加入。除非另外指明，否则将所有培养物保持在25°C下的黑暗中。
[0031]将外植体放置在各种愈伤组织诱导培养基(表I)上。将平板保持在25°C下的黑暗中。在将外植体放置在具有培养基VM1445、VM1196、VM1204和VM1233 (VM1233在Madhavi et al., Plant Science, 131:95-103，1998(Madhavi 等人,《植物科学》，第 131 卷，第 95-103 页，1998年)中有所描述)的平板上2周之后，观察到愈伤组织形成的最初迹象。愈伤组织诱导率分别为83%、85%、85%和70%。然而，在培养基VM1196和VM1204(这两者均具有24mM硫酸铵和8mM硝酸钾，但具有不同的碱式盐-分别为无氮MS基础盐和改良的B5主盐(表I)) 上制备的愈伤组织比在具有ImM硫酸铵和24mM硝酸钾的培养基(VM1445)上制备的愈伤组织更柔软。在培养基 VM1233(Madhavi et al.，Plant Science, 131:95-103，1998(Madhavi 等人，《植物科学》，第131卷，第95-103页，1998年))上制备的愈伤组织非常致密并且不具有增殖性。Madhavi等人示出了在该培养基上将愈伤组织继代培养三个继代培养周期 (各自间隔三周)，然而在该参考文献中未对该培养基上的愈伤组织的品质进行讨论。使用Madhavi等人的条件继代培养愈伤组织产生了与如该参考文献中所述的那些相同的初始结果，但应当注意，每进行一次继代培养，愈伤组织就变得更坚硬且更不具有增殖性。因此，使用培养基VM1233的愈伤组织的品质随着逐次进行继代培养而降低。从VM1233培养基中移除聚乙烯基吡咯烷酮(PVP ;培养基VM1204)有助于使愈伤组织变得柔软。在培养基VM1491 和DC1152上，分别为50%和10%的外植体产生供应充足的愈伤组织。每3周将外植体和愈伤组织转移到新鲜的培养基上。一旦将愈伤组织与外植体分离，就每2周对增殖性很强的愈伤组织进行一次继代培养。选择快速生长的细胞系进行继代培养。连续继代培养有助于将愈伤组织的形态更改为更为理想的易碎形态。
[0032]在具有较多硫酸铵和较少硝酸钾的培养基上持续进行继代培养导致愈伤组织因为应力而变为深褐色，且最终停止生长。这从以下事实可明显看出:具有正常浓度Gamborg B5 (B5)培养基但不具有硫酸铵或硝酸钾的培养基VM1445未显示褐变和最终死亡。由于不期望的愈伤组织发生褐变，所以在9周之后停止使用培养基VMl 196和VM1204。对多种培养基(表I)进行试验，以便表征将支持愈伤组织可持续生长而不发生褐变和最终死亡的培养基。具有正常浓度MS盐的培养基VM1516显示出增殖性很强且可持续的生长。当将VM1445 和VM1516进行比较时，VM1516产生增殖性最强的愈伤组织并且还有助于将形态从致密更改为颗粒状并最终成为易碎的愈伤组织。培养基VM1516还证明可以最佳地可持续维持源自欧洲越橘幼苗的愈伤组织。VM1516还被证实对于引发来自各种欧洲越橘幼苗外植体的新愈伤组织而言是最佳的培养基，其引发成功率为83%。
[0033]实例3:从收集自NCGR的欧洲越橘组织进行愈伤组织诱导[0034]本实例描述了用于从源自田间生长的欧洲越橘植株的各种外植体(源自浆果、节点、节间或叶)引发并维持愈伤组织的方法和培养基配方。
[0035]如上所述对成熟的叶和茎以及未成熟浆果进行表面灭菌。将植物部分切成较小的 5mm小段，然后外植到培养基VM1516和VM1491内。在无菌条件下将浆果切开，并且将外皮置于具有培养基的培养板上。在进行外植之前移除任何浆果肉。
[0036]将培养板保持在25°C下的黑暗中。通常，在最初将材料外植在VM1516上4周且在 VM1491上6周之后观察到愈伤组织。参照叶外植体，整体愈伤组织诱导率为53%。在VM1491 中以及在培养基VM1516中产生了来自叶外植体的愈伤组织(在VM1491中最初外植体的73% 且在VM1516中最初外植体的76%产生了愈伤组织)，并且在培养基VM1672和TC1596中未观察到愈伤组织。据观察，在VM1516中产生的愈伤组织比在VM1491中产生的愈伤组织更为茁壮。参照节点，那些外植体中的47%在VM1516中产生了愈伤组织。将节间置于3种不同的培养基VM1516、VM1491和TC1596上。在VM1516上，外植体的51%产生了愈伤组织， 而在VM1491上仅有20%产生了愈伤组织，并且在TC1596上任何外植体均未产生愈伤组织。 在来自浆果的外植体中，有59%在VM1516上产生了愈伤组织。
[0037]每3周在VM1516上对源自欧洲越橘组织的愈伤组织进行继代培养。该愈伤组织具有很强的增殖性，并且挑选易碎的细胞系进行进一步维持。将源自这些组织的愈伤组织置于培养基VM1516上维持超过八个月，并且已证实增殖的一致性，且愈伤组织的品质未发生改变。
[0038]实例4:由源自欧洲越橘幼苗的愈伤组织产生悬浮液
[0039]选择如实例2中所述产生的易碎细胞系，用于引发悬浮液。细胞悬浮液的制备方式如下:将Ig (大约)新鲜的2周大欧洲越橘幼苗愈伤组织(如实例2中所述制备)引入125ml无菌锥形瓶中的15ml液体培养基(VM1799、VM1831或DC1151 ;表2)内。用无菌硅(泡沫)顶盖覆盖住锥形瓶，随后置于旋转摇床中以120转/分钟(rpm)进行摇动。将悬浮液保持在23°C下的黑暗中。为了形成细胞培养物，每周移除废培养基并加入新鲜培养基以进行两次继代培养。通过测量培养基的折射率(RI) Δ值(如通过白利度(BRIX) (B卩，%白利度)进行测量)得出碳水化合物的消耗速率，以此来测量细胞生长。如果RI小于或等于培养基初始RI的二分之一，则向细胞中加入新鲜培养基。如果RI大于二分之一，则在2周之后才加入新鲜培养基。每周或者每两周按需转移继代培养物。
[0040]保留作为细胞的颗粒悬浮液或者细小悬浮液形成的培养物，而弃去不形成悬浮培养物的培养物。一旦形成了悬浮培养物(3至4个继代培养周期)，就每周将25-35%的细胞转移至装有新鲜培养基的烧瓶。在每次继代培养时记录收集细胞体积(PCV)和RI，以测量细胞生长。
[0041]由愈伤组织引发悬浮液后，在6次继代培养内获得了可持续的稳定悬浮液。
[0042]实例5:由源自从NCGR采集的欧洲越橘组织的愈伤组织产生悬浮液
[0043]选择易碎的细胞系以引发悬浮液。细胞悬浮液的制备方式如下:将欧洲越橘愈伤组织(如实例3中所述由节点、节间、叶和浆果制备)引入无菌锥形瓶中的液体培养基(VM1933 ;表2)内。用无菌硅(泡沫)顶盖覆盖住锥形瓶，随后置于旋转摇床中以120转/分钟(rpm)进行摇动。将悬浮液保持在25°C下的黑暗中。为了形成细胞培养物，移除废培养基并且加入新鲜的VM1933培养基。通过测量培养基的折射率(RI) Δ值得出碳水化合物的消耗速率，以此来测量细胞生长。如果RI小于或等于培养基初始RI的二分之一，则向细胞中加入新鲜培养基。如果RI大于二分之一，则在2周之后才加入新鲜培养基。
[0044]实例6:细胞生长的优化
[0045]本实例描述用于增加悬浮物的细胞生长的方法。细胞培养物产率随细胞生长的速率和细胞生长停止时的密 度而增加。为了确定最佳接种密度，用产生15%收集细胞体积(“PCV”)和25%PCV的起始细胞密度的接种量引发欧洲越橘细胞的悬浮培养物并且允许其生长7天。以15%PCV的细胞密度引发的培养物在7天内没有达到最大密度。在培养基VM1831 (表I)中以25%PCV的细胞密度引发的培养物在7天内密度(即，总细胞体积)倍增，并且在7天内达到45-50%PCV的最大平均细胞密度，且一些细胞系培养物在第7天显示超过55-60%PCV。挑选细胞有助于捕集在7天或更短时间内达到45%PCV或更大PCV的培养物(快速生长的细胞培养物)。弃去超过7天才能达到45%PCV的培养物。
[0046]精心选择在多代中均显示出较高糖消耗和良好生长(图1)的细胞之后，当首先用25%种菌接种到烧瓶中时，观察到第7天的最终细胞密度非常高(PCV为约65.8±0.63)。这使得细胞不能在工作体积为40ml的125ml烧瓶中被适当摇动。因此，一旦通过细胞选择方法改良了细胞系，就再次需要对接种量进行优化。对倍增时间的计算表明20%PCV的接种将在第7天产生约60%的最终PCV。实验数据支持这一点，并且显示最终PCV (59.9 ± 0.77)中存在显著的差异(P=0.008)但对产量或产率无有害影响(P=0.39)。从而将接种量更改为20%PCVo
[0047]实例7:通过悬浮细胞培养物的细胞选择和培养基优化对来自越橘悬浮液的多酚制备进行优化[0048]在优化生长之后，通过更改用于细胞选择的培养基配方和额外标准而实现多酚制备的改善。
[0049]培养物中的碳水化合物消耗迅速，且培养物在第7天时达到0-0.6的RI。多酚和/或原花青素在VM1831中产生较慢，这可能是由于糖饥饿。培养基VM1831具有20g/L的蔗糖。通过调整碳水化合物含量以使培养物保持无营养饥饿状态，从而优化液体培养基。用30g/L蔗糖配制新培养基VM1933 (表1)，以避免细胞出现糖饥饿。在该培养基中，RI下降至介于0.8和1.0之间。在4次继代培养内，多酚的产值从20g/L蔗糖下的约2-4g/L PCV上升至60g/L蔗糖下的约5-10g/L PCV，并且可保持在较高产量水平。在4次继代培养内，原花青素的产值从20g/L蔗糖下的约l-2g/LPCV上升至30g/L蔗糖下的约3_7g/L PCV,并且可保持在较高产量水平。
[0050]细胞选择过程使得多酚和原花青素的产量水平能够进一步提高，在该过程中选择在每次继代培养时均产生了高于由高通量量化的平均多酚的烧瓶。
[0051]实例8:在来自越橘幼苗的各个部分的悬浮液中检测并确认多酚和原花青素的产量
[0052]在本实例中，证实了已经能够从如实例4和5中所述由植物的所有部分(根、子叶下轴、浆果、子叶、茎和叶)制备的悬浮液中产生原花青素。图3示出了显示各种来源的色谱图。还能够确认，通过用已确认的可可原花青素色谱图(图4)覆盖，我们所看到的为原花青素，该色谱图示出的每种低聚体的保留时间与可可色谱图中的相应物质保留时间一致，且还示出了越橘中存在的二聚体、三聚体和四聚体的额外异构体。另外，在280nm处运行紫外吸收显示的图案与可可类似，并且还确认了原花青素的存在(图5)。
[0053]实例9:从越橘属愈伤组织培养物和悬浮培养物提取多酷
[0054]本实例描述被开发用于从实例I至5中开发的越橘属培养物的愈伤组织和悬浮细胞中提取多酚的方法。使用0.4ml含有0.5%乙酸的70%(v/v)丙酮，从得自悬浮物的大约
0.4ml新鲜细胞中提取多酚。使用如下所述的稳定高通量方法:对于要分析细胞培养物的每个烧瓶，首先记录样品的收集细胞体积(PCV)，再将0.4ml样品转移到96深孔板内。用塑料转移吸管将每个孔的上清液移除并弃去。接下来，将0.4ml提取溶剂(70%丙酮、29.5%水、0.5%乙酸)和碳化钨珠加入每个孔中，随后将板置于混磨机上，以18Hz将细胞研磨4分钟。随后将板置于离心机中，并以6000rpm离心4分钟以使细胞与提取物分离。
[0055]实例10:培养物中的多酚产暈的初步分析
[0056]用于进行原花青素分析反应的方法被设计成非常近似地模拟原始的Swain和Hillis (J.SC1.Food Agric.10:63, 1959 (《食品和农业科学杂志》，第10卷，第63页，1959年))方法和Porter等人(Phytochemistry, 25(1):223, 1986 (《植物化学》，第25卷第I期，第223页，1986年))方法。使用丁醇-HCI提取测定法来测量欧洲越橘悬浮细胞的提取物中的多酚。通过将0.1ml的含水丙酮提取物和1.0ml的丁醇-HCl试剂(95:5v/v)进行结合并且将该溶液在凯杰公司(Qiagen)深孔块(美国加州瓦伦西亚(Valencia，CA，USA))中于75°C下加热60分钟，使多酚水解成(-)_表儿茶素和花青素单体。通过粉红色颜色的形成观察到花青素在水解样品中的存在。测定520nm处的吸光度，并使用校准曲线基于所形成的花青素的量计算原花青素含量，所述校准曲线是使用不同浓度的原花青素B2 (购自美国加州欧文市的⑶X有限公司(Chromadex, Inc.，Irvine, CA))产生的。更亮的粉红色表示悬浮培养物中存在更高浓度的原花青素。基于这个方法，几个悬浮培养物的原花青素含量在lg/L至10g/L的范围内。
[0057]越橘细胞提取物的多酹总含量使用福林-乔卡梯奥(Folin-Ciocalteau)测定法(Slinkard, K.;Singleton, V.L.Total Phenol Analysis:Automation and Comparisonwith Manual Methods.American Journal of Enology and Viticulturel977，28:49—55(Slinkard, K.；Singleton, V.L.，“酚总量分析:自动操作和利用手工方法进行比较”，《美国酿酒学与葡萄栽培学杂志》，1977年，第28卷，第49-55页))进行测量。取出25 μ I提取物并将其加入0.975ml的水中，以便在开始测定之前对样品进行稀释，从而对在含有0.5%乙酸的70%丙酮中的细胞培养物提取物进行多酚总含量分析。为了对多酚定量，将20μ I经稀释的提取物添加到0.790ml水加上50 μ I福林-乔卡梯奥试剂中。然后通过加入150 μ I碳酸钠溶液终止反应。所得的溶液在765nm处测量，并与通过相同测定法测量的没食子酸溶液的多个稀释液的校准曲线进行比较，以测定细胞提取物中的总多酚的浓度。
[0058]实例11:从新鲜的越橘细胞或者经研磨的冻干细胞小规模提取多酷
[0059]取无培养基的越橘细胞样品(0.5ml)或者50mg经研磨的越橘细胞样品，放在96孔块(凯杰有限公司(Qiagen, Inc))中的2.0ml微管或者1.2ml管中。向每种越橘细胞样品中加入适当体积的酸性(0-2%的柠檬酸、乙酸或者抗坏血酸)含水提取溶剂(30-80%的丙酮、乙醇、甲醇)，然后放入超声发生器或者珠磨机(BeadMill)中以提取多酚和/或原花青素。将样品在6000rpm(RCF5996)下离心4分钟。使上清液滤过0.45 μ m膜过滤器，并在分析前用相同的含水提取溶剂稀释10倍(如果需要)。剩余的提取物保藏在_20°C的冷冻机中以供进一步分析。
[0060]实例12:对越橘培养物中产生的原花青素进行分析
[0061]使用Waters (美国马萨诸塞州米尔福德市(Milford, Massachusetts, USA))Alliance HPLC系统对越橘细胞提取物进行LC分析，该系统装配有CTC AnalyticsPAL自动进样器(美国北卡罗来纳州卡勃罗市的Leap Technologies公司(LeapTechnologies, Carrbo ro, NC, USA))、带 600S 控制器的 Waters626 栗和从 190_780nm 扫描的Waters2996光电二极管阵列检测器(PDA)。用水-0.1%甲酸(溶剂A)和乙腈-0.1%甲酸(溶剂B)以0.3ml/分钟的恒定流速进行梯度洗脱。以溶剂B的以下比例(v/v)施加线性梯度(t (min)，%B): (O, 7)，(5，15)，(20，75)，(25，100)，(35，100)，(35.1, 7) (45，7)。色谱柱为Ultra Aqueous C18柱(100X2.1mm内径，3.5μηι)(美国宾夕法尼亚州贝尔丰特的瑞斯泰克公司(Restek, Bellefonte, PA.USA))。于280nm处监测原花青素单体(+)-儿茶素、(-)_表儿茶素和低聚原花青素(二聚体至六聚体)。使用Waters Quattro Micro三重四极杆质量检测器(美国马萨诸塞州米尔福德市)获取MS数据，并通过MassLynx?软件进行分析。从m/zl50到1800扫描，进行全扫描数据采集。从美国密苏里州圣路易斯市(St.Louis，MO)的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich, Inc.(St.Louis, MO))购得儿茶素、表儿茶素的可靠标准品，并且制备稀释液以创建校准曲线，从而对代谢物进行检测和定量。
[0062]通过正相HPLC系统进行可定量的原花青素的分析，该系统由Waters2795分离模块、Waters996PDA检测器和Waters474扫描荧光检测器组成。使用DevelosilDiol (250X4.6mm 内径，5 μ 粒度)，按改编自 Kelm et al., the improved processfor analyzing for separating, and for isolating polar protic monomers and/oroligomers.(Kelm等人,“用于分析、分离和离析极性质子单体和/或低聚体的改进方法”)(美国专利N0.0075020)的方法，获得越橘细胞提取物中原花青素的表征和分离条件。二元流动相由溶剂㈧乙腈:乙酸(98:2，v/v)和溶剂⑶甲醇冰:乙酸(95:3:2，v/v/v)组成。用0.8ml/min流速在30°C下如下进行线性梯度洗脱:0_35min，100_60%A ；35-40min, 60%A ；40-45min，60-100%A。通过荧光检测(276nm激发波长，316nm发射波长)、280nm紫外检测(图10A) (Lazarus et al.J.Agric.Food Chem.47 (1999), 3693 (Lazarus 等人，《农业和食品化学杂志》，第47卷，1999年，第3693页))和PDA (图10B)监测原花青素低聚体的分离。
[0063]分析方法的目的是检测十种不同的单独原花青素在新鲜越橘细胞或冻干细胞中的存在。可检测的原花青素有单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体和十聚体。
[0064]通过在Emp0Wer2上执行内部HPLC方法，使用由可可豆进行内部制备的原花青素标准品对由新鲜越橘细胞、冻干越橘细胞和越橘细胞提取物制备的样品进行原花青素估算的分析。
[0065]实例13 :越橘悬浮培养物的扩大培养
[0066]使用植物细胞培养物的一个普遍问题是获得目标产物的持续产生(Kim etal., Biotechnol Prog.20 (6) 1666, 2004(Kim等人,《生物技术进展》，第 20 卷第 6 期，第 1666页，2004年))。因此，成功的大规模植物细胞培养的一个关键是维持稳定的产率。成功进行将越橘细胞培养物的悬浮液从125ml烧瓶扩大培养至250ml烧瓶、随后至500ml烧瓶的过程。针对500ml烧瓶优化摇床的速度，以提供如在125ml烧瓶中那样相同种类的生长和制备次数。测试了三种不同的摇床速度_100、110和120RPM。七天内的平均PCV为50_55%，其针对所有处理而言增大到初始PCV水平(20%)的约2.5倍。然而，与100RPM (此时P值为
0.005)比较时，110RPM下的产品收得率(PY)明显要高得多。虽然当摇床速度介于110RPM和120RPM之间时PY的差异不明显，但120RPM烧瓶中的颜色稍微较暗，从而导致针对500ml烧瓶选择110RPM作为优选的摇床速度。在培养中每7天测量生物质、培养基中糖浓度以及多酚和/或原花青素产率。
[0067]验证扩大培养至2.8L烧瓶的可行性，此时对摇动速度(rpm)和摇床冲程大小进行优化。这成功地产生了如在125ml和500ml烧瓶中那样类似的生长和制备。
[0068]表I
[0069]
【权利要求】
1.一种细胞培养物，其包含:在悬浮细胞培养物中的多个易碎欧洲越橘(Vaccinium myrtillus)细胞,所述细胞源自下列中的一者或多者:幼苗的子叶下轴、子叶、叶段、茎段或根段；或成熟植株的浆果、包括节点或节间的茎段、或叶段，其中所述多个欧洲越橘细胞被挑选为能够在7天生长内获得至少55%的收集细胞体积，并且其中所述多个欧洲越橘细胞的干质量的至少5%由原花青素构成。
2.根据权利要求1所述的细胞培养物，其中所述浆果包括浆果皮。
3.根据权利要求1所述的细胞培养物，其中所述多个欧洲越橘细胞的干质量的至少 10%、15%或20%由多酚构成。
4.根据权利要求1所述的细胞培养物，其中所述多个欧洲越橘细胞的所述干质量的至少7.5%由原花青素构成。
5.根据权利要求1所述的细胞培养物，其中所述多个欧洲越橘细胞的所述干质量的至少10%由原花青素构成。
6.根据权利要求1所述的细胞培养物，其中所述多个欧洲越橘细胞的所述干质量的至少15%由原花青素构成。
7.根据权利要求1所述的细胞培养物，其中所述多个欧洲越橘细胞的所述干质量包含少于0.5%花青素。
8.根据权利要求1所述的细胞培养物，其中所述多个欧洲越橘细胞的所述干质量包含少于0.1%花青素。
9.根据权利要求1所述的细胞培养物，其中所述多个欧洲越橘细胞的所述干质量包含少于0.01%花青素。
10.根据权利要求1所述的细胞培养物，其中所述多个欧洲越橘细胞的所述干质量包含少于0.001%花青素。
11.根据权利要求1所述的细胞培养物，其中所述悬浮细胞培养物中的所述细胞源自欧洲越橘的细胞愈伤组织。
12.根据权利要求1所述的细胞培养物，其中所述悬浮细胞培养物包括细胞的颗粒悬浮液。
13.根据权利要求1所述的细胞培养物，其中所述悬浮细胞培养物包括细胞的微细粒悬浮液。
14.根据权利要求1所述的细胞培养物，其中所述悬浮细胞培养物中的所述多个易碎欧洲越橘细胞源自可食用植物部分。
15.根据权利要求14所述的细胞培养物，其中所述可食用植物部分为叶部分或浆果部分中的一者或多者。
16.一种细胞培养物，其包含:在悬浮细胞培养物中的多个易碎欧洲越橘细胞，所述细胞源自可食用植物部分，其中所述多个欧洲越橘细胞被挑选为能够在7天生长内获得至少55%的收集细胞体积，并且其中所述多个欧洲越橘细胞的干质量的至少10%、15%或20%由多酚构成，并且所述多个欧洲越橘细胞的干质量的至少5%由原花青素构成。
17.根据权利要求16所述的细胞培养物，其中所述可食用植物部分为叶或浆果中的一者或多者。
18.根据权利要求16所述的细胞培养物，其中所述浆果包括浆果皮。
19.一种细胞培养物，其包含:在悬浮细胞培养物中的多个易碎欧洲越橘细胞，所述细胞源自浆果的至少一部分，其中所述多个欧洲越橘细胞被挑选为能够在7天生长内获得至少55%的收集细胞体积，并且其中所述多个欧洲越橘细胞的干质量的至少10%、15%或20%由多酚构成，并且所述多个欧洲越橘细胞的干质量的至少5%由原花青素构成。
20.根据权利要求19所述的细胞培养物，其中所述浆果部分包括浆果皮。
21.—种制备欧洲越橘细胞的细胞培养物的方法，所述方法包括:制备源自下列中的一者或多者的欧洲越橘细胞的细胞愈伤组织: 幼苗的子叶下轴、子叶、叶段、茎段或根段；或成熟植株的浆果、包括节点或节间的茎段、或叶段；将源自所述愈伤组织的一个或多个细胞引入液体培养基内；搅拌所述液体培养基中的所述一个或多个细胞；用新鲜的液体培养基替换所述液体培养基或将所述细胞转移至新鲜液体培养基，以形成欧洲越橘的悬浮细胞培养物；使欧洲越橘的所述悬浮细胞培养物生长到至少55%的收集细胞体积；以及挑选这样的悬浮细胞培养物，其中所述多个欧洲越橘细胞的干质量的至少10%、15%、 20%由多酚构成，且所述细胞干质量的至少5%由原花青素构成。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述欧洲越橘细胞源自可食用植物部分。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述可食用植物部分为叶或浆果中的一者或多者。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述浆果包括浆果皮。
25.根据权利要求20所述的方法，还包括使欧洲越橘的所述悬浮细胞培养物在7天时间或更短时间内生长到至少55%的收集细胞体积。
26.根据权利要求21所述的方法，还包括使欧洲越橘的所述悬浮细胞培养物在7天时间或更短时间内生长到至少60%的收集细胞体积。
27.根据权利要求21所述的方法，其中所述多个欧洲越橘细胞的所述干质量的约10% 由原花青素构成。
28.根据权利要求21所述的方法，其中所述多个欧洲越橘细胞包含少于约0.1%花青素。
29.根据权利要求21所述的方法，其中所述多个欧洲越橘细胞基本上不含花青素。
30.根据权利要求21所述的方法，其中所述生长在黑暗状态中进行。
31.根据权利要求21所述的方法，其中所述生长在环境温度条件下进行。
32.根据权利要求21所述的方法，其中所述生长在23°C+/_5°C进行。
33.根据权利要求21所述的方法，还包括形成细胞的颗粒悬浮液。
34.根据权利要求21所述的方法，还包括形成细胞的微细粒悬浮液。
35.根据权利要求21所述的方法，其中所述液体培养基选自VM1799、VM1831、VM1933 和 DC1151。
36.根据权利要求21所述的方法，其中所述搅拌通过旋转式摇床进行。
37.根据权利要求21所述的方法，其中每周加入所述新鲜液体培养基或将所述细胞转移至所述新鲜液体培养基。
38.根据权利要求21所述的方法，还包括测量所述悬浮培养物中的所述细胞消耗碳水化合物的速率。
39.根据权利要求38所述的方法，其中通过折射率(RI)测量消耗碳水化合物的所述速率。
40.根据权利要求39所述的方法，其中当所述RI小于或等于所述新鲜培养基的初始 RI的二分之一时，向悬浮培养中的所述细胞加入额外的新鲜培养基。
41.根据权利要求40所述的方法，其中在继代培养之后的第6天测量RI和细胞质量， 并且进行液体培养基更换。
42.一种增加欧洲越橘细胞在悬浮细胞培养物中的生长的方法，所述方法包括:提供欧洲越橘细胞的悬浮细胞培养物；在悬浮培养中在液体培养基中培养所述细胞；以及挑选具有大于45%的收集细胞体积(PCV)的悬浮细胞培养物。
43.根据权利要求42所述的方法，还包括挑选具有响应于所述液体培养基中糖浓度的提高而增加的多酚和/或原花青素积聚的悬浮细胞培养物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述液体培养基中的所述糖浓度包括大约 30-60g/L 鹿糖。
45.根据权利要求43所述的方法，其中原花青素在悬浮培养物中的所述细胞内的积聚从20g/L蔗糖下的l_2g/L PCV增至30g/L蔗糖下的3_7g/LPCV，并且其中多酚在悬浮培养物中的所述细胞内的积聚从20g/L蔗糖下的2-4g/L PCV增至60g/L蔗糖下的5_10g/L PCV。
46.根据权利要求42所述的方法，其中所述培养为约7天。
47.根据权利要求42所述的方法，其中所述提供的细胞最初具有15%PCV至25%PCV的起始细胞密度。
48.根据权利要求42所述的方法，其中所述提供的细胞最初具有25%PCV或更大的起始细胞密度。
49.根据权利要求42所述的方法，其中所述提供的细胞最初具有20%PCV或更大的起始细胞密度。
50.根据权利要求42所述的方法，还包括挑选具有大于50%PCV的悬浮细胞培养物。
51.根据权利要求42所述的方法，还包括挑选具有大于55%PCV的悬浮细胞培养物。
52.根据权利要求42所述的方法，还包括挑选具有大于60%PCV的悬浮细胞培养物。
53.根据权利要求42所述的方法，还包括弃去超过7天才能达到45%PCV的培养物。
54.一种提高培养物中的欧洲越橘细胞的多酚产量的方法，所述方法包括:挑选多个适于以悬浮培养的方式生长的欧洲越橘细胞，所述欧洲越橘细胞源自下列中`的一者或多者:幼苗的子叶下轴、子叶、叶段、茎段或根段；或成熟植株的浆果、包括节点或节间的茎段、或叶段；在存在足量糖的情况下以悬浮培养的方式培养所述欧洲越橘细胞以提高多酚产量。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述欧洲越橘细胞的干质量的至少10%、15%或 20%由多酚构成。
56.根据权利要求54所述的方法，还包括在具有大于20g/L糖的液体培养基中以悬浮培养的方式培养所述细胞。
57.根据权利要求54所述的方法，还包括在具有20g/L至30g/L糖的液体培养基中以悬浮培养的方式培养所述细胞。
58.根据权利要求54所述的方法，还包括在具有大于30g/L糖的液体培养基中以悬浮培养的方式培养所述细胞。
59.根据权利要求54所述的方法，其中所述糖为蔗糖。
60.根据权利要求54所述的方法，其中所述糖为葡萄糖。
61.根据权利要求54所述的方法，其中所述糖以足以使多酚产量增至超过3g/L收集细胞体积(PCV)的量存在。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述糖以足以使多酚产量增至至少7g/L收集细胞体积(PCV)的量存在。
63.根据权利要求54所述的方法，其中所述多酚为原花青素。
64.根据权利要求54所述的方法，还包括在黑暗状态中培养所述细胞。
65.—种从培养物中的欧洲越橘细胞提取多酚的方法，所述方法包括:挑选多个适于以悬浮培养的 方式生长的欧洲越橘细胞，所述细胞源自下列中的一者或多者:幼苗的子叶下轴、子叶、叶段、茎段或根段；或成熟植株的浆果、包括节点或节间的茎段、或叶段；以及使用溶剂从所述细胞中提取多酚，其中所述多个欧洲越橘细胞的干质量的至少10%、15%或20%由多酚构成，并且所述多个欧洲越橘细胞的干质量的至少5%由原花青素构成。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述细胞为愈伤组织细胞。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述溶剂包括丙酮。
68.根据权利要求65所述的方法，其中所述溶剂包括乙酸。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述溶剂包括70%丙酮(v/v)和0.5%乙酸(v/v)。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述溶剂还包括水。
71.根据权利要求65所述的方法，包括:在细胞匀化器中将所述细胞与所述溶剂合并；在存在所述溶剂的情况下在所述匀化器中将所述细胞匀化，以便从所述细胞中提取所述多酚。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述匀化器为球磨机。
73.根据权利要求71所述的方法，还包括:将所述匀化的细胞离心以制备上清液部分和沉淀部分；以及从所述上清液获得所述提取的多酚。
74.根据权利要求65所述的方法，其中从所述细胞提取的所述多酚包括原花青素。
75.根据权利要求65所述的方法，其中从所述细胞提取的所述多酚基本上不含花青素 。
【文档编号】C07D311/62GK103459589SQ201280015214
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年2月6日 优先权日:2011年2月4日
【发明者】尹圣镛, 索尼娅·拉尔 申请人:戴安娜植物科学有限公司