专利名称：一种具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及化学合成技术领域，更具体地，本发明涉及一种具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法和应用。
背景技术：
目前，常用的多肽化合物没有完整的免疫原性，免疫时需要偶联载体蛋白，并且特异性不强，灵敏度不高，制备方法复杂。更重要的是由于制备后的抗原含有载体蛋白，所以用此抗原制备的抗体会产生抗载体蛋白的抗体，有时会对后期的实验产生不良影响即非特异性反应。·
发明内容
本发明旨在至少解决上述技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有完整免疫原性，且制备方法简单的具有免疫活性的多肽衍生物。根据本发明实施例的具有免疫活性的多肽衍生物，具有下列序列结构R8 (Kys) 4- (Lys) 2-LyS_Gly，其中，R 表示多肽片段，其序列为YDESGPSIVHRKCF_GSK。根据本发明实施例的具有免疫活性的多肽衍生物，一个赖氨酸支架上同时合成八个目的多肽，该目的多肽大大的增加了多肽抗原的分子量及抗原性，从而免去偶联载体蛋白，使抗原的特异性更好。本发明的另一个目的在于提出一种具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法，其具体操作步骤可以包括a)提供9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸(Fmoc-AA)并使其活化，得到活化氨基酸；b)将所述活化氨基酸与P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂(HMP树脂)反应，得到连接有氣基酸的树脂；C)脱除所述连接有氨基酸的树脂的Fmoc保护基；d)将脱除Fmoc保护基的连接有氨基酸的树脂与过量的活化羧基组份偶联，并脱去偶联后活化氨基组份的氨基保护基；e)重复步骤d)至脱去偶联后活化氨基组份的氨基保护基的数目为8，得到八分支活化氨基组份骨架；f)将所述八分支活化氨基组份骨架同时连接8个相同的多肽，得到肽树脂，将所述肽树脂分离提纯，得到具有免疫活性的多肽衍生物。根据本发明实施例的具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法，其合成过程在自动化的多肽合成仪上完成，制备工艺简便，结构准确，偶联率高，周期短，自动化程度高。
为了快速得到八分支活化氨基组份骨架，所述活化氨基组份优选为赖氨酸。当所述活化氨基组份为赖氨酸时，在脱去偶联后活化氨基组份的氨基保护基过程中便可脱去两个氨基保护基，再与过量的赖氨酸偶联时，就可以与两个赖氨酸同时偶联，再脱去偶联后活化氨基组份的氨基保护基时便可脱去四个氨基保护基。依此类推，第三次脱除过程便可脱去八个氨基保护基，得到八分支活化氨基组份骨架。所述八个相同的多肽R优选为YDESGPSIVHRKCF-GSK，由此，便可得到具有免疫活性的多肽衍生物(YDESGPSIVHRKCF-GSK) 8 (Kys) 4- (Lys) 2-Lys_Gly。关于具有免疫活性的多肽衍生物的分离提纯，具体可以包括f-Ι)用三氟乙酸(TFA)结合清除剂与所述肽树脂反应，以将所述具有免疫活性的多肽衍生物从肽树脂上分离；
f-2)反应后去除清除剂，并用萃取液萃取，得到具有免疫活性的多肽衍生物粗品;f-3)将具有免疫活性的多肽衍生物粗品进行纯化，得到具有免疫活性的多肽衍生物。关于清除剂的选择，没有特殊限制，只要能将所述具有免疫活性的多肽衍生物从肽树脂上分离即可，优选地，所述清除剂为1，2-乙二硫醇(EDT)、硫代苯甲醚和水的混合溶液。为了保证反应的充分进行，反应时间优选3h。所述萃取液的选择也没有特殊限制，考虑到成本问题，所述萃取液优选为乙醚。关于具有免疫活性的多肽衍生物的纯化，采用高效液相色谱分离纯化，其具体操作条件为
色谱柱 Ci8 25 X 250mm
色谱仪 Waters 600美国Waters公司
流动相 A-Ο. P/oTFA (三氟乙酸)H2O
B -O. 1% TFA (三氟乙酸)于60 乙腈 检测波长 214nm 流速 I Oml/分钟 洗脱梯度 2G-60%B 洗脱时间 30分钟由此，可制得纯度为98%以上的具有免疫活性的多肽衍生物。本发明还提出了一种具有免疫活性的多肽衍生物在制备抗体中的应用。基于所述具有免疫活性的多肽衍生物具有完整的免疫原性，则根据该具有免疫活性的多肽衍生物制备而成的抗体具有特异性强，灵敏度高，稳定性好的特点，为广大科研人员提供了高质量的抗体，同时为开发其它多肽抗体开辟了一条新思路。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中图1是根据本发明实施例的具有免疫活性的多肽衍生物高效液相色谱分析示意图。
具体实施例方式以下通过具体实施例来进一步描述本发明，下列实施例用于说明目的，而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，可按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。下列实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买所得。实施例1具有免疫活性的多肽衍生物的制备
一、试验材料HMP resin (P-轻甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂，Wang树脂)购于Merck公司Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸)购于Merck公司NMP氮甲基吡咯烷酮购于Merck公司DCM 二氯甲烷购于Merck公司MeOH甲醇购于Merck公司Piperidine 哌唳购于 Merck 公司DMAP 二甲基氨基吡啶购于Sigma公司HOBT羟基苯并三唑购于Sigma公司DCC 二环已基碳二亚胺购于Sigma公司TFA三氟乙酸购于Sigma公司EDT 1,2-乙二硫醇购于Sigma公司硫代苯甲醚购于Sigma公司结晶苯酚购于北京化学试剂公司公司乙腈购于Merck公司二、试验仪器多肽自动合成仪美国CSBio 336型多通道多肽自动合成仪旋转蒸发仪日本YAMATO CE50型旋转蒸发仪高效液相色谱仪Waters 600E型冷冻干燥机美国Virtis真空循环水泵郑州长城科贸公司SH-B型离心机美国SIGMA公司三、试验步骤1、活化 Fmoc-AA。所述Fmoc-AA的结构式如下所示
权利要求
1.一种具有免疫活性的多肽衍生物，所述多肽衍生物具有下列序列结构R8 (Kys) 4- (Lys) 2-LyS_Gly，其中，R 表示多肽片段，其序列为YDESGPSIVHRKCF_GSK。
2.一种具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤a)提供9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸(Fmoc-AA)并使其活化，得到活化氨基酸；b)将所述活化氨基酸与P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂(HMP树脂)反应，得到连接有氣基酸的树脂；c)脱除所述连接有氨基酸的树脂的Fmoc保护基；d)将脱除Fmoc保护基的连接有氨基酸的树脂与过量的活化羧基组份偶联，并脱去偶联后活化氨基组份的氨基保护基；e)重复步骤d)至脱去偶联后活化氨基组份的氨基保护基的数目为8，得到八分支活化氨基组份骨架；f)将所述八分支活化氨基组份骨架同时连接8个相同的多肽，得到肽树脂，将所述肽树脂分离提纯，得到具有免疫活性的多肽衍生物。
3.根据权利要求2所述的具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法，其特征在于，在步骤a)中，所述Fmoc-AA通过与人多巴胺脱羧酶(DDC)和羟基苯并三唑(HOBT)反应活化。
4.根据权利要求2所述的具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法，其特征在于，所述活化氨基组份为赖氨酸。
5.根据权利要求2所述的具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法，其特征在于,所述多肽为YDESGPSIVHRKCF-GSK。
6.根据权利要求2所述的具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法，其特征在于，步骤f)包括f-1)用三氟乙酸(TFA)结合清除剂与所述肽树脂反应，以将所述具有免疫活性的多肽衍生物从肽树脂上分离；f-2)反应后去除清除剂，并用萃取液萃取，得到具有免疫活性的多肽衍生物粗品；f_3)将具有免疫活性的多肽衍生物粗品进行纯化，得到具有免疫活性的多肽衍生物。
7.根据权利要求6所述的具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法，其特征在于，所述清除剂为I，2-乙二硫醇(EDT)、硫代苯甲醚和水的混合溶液，步骤f-Ι)的反应时间为3h。
8.根据权利要求6所述的具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法，其特征在于，所述萃取液为乙醚。
9.根据权利要求6所述的具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤f_3)的纯化采用高效液相色谱分离纯化。
10.一种具有免疫活性的多肽衍生物在制备抗体中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法和应用，所述多肽衍生物具有下列序列结构R8(Kys)4-(Lys)2-Lys-Gly，其中，R表示多肽片段，其序列为YDESGPSIVHRKCF-GSK。根据本发明实施例的具有免疫活性的多肽衍生物，一个赖氨酸支架上同时合成八个目的多肽，该目的多肽大大的增加了多肽抗原的分子量及抗原性，从而免去偶联载体蛋白，使抗原的特异性更好。
文档编号C07K16/00GK102993276SQ20121043880
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者姬志娟, 邬晓乐, 邬江, 张波, 张军龙, 张春玲, 张婉婷, 薛金莲, 沈向阳, 乔国明 申请人:北京博奥森生物技术有限公司