专利名称：一种抗血管内皮生长因子受体2的单链抗体的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种全新的可与血管内皮生长因子受体2 (vascular endothelial growth factorreceptor, VEGFR)特异结合的高亲和力全人源单链抗体，能抑制VEGF诱导的血管内皮细胞(human umbilical vascularendothelial cell,HUVEC)的增殖，是一种具有抗血管生成活性的基因工程抗体。
背景技术：
癌细胞在生长因子受体的激活下增殖，癌细胞生长时会促进自身促血管生长因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等的表达上调，刺激内皮细胞活化，分泌出其他血管生成所需要的蛋白酶，引起一系列的级联反应，通过抗凋亡等机制调节内皮细胞的存活，促进新生血管形成并维持其完整性。内皮细胞在VEGF等刺激因子作用下增殖，大量增殖的内皮细胞重新排列形成条索状，刺激成纤维细胞分泌细胞外基质，形成新的血管。人VEGF受体2(VEGFR-2)，又称为KDR(kinase insertdomain-containing receptor, KDR)是VEGF的主要信号传导受体，其参与新生血管内皮细胞的迁移、增殖、生存，在肿瘤周围血管新生过程中具有重要的作用。因此，抑制VEGF/VEGFR-2途径是抑制肿瘤转移及生长的重要途径。靶向VEGF信号通路药物主要有三类:一类是直接作用于受体细胞内区段以防止信号传导的合成的酪氨酸激酶抑制剂(ΤΚΙ)，主要包括ΡΤΚ787，Sutent, Sorafinib,Zactima and Recentin等 等；另一类是抗VEGF阻断配体结合到受体胞外功能域的单克隆抗体(MAb),包括贝伐单抗(bevacizumab)和阿普西柏(afIibercept)等,第三类是作用于VEGFR-2 的抗体，如:RamucirumabaMC-1121B)和 CDP-791。贝伐单抗(bevacizumab,商品名AVASTIN)是抗人VEGF的人源化IgGl单克隆抗体，于2004年被美国食品药品管理局批准作为抑制肿瘤血管生成的抗肿瘤药物。而靶向VEGFR-2的抗体将因其选择的高度特异性而体现出更好的潜在的临床应用价值。KDR作为一种酪氨酸激酶受体，由一个胞外结构域，一个跨膜结构域和一个胞质内酪氨酸激酶结构域组成，其胞外有7个胞外免疫球蛋白样区，其中3区(含有97个氨基酸)对VEGF的紧密结合部位贡献最为突出。前期工作中以KDR胞外3区(KDR3)为靶抗原，利用曬菌体展示技术从Griffin.1单链抗体库中筛选出了具有单链抗体(single chainantibody variable fragments, scFv)AK404R。一般来说，亲和力高的抗体比亲和力低的抗体在体内的半衰期要长，因此对治疗用的抗体来说，亲和力的高低将是一个极为重要的因素。一种抗体的亲和力，其分子基础在于抗体可变区，尤其是CDR区的基因序列。由于AK404R未经过抗原免疫驱动的亲和力成熟过程，需要提高其亲和力以获得满足临床应用需求的高亲和力单链抗体。本发明利用蛋白质非定向突变技术，将AK404R的CDR3区进行突变，获得突变抗体库，自该库中筛选获得较高亲和力的噬菌体单链抗体。
发明内容
发明目的本发明基于具有提高体外亲和力的单链抗体突变体库的构建，提供一种具有潜在医学和药学价值的全人源的抗KDR3的高亲和力单链抗体。技术方案一种抗血管内皮生长因子受体2的单链抗体，所述单链抗体包括重链可变区域和轻链可变区域，并且重链可变域和轻链可变区域通过柔性肽连接，柔性肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:9 ；其特征在于:其中所述的抗体含有重链⑶R3域，该域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；轻链CDR3域，该域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；含有重链⑶R2域，该域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；所述的抗血管内表皮生长因子受体的单链抗体具有轻链CDR2域，该域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；含有重链⑶Rl域，该域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；所述的抗血管内皮生长因子受体的单链抗体具有轻链CDRl域，该域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。所述的一种抗血管内皮生长因子受体2的单链抗体，其特征在于:所述的重链可变区域的氨基酸序列为SEQ ID NO:1 ;轻链可变区域为SEQ ID NO:2的氨基酸序列，
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一种分离的核酸，其特征在于该核酸编码上述的抗体。—种表达载体，含有上述的核酸。一种重组宿主细胞，含上述的表达载体。上述任一项的抗体或抗体片段的应用，选择性地与VEGFR-2结合或抑制VEGF与VEGFR-2的结合或中和VEGF。上述任一项的抗体片段,选自单链抗体、Fab、单链Fv、双抗体和三抗体。上述任一项的抗体或抗体片段的偶联物。所述的偶联物，含有抗肿瘤药物、靶组成部分或报告组成部分。其中所述的AK404R的序列为SEQ ID NO:11。AK404R-VHI GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG 451EVQLVESGGGVVQPG 1546 AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT 9016RSLRLSCAASGFTFS30VH-CDRl91 AGC TAT GCT ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG 13531 SYAMH WVRQAPGKGL45VH-CDR2136 GAG TGG GTG GCA GTT ATA TCA TAT GAT GGA AGT AAT AAA TAC TAT 18046 E W V A VISYDGSNKYY 60
181 GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC 22561 ADSVKG RFTISRDNS75226 AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC 27076KNTLYLQMNSLRAED90VH-CDR3271 ACG GCC GTG TAT TAC TGT GCA AGA CGG TTT GAG CCT CCT TTT GAC 31591TAVYYCAR R F E P P F D 105316 TAT TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTC360106 YffGQGTLVTV120AK404R-VLI CTT CAG TCT GTG CTG ACT CAG CCA CCC TCA GCG TCT GGG ACC CCC 451LQSVLTQPPSASGTP15VL-CDRl46 GGG CAG AGG GTC ACC ATC TCT TGT TCT GGA AGC AGC TCC AAC ATC 9016GQRVTISC S G S S S N I 3091 GGA AGT AAT ACT GTA AAC TGG TAC CAG CAG CTC CCA GGA ACG GCC 13531 GSNTVN WYQQLPGTA 45VL-CDR2136 CCC AAA CTC CTC ATC TAT AGT AAT AAT CAG CGG CCC TCA GGG GTC 18046 P K L L I Y S N N Q R P S G V 60181 CCT GAC CGA TTC TCT GGC TCC AAG TCT GGC ACC TCA GCC TCC CTG 22561PDRFSGSKSGTSASL 75226 GCC ATC AGT GGG CTC CAG TCT GAG GAT GAG GCT GAT TAT TAC TGT 27076AISGLQSEDEADYYC 90VL-CDR3271 GCA GCA TGG GAT GAC AGC CTG CCG GCG TCT GTA TTC GGC GGA GGG 31591 AAffDDSLPASV FGGG 105316 ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT336106 T K L T V L G120发明进一步说明:本发明中抗血管内皮生长因子受体2单链抗体基因序列全长732bp (AKl I，见SEQID NO: 10)，244个氨基酸 。具有117个氨基酸的重链可变区(SEQ ID NO:1)和112个氨基酸的轻链可变区(SEQ ID NO:2)，通过15个氨基酸的柔性肽连接(SEQ ID NO:9)。含有本发明血管内皮生长因子受体2单链抗体基因的表达载体和表达宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增本发明单链抗体基因的任意片段的引物对也在本发明的保护范围之内。有益效果:本发明基于具有提高体外亲和力的单抗体突变体库的构建，提供一种具有潜在医学和药学价值的全人源的抗KDR3的高亲和力单链抗体，突变后的单链抗体AK-1l显示出比亲本抗体AK404R提高3倍的体外亲和力和更强的抑制VEGF诱导的HUVEC细胞增殖的活性。本发明单链抗体的特征为特异性高亲和力结合人VEGFR-2胞外3区-KDR3，在体外能够抑制VEGF诱导的HUVEC细胞的增殖。具体来说:本发明通过错配PCR对亲本单链抗体AK404R重链和轻链⑶R3区进行突变，建立抗体的次级突变库；以人VEGFR-2胞外3区蛋白KDR3为靶抗原，筛选获得一个对靶抗原KDR3亲和力显著提高的单链抗体AK-1l ;用ImM IPTG诱导表达；利用渗透体克提取细菌周质蛋白，低湿离心去除细胞碎片，将上清采用镍柱亲和层析法进行分离纯化；测定单链抗体AK-1l对VEGF诱导的HUVEC细胞增殖的抑制作用。本发明得到对靶抗原KDR3亲和力提高的单链抗体AK-11，体外抑制HUVEC细胞增殖实验结果表明，本发明得到的单链抗体可以显著抑制HUVEC细胞的增殖。本发明为治疗以血管内皮生长因子受体的表达，特别是过量表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗法，相关疾病包括但不限于癌症和视网膜黄斑病变等糖尿病并发眼部疾病。
图1是用错配PCR技术构建次级突变库的构建图。图2是单链抗体AK-1l的结构示意图。VH-⑶R1，红色；VH_⑶R2，绿色；VH_⑶R3，黄色；VL-CDRl，蓝色；VL_CDR2，紫红色；VL_CDR3，青绿色。图3显示SDS-PAGE蛋白质电泳图，描述发酵表达的AK-1l通过镍柱进行分离纯化的结果，泳道I为菌体周质提取物上清，泳道2为镍柱亲和层析的样品收集液，泳道3 9分别为PBS，含10，20，50，80，100，200，500mM咪唑缓冲液洗脱获得，其中含IOOmM咪唑缓冲液洗脱镍柱得到的为较纯的目的蛋白。图4是ELISA检测亲和力的结果图，单链抗体AK-1l的吸光值平均为亲本抗体的吸光值的3倍。图5描述并比较了单链抗体AK-1l和亲本单链抗体AK404R对VEGF诱导的HUVEC细胞增殖的抑制作用。
具体实施例方式以下借助非限制性实施例举详细描述本发明。对本领域技术人员而言，在不背离本发明精神的前提下对它所做的任何显而易见的改动，特别是对若干部件的等同替换，都构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责任。实施例中涉及的百分比，其中固定试剂为重量体积百分比，液体试剂为体积百分比。实施例1错配PCR-次级突变库的构建以亲本单链抗体AK404R的DNA(Juan Zhang,Haixin Li,Xiuyun Wang, et al.[J].Biotechnology Progress, 2012, PMID:22581629)为模板，设计引物 Pl 和 P2，其中 Pl 和 P2引物的序列(5' —3')分别为 GGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCC(Sfi I)ATGG(SEQ ID NO:12)，TTGGCCCCAATAGTCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTCTTGCACAGTAAT(SEQ ID NO:13);在反应体系中加入 7mmol/LMgCl2、lmmol/L dCTP/dTTP、02mmol/dATP/dGTP、0.5mmol/L MnCl2>5U Taq 酶,94°C预变性 5min,每循环反应条件为 94°C lmin, 55°C lmin,72°C lmin，进行35轮循环后，72°C延伸7min。PCRl产物经电泳分析后作为PCR2的模板，Pl和 P3 为引物，其中 P3 引物序列(5' — 3')为 5' -CACCACTCGAG (Xho I) ACGGTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAATAGT (SEQ ID NO: 13)，进行第二轮PCR，得到VH的突变体。按照同样的方法，对轻链⑶R3区进行突变，所用引物为P4、P5、P6，其中P4、P5、P6的序列(5' —3')分别为CTATTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTG(SEQ ID NO: 14),CTCCGCCGAANNKNNKNNKNNKNNKNNKGTCATCCCATG(SEQ ID NO:15)，GATGTGCGGCC(NotI)GCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCCGAATA (SEQ ID NO: 16)，得到VL的突变体，突变后的VH和VL经过重叠延伸PCR组装成完整的单链抗体，产物经柱(购自Biomiga中国)纯化后和噬菌粒表达载体pHEN2 (购自 Griffin I library，序列见 htt p://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk) 一起用 Sfil 和 Notl酶切，载体用CIAP-牛小肠碱性磷酸酶(购自Fermentas公司)去磷酸化后，16°C用T4DNA连接酶(购自Fermentas公司)连接过夜，获得由一系列含有重链和轻链CDR3突变的单链抗体基因分别与噬菌粒表达载体连接构成的重组载体pHEN2-mAK404R的单链抗体次级突变库。用Bio-rad的电转仪及配套的电转杯在1.3kV下将构建的重组载体进行电穿孔法转化感受态E.coli TGl (Novagen公司)，将转化菌稀释至不同的梯度:原液、10_2、10_4和10'分别取50 μ I铺于含有20mM MgSO4和100 μ g/ml Amp的SOB琼脂板，37°C培养12 16h，随机挑取20株单克隆菌株送测序公司测序，检测抗体序列的多样性。按照平板上长的单克隆个数计算库容量。从板上刮除克隆，随后加入30%甘油，混匀，储存于-80°C，即为次级突变库。抗体文库的扩增参考常规噬菌体文库的扩增方法(参照沈倍奋《重组抗体》，科学出版社，2005年)，以KDR3为抗原，进行实施例2，自该突变次级库中筛选单链抗体。实施例2抗KDR3单链抗体突变体的筛选及鉴定以包被缓冲液(IOOmM Tris, NaCl 150mM，ρΗ9.0)稀释 KDR3 蛋白(Juan Zhang,Haixin Li, Wei Chen. Preparation of Extracellular Domain 3 of Human VEGFReceptor-2 and the Monitoring of Its Real-Time Binding to VEGF by Biosensors.Biotechnol.Prog.，2009, Vol.25, N0.6)至 100 μ g/ml ;取 4mI 加入到免疫管中，4°C包被过夜；次日，充上清，PBS迅速洗管3次；2% MPBS (含有2%脱脂牛奶的PBS)，37°C封闭2h ;充封闭液，用PBS迅速洗管3次；将实施例1制备的噬菌体抗体突变库(1012 IO13p.f.u)悬浮于4ml 2%10^5并加入到免疫管中，室温反复倒转301^11后，于室温静置901^11以上；以含有0.1 % Tween-20的PBS洗管10次，再以PBS洗管10次去除去污剂；加入Iml IOOmM三乙胺(700 μ I 7.18mol/L三乙胺加入50ml水中)，室温反复倒转孵育lOmin，进行特异性洗脱；0.5ml IMTris (pH7.4)用于迅速中和洗脱下来的噬菌体；中和后的噬菌体用于感染对数期的E.coli TG1，进行扩增和制备，用于下一轮筛选，连续进行四轮筛选。四轮筛选中KDR3 包被的浓度分别为 5 μ g/ml, 5 μ g/ml, 2.5 μ g/ml, I μ g/ml。任意挑取取第四轮筛选获得的噬菌体感染200 μ I处于对数生长期的感染琥珀突变型蛋白表达菌株Ε.coli HB2151 (Novagen公司)，ImM的IPTG于30°C诱导过夜，进行抗体ELISA筛选亲和力高的单链抗体。方法如下:酶标板包被I μ g/ml的KDR3，每孔100 μ I。4°C包被过夜，5%的脱脂奶粉封闭，37°C封闭2h。将制备得到的上清中的不同种类的抗体各100 μ I加入到对应的孔中。一抗为1: 2000稀释的鼠源抗C-MyC抗体，二抗为1: 5000稀释HRP标记的山羊抗鼠抗体,加入TMB显色液显色30min后,每孔加入50 μ I lmol/L H2SO4终止反应，酶标仪测定0D450/0D650作为最后检测结果。实施例3抗KDR3单链抗体的可溶性表达及分离纯化挑选抗体ELISA初步检测值较高的菌株，37°C培养至0D600 = 0.8，加入终浓度ImM的IPTG，30°C诱导过夜，取样进行15% SDS-PAGE，分析目的蛋白表达。将过夜菌液6000rpm，4°C离心15min，收集菌体；PBS重悬洗涤菌体一次，采用渗透休克法破碎菌体，即高渗溶液(50mM Tris-HCl，20%蔗糖，ImM EDTA, pH8.0)重悬菌体，缓慢搅拌lOmin，4°C，9000g离心lOmin，倒出上清，用冰冷的5mM MgSO4重悬沉淀，缓慢搅拌lOmin, 4°C, IOOOOg离心20min将上清与上一步上清合并用于镍柱(购自GE Healthcare)亲和层析纯化，用不同浓度的咪唑洗涤杂蛋白，洗脱目的蛋白；15% SDS-PAGE检测收集的样品，-20°C保存目的蛋白，命名为单链抗体AK11，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2，重链和轻链由SEQ ID NO:9相连。实施例4ELISA测定相对亲和力方法同实施例2初步检测亲和力ELISA。将KDR3溶解在0.05mol/L碳酸缓冲液(pH9.6)中，终浓度为I μ g/ml，每孔100 μ I将抗原加到96孔板中，4°C包被过夜。5%的脱脂奶粉封闭2h。分别加入4000，3000，2000，1000, 500, 250nM/ml的AK-1I抗体，以亲本单链抗体作对照，37°C孵育90min，用PBST洗三次，每次5min。一抗为1: 2000稀释的鼠源抗c-Myc抗体，二抗为1: 5000稀释HRP标记的山羊抗鼠抗体。加入TMB显色液显色30分钟后，每孔加入50 μ I lmol/L H2SO4终止反应，酶标仪测定0D450/0D650作为最后检测结果。结果见图4，在相同的浓度下，突变体AKll的吸光度值0D450/650高于3倍亲本AK404R的吸光度值，显示突变抗体对抗原有较高的亲和力。实施例5单链抗 体AKl I对HUVEC细胞的生长抑制作用HUVEC细胞(购自上海生化与细胞所)于37°C、5%C02培养箱中培养，待长满90%以上时，换液。将重悬后的细胞稀释至3X IO4细胞/ml，96孔板中每孔加100μ 1，同时设置空白对照组(即不含细胞，只加培养基)，于37°C、5 % CO2培养箱中培养24h后加待测物。用DMEM+1 % FBS 培养基将 AK-1l 稀释到:5000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、50ng/mlU0ng/nL.每孔100 μ 1，每个浓度设置三个平行孔(η = 3)，同时设置空白对照和阴性对照(无VEGF)，VEGF终浓度为10ng/ml。最后于37°C、5% CO2培养箱中培养72h。培养72h后,每孔加入5mg/ml MTT溶液12 μ I,于培养箱中继续培养4h。然后于平板离心机中，3000rpm离心5min后，吸出孔中溶液，加入150 μ I/孔DMSO溶液，再于微量振荡器上振荡lOmin，最后酶标仪上检测570nm和630nm处的吸光度值，则每个孔的吸光度值即为 A570-A630。抗体对VEGF诱导的内皮细胞抑制率计算公式为:(Ara-AgV(Ag-As) X 100%。结果见图5，在本实验条件下，单链抗体AK-1l对VEGF诱导的HUVEC细胞增殖的50%抑制浓度，即IC50值为15.08nM，而在相同实验条件下，亲本抗体AK404R的IC50值为
19.65nM，显示突变体具有高于亲本抗体的体外抗血管内皮细胞增殖的活性。
权利要求
1.一种抗血管内皮生长因子受体2的单链抗体，所述单链抗体包括重链可变区域和轻链可变区域，并且重链可变域和轻链可变区域通过柔性肽连接，柔性肽的氨基酸序列为SEQID NO:9，其特征在于:其中所述的抗体含有重链⑶R3域，该域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列；轻链CDR3域，该域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。
2.根据权利要求1 所述的一种抗血管内皮生长因子受体2的单链抗体，其特征在于:所述的重链可变区域的氨基酸序列为SEQ ID NO:1 ;轻链可变区域为SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种经过体外亲和力成熟的全人源的抗KDR3单链抗体AK-11，具体为AK-11的重链可变区和轻链可变区免疫球蛋白分子的氨基酸序列，以及包含重链可变区和轻链可变区免疫球蛋白分子的氨基酸序列，包括对应于互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的序列。本发明还提供产生和表达AK-11的方法，用错配PCR建库和噬菌体筛选的方法筛选获得了一株亲和力较高的全人源的抗VEGFR2单链抗体AK-11，后通过原核细胞分泌表达、亲和层析纯化获得单链抗体。本发明的单链抗体可特异性结合于血管内皮生长因子受体2，可以抑制VEGF诱导的HUVEC的生长，可应用于制备治疗剂。
文档编号C07K16/28GK103113469SQ20121039374
公开日2013年5月22日 申请日期2012年10月17日 优先权日2012年10月17日
发明者张娟, 王旻, 齐海迪, 曹婉璐, 李致科, 王泽根 申请人:中国药科大学