专利名称：一种棉籽糖的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及化学工程技术领域，具体涉及一种棉籽糖的分离纯化方法。
背景技术：
棉籽糖(Raffinose)又称蜜三糖(Melitriose)或棉子糖，它由半乳糖、葡萄糖和果糖结合而成，属低聚糖，系非还原糖。经研究发现，棉籽糖是人体肠道中的双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌等有益菌极好的营养源，能促进它们的增殖，从而抑制肠道内腐败菌的生长，并减少有毒发酵产物的形成。双歧杆菌发酵棉籽糖产生大量的短链脂肪酸，能刺激肠道蠕动、增加粪便润湿度并保持一定的渗透压，从而防止便秘的产生。此外，棉籽糖能改善人体的消化功能，促进人体对钙的吸收，从而增强人体免疫力，对预防疾病和抗衰老具有明显效果。棉籽糖还可作为人体和动物活器官移植用保护输送液的主要成分及延长活菌体在常温下存活期的增效剂。棉籽糖的耐热、耐酸性好，在90%的相对湿度下也不会吸湿结块，其本身可作为食品添加剂使用，改善食品的加工特性，防止产品褐变，提高产品质量，延长产品的保 质期。棉籽糖因具有优良的理化性能和生理活性，目前已被广泛应用于食品、医药及化妆品等行业。棉籽糖在自然界的分布很广，是除蔗糖外在植物中的分布最广的低聚糖，它广泛存在于甜菜、棉籽、蜂蜜、卷心菜、酵母、马铃薯、葡萄、麦类、玉米以及豆科植物的种子中，其中在棉籽中的含量最高，约为4 9%。棉籽仁在被提取棉籽油后产生大量的副产品——脱脂棉籽柏，脱脂棉籽柏中棉籽糖的含量基本保持不变，因此，脱脂棉籽柏饼是工业上生产棉籽糖的极佳原料。脱脂棉籽柏中的成分包括棉籽糖、蛋白、盐分、棉酚色素以及其他的单糖或蔗糖等。通常，从脱脂棉籽柏制备棉籽糖，是先通过溶剂提取，从脱脂棉籽柏中得到棉籽糖提取液，再通过对棉籽糖提取液脱棉酚色素、脱蛋白、脱盐以及除去单糖或蔗糖等杂质进行提纯，最后通过结晶或沉淀获得最终产品。由于棉籽糖提取液经脱色处理后，体系中除了棉籽糖之外，还存在以蛋白、盐分等为主的杂质，这些杂质的存在会严重影响棉籽糖结晶产品的纯度，很难获得98%含量以上的棉籽糖，因此需要进一步处理脱除。现有技术中，棉籽糖提取液脱蛋白主要采用超滤膜分离，如王兴国等人(膜分离技术在棉籽糖糖液纯化中的应用，粮油加工与食品机械，2005，6，50-53)报道了一种应用无机陶瓷膜对棉籽糖提取液中的蛋白质等大分子物质进行有效脱除的方法，棉籽蛋白的脱除率达到87. 4%，同时棉籽糖的含量基本保持不变。梁立新等人(棉籽双液相萃取工艺甲醇相中棉籽糖提取液的脱色，食品与发酵工业，2007，4，73-76)报道了一种棉籽糖提取液的脱蛋白的方法，该方法通过醋酸铅使蛋白变性，再采用超滤膜完成脱蛋白的处理。其中，醋酸铅的使用会带来重金属残留，且膜容易污染、不易清洗，再生膜通量下降严重，所以这种方法有一定局限性。尽管超滤和蛋白变性等方法可有效去除棉籽糖中的棉籽蛋白，然而超滤法存在分离膜易污染、膜组件易污染导致膜通量严重下降且使用寿命短的问题，醋酸铅的使用会带来重金属残留等问题。中国专利ZL200810121281.0中公开了一种提高棉籽糖纯度的方法，采用固定床式吸附分离的方法，通过单次吸附分离，实现棉籽糖与盐分、蛋白、单糖和蔗糖等杂质的分离，使得棉籽糖在干基中的质量百分含量由30 50%提高至90%以上，同时，棉籽糖的损失率不超过3%。该方法具有工艺流程简单、吸附剂再生方便、生产成本低、分离周期短，易于工业化生产等优点。该方法属于吸附分离方法，是基于吸附剂对棉籽糖和不同杂质吸附作用力的差异，选择性吸附棉籽糖而实现提纯之目的，具体操作时在上样吸附直至吸附饱和需对吸附剂进行再生处理，如想实现吸附剂的重复利用也需对吸附剂进行再生处理。因此，建立一种快速、简单、高效的棉籽糖分离纯化工艺具有重要的工业应用前
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发明内容
为克服现有超滤膜法及重金属盐使蛋白变性脱除蛋白等方法的缺陷，本发明提供了一种环境友好、工艺简单、高效分离棉籽糖的方法，该方法利用凝胶填料对不同分子量溶质的排阻功能实现棉籽糖与棉籽蛋白等大分子杂质的高效分离。为了实现本发明的目的采用以下技术方案一种棉籽糖的分离纯化方法，包括以下步骤I)以凝胶为填料，湿法装填凝胶色谱柱；2)以棉籽糖浓缩液配制原料液，上样于所述的凝胶色谱柱；3)以去离子水或乙醇水溶液为洗脱液进行洗脱，收集含有棉籽糖的洗脱液，经旋转蒸发后得到纯化的棉籽糖；所述的棉籽糖浓缩液由脱脂棉籽柏经水或醇的水溶液提取得到的棉籽糖提取液再经活性炭脱色浓缩后得到；可采用现有方法得到(如可采用中国专利ZL200810121281. O中从脱脂棉籽柏制备脱色液的方法制备脱色液，再经浓缩得到所述的棉籽糖浓缩液)或者采用市售产品。如可选用由脱脂棉籽柏用水或醇的水溶液渗滤提取得到棉籽糖提取液，再对棉籽糖提取液用活性炭脱色除去棉酚色素，然后对棉籽糖脱色液进一步浓缩得到的棉籽糖浓缩液。 所述的凝胶选用本领域常规凝胶；优选排阻分子量范围为500 30000的凝胶，该类填料排阻分子量大小远小于蛋白等大分子杂质的分子量，而接近棉籽糖的分子量，蛋白等大分子杂质因为分子量太大不能进入凝胶孔道内而被排阻，棉籽糖分子较小并进入孔道与凝胶亲水基团之间相互作用使获得一定的保留，而原料液中无机盐及单糖等更小分子则在孔道内的扩散传质的途径最长而最晚被洗脱，依据上述原理使得棉籽糖与棉籽蛋白等杂质的分离度得到提高，有效去除棉籽糖浓缩液中的蛋白，同时还能除去无机盐和单糖等杂质，显著提高了棉籽糖的纯度。为了达到更好的纯化分离效果，所述的凝胶进一步优选为SephadexG-10、Sephadex G-25、 Sephadex G-50、 Sephadex G-75、 Sephadex G-100、 Sephadex LH-20(Sephadex LH-20是Sephadex G_25系列衍生物)等葡聚糖G系列凝胶中的一种，或者Toyopearl HW-40C、Toyopearl HW-40F等聚丙烯酸酯凝胶中的一种。为有效提高凝胶色谱柱的处理量和处理效率，所述的原料液中固形物浓度优选为200mg/mL 800mg/mL。若原料液中固形物的浓度过高,尽管提高了单位填料的处理能力，但此时棉籽糖与棉籽蛋白的分离度显著下降，使得棉籽糖纯度和回收率大幅度下降；若原料液中固形物浓度过低，则原料处理量小，溶剂损耗大、工艺经济性差，不具有好的工业应用价值。色谱分离时，综合考虑产品纯度、溶剂消耗、单位填料的处理能力等生产成本因素,步骤2)中，上样体积为色谱柱床层体积(BV)的2°/Γ Ο%。由于上样体积相对色谱柱床层体积较小，在色谱理论中，一般认为上样温度对分离没有太大的影响； 当料液浓度很高时，因为料液黏度较大，为方便上样可适当加温。步骤3)中，所述的乙醇水溶液为体积分数小于等于40%的乙醇水溶液，优选体积分数为20%的乙醇水溶液。步骤3)中，洗脱条件优选为洗脱温度为5°C 60°C，温度低于5°C时，传质速率慢、分离效率低；温度高于60°C时，凝胶色谱填料稳定性变差，导致分离效率下降，工艺重复性差；此外，温度过高，色谱分离选择性和分离度均变差。所述的洗脱液的流速优选为O. 5BV/h 3BV/h。其中BV为床层体积，指凝胶色谱柱中凝胶填料的床层体积，流速过慢，分离度虽好，但样品处理效率低；流速过快，则床层压降太高，由于凝胶机械强度较低，其三维孔易被破坏。洗脱液的用量没有严格的限定，一般将色谱柱洗脱干净即可。本发明含有棉籽糖的洗脱液根据棉籽糖流出曲线确定洗脱液收集起点和终点。本发明湿法装填的方法采用本领域现有的湿法装填方法，一般包括清洗色谱柱，测定色谱柱的内径和高度，计算所需填料的体积，根据所选填料的膨胀体积，计算所需干填料的质量；称取相应质量的干填料，采用洗脱液充分溶胀后用真空干燥器抽尽填料中空气，并将填料上面过多的溶液倾出，得到薄浆状的填料液；关闭色谱柱出水口，向色谱柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液，边搅拌，边将薄浆状的填料液连续倾入柱中，使其自然沉降，等填料沉降约2-3cm后，打开色谱柱的出口，调节流速，使填料继续沉积，待沉积的填料面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口，通过2-3倍床层体积的洗脱液(流速
O.5mL/min lmL/min)使柱床稳定。本发明采用高效液相色谱(HPLC)法对棉籽糖的浓度进行定量分析，HPLC具体分析条件为=Waters NH2柱(4· 6X250mm，粒径5 μ m)，柱温35°C，流动相为乙腈水=75 25(v:v),流速I. Oml/min,检测器为示差检测器,检测器温度为35°C。固形物浓度取一定体积的溶液通过旋转蒸发除去溶剂后，对残留固体进行称重，残留固体的质量与所取溶液体积之比即为固形物浓度。本发明中的回收率和纯度的计算方法如下回收率=洗脱液中棉籽糖的质量/原料液中的棉籽糖的质量X 100% ；纯度=洗脱液中的棉籽糖的质量/洗脱液中固形物的总质量。与现有技术相比，本发明具备以下优点(I)本发明采用凝胶色谱法从棉籽糖浓缩液中分离棉籽糖，该方法对分子量差别较大的棉籽糖与棉籽蛋白、盐分和单糖等具有较高的选择性分离能力，经本发明分离方法获得的棉籽糖纯度>90%，收率高于85%。(2)本发明采用的凝胶色谱柱机械强度较高，稳定性好，可重复利用，使用寿命长。(3)本发明采用的分离过程属于凝胶排阻色谱分离方法，是利用凝胶孔道对不同分子尺寸的棉籽糖和杂质的筛分功能实现提纯目的。此外，操作过程中无需再生步骤。(4)本发明方法操作简单，所用洗脱液为纯水或乙醇水溶液等环境友好溶剂，成本低，分离效率高，适合于工业化生产。
具体实施例方式实施例I脱脂棉籽柏用体积分数为75%的乙醇水溶液渗滤提取得到棉籽糖提取液，通过活性炭脱色方法对棉籽糖提取液中的棉酚等色素进行脱除，脱色液再进一步浓缩，得到棉籽糖浓缩液。棉籽糖浓缩液加水配成固形物浓度为200mg/mL的原料液，以S印hadex G-IO(葡聚糖凝胶，排阻分子量700)为填料，经体积分数为20%的乙醇水溶液充分溶胀后，采用湿法装柱法装填凝胶色谱柱，色谱柱尺寸为Φ I. 6cmX33cm,色谱柱体积(BV)为66. 3ml。取原料液O. 02BV,上样于所装填的凝胶色谱柱，上样完成后在40°C下，用体积分数为20%的乙醇水溶液以lBV/h的洗脱流速流经凝胶色谱柱。棉籽蛋白最先洗脱，棉籽糖随后被洗脱，少量盐 分等低分子量杂质的保留最长，收集含棉籽糖的洗脱液馏分，经旋转蒸发得到棉籽糖粗品，通过HPLC分析，计算所得粗品中棉籽糖的含量为91. 2%，回收率为85. 3%。实施例2脱脂棉籽柏用体积分数为75%的乙醇水溶液渗滤提取得到棉籽糖提取液，通过活性炭脱色方法对棉籽糖提取液中的棉酚等色素进行脱除，脱色液再进一步浓缩，得到棉籽糖浓缩液。棉籽糖浓缩液加水配成固形物浓度为500mg/mL的原料液，以S印hadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶，排阻分子量4000-5000)为填料，经体积分数为30%的乙醇水溶液充分溶胀后，采用湿法装柱法装填凝胶色谱柱，色谱柱尺寸为01.6CmX33Cm，色谱柱体积(BV)为66. 3ml。取原料液O. 1BV，上样于所装填的凝胶色谱柱，上样完成后用体积分数为30%的乙醇水溶液以O. 5BV/h的洗脱流速流经凝胶色谱柱，温度控制在20°C，洗脱液用量为3BV。棉籽蛋白最先洗脱，棉籽糖随后被洗脱，少量盐分等等低分子量杂质的保留时间最长，收集含棉籽糖的洗脱液馏分，经旋转蒸发得到棉籽糖粗品，通过HPLC分析，计算得到粗品中棉籽糖的含量为94. 1%，回收率为89. 2%。实施例3脱脂棉籽柏用体积分数为75%的乙醇水溶液渗滤提取得到棉籽糖提取液，通过活性炭脱色方法对棉籽糖提取液中的棉酚等色素进行脱除，脱色液再进一步浓缩，得到棉籽糖浓缩液。棉籽糖浓缩液加水配成固形物浓度为800mg/ml的原料液，以S印hadex G_50(葡聚糖凝胶，排阻分子量范围为1000 5000)为填料，经体积分数为30%的乙醇水溶液充分溶胀后，采用湿法装柱法装填凝胶色谱柱，色谱柱尺寸为01.6CmX33Cm，色谱柱体积(BV)为66. 3ml。取原料液O. 05BV，上样于所装填的凝胶色谱柱，上样完成后在40°C下，用体积分数30%乙醇的水溶液以I. 5BV/h的洗脱流速流经凝胶色谱柱，洗脱剂用量为2BV。棉籽蛋白最先洗脱，棉籽糖随后被洗脱，少量盐分等等低分子量杂质的保留时间最长，收集含棉籽糖的洗脱液馏分，经旋转蒸发得到棉籽糖粗品，通过HPLC分析，计算得到粗品中棉籽糖的含量为93. 8%,回收率为89. 7%。实施例4脱脂棉籽柏用体积分数为75%的乙醇水液渗滤提取得到棉籽糖提取液，通过活性炭脱色方法对棉籽糖提取液中的棉酚等色素进行脱除，脱色液再进一步浓缩，得到棉籽糖浓缩液。棉籽糖浓缩液加水配成固形物浓度为300mg/ml的原料液，以S印hadex G-IOO(葡聚糖凝胶，排阻分子量范围为1500 30000)为填料，经体积分数为40%的乙醇水溶液充分溶胀后，采用湿法装柱法装填凝胶色谱柱，色谱柱尺寸为01.6CmX33Cm，色谱柱体积(BV)为66. 3ml。取原料液O. 1BV，上样于所装填的凝胶色谱柱，上样完成后在60°C下，用体积分数40%的乙醇水溶液以I. 5BV/h的洗脱流速流经凝胶色谱柱，洗脱剂用量为2BV。棉籽蛋白最先洗脱，棉籽糖随后被洗脱，少量盐分等等低分子量杂质的保留时间最长，收集含棉籽糖的洗脱液馏分，经旋转蒸发得到棉籽糖粗品，通过HPLC分析，计算得到粗品中棉籽糖的含量为92. 3%,回收率为85. 5%ο实施例5脱脂棉籽柏用体积分数为75%的乙醇水溶液渗滤提取得到棉籽糖提取液，通过活性炭脱色方法对棉籽糖提取液中的棉酚等色素进行脱除，脱色液再进一步浓缩，得到棉籽糖浓缩液。棉籽糖浓缩液加水配成固形物浓度为600mg/ml的原料液，以Toyopearl HW-40F(聚丙烯酸酯凝胶，排阻分子量范围为100 10000)为填料，经体积分数为40%的乙醇水 溶液充分溶胀后，采用湿法装柱法装填凝胶色谱柱，色谱柱尺寸为Φ1. 6cmX 33cm，色谱柱体积(BV)为66. 3ml。取原料液O. 02BV,上样于所装填的凝胶色谱柱，上样完成后在20°C下，用体积分数为40%的乙醇的水溶液以2BV/h的洗脱流速流经凝胶色谱柱，洗脱剂用量为
I.5BV。棉籽蛋白最先洗脱，棉籽糖随后被洗脱，少量盐分等等低分子量杂质的保留时间最长，收集含棉籽糖的洗脱液馏分，经旋转蒸发得到棉籽糖粗品，通过HPLC分析，计算得到粗品中棉籽糖的含量为94. 9%，回收率为86. 2%。实施例6脱脂棉籽柏用去离子水溶液渗滤提取得到棉籽糖提取液，通过常规的活性炭脱色方法对棉籽糖提取液中的棉酚等色素进行脱除，脱色液再进一步浓缩，得到棉籽糖浓缩液。棉籽糖浓缩液加水配成固形物浓度为200mg/mL的原料液，以葡聚糖凝胶S印hadex G-IO(葡聚糖凝胶，排阻分子量700)为填料，经去离子水溶液充分溶胀后，采用湿法装柱法装填凝胶色谱柱，色谱柱尺寸为Φ I. 6cmX 33cm，色谱柱体积(BV)为66. 3ml。取原料液O. 02BV上样于上述凝胶色谱柱，在40°C条件下，用去离子水溶液以lBV/h的洗脱流速流经凝胶色谱柱。棉籽蛋白最先洗脱，棉籽糖随后被洗脱，少量盐分等低分子量杂质的保留最长，收集含棉籽糖的洗脱液馏分，经旋转蒸发得到棉籽糖粗品，通过HPLC分析，计算所得粗品中棉籽糖的含量为81. 2%,回收率为84. 7%。实施例7脱脂棉籽柏用去离子水溶液渗滤提取得到棉籽糖提取液，通过常规的活性炭脱色方法对棉籽糖提取液中的棉酚等色素进行脱除，脱色液再进一步浓缩，得到棉籽糖浓缩液。棉籽糖浓缩液加水配成固形物浓度为300mg/mL的原料液，以Toyopearl HW-40C(聚丙烯酸酯凝胶，排阻分子量范围为IO2 IO4)为填料，经去离子水溶液充分溶胀后，采用湿法装柱法装填凝胶色谱柱，色谱柱尺寸为Φ1. 6cmX 33cm，色谱柱体积(BV)为66. 3ml。取原料液O. 05BV上样于上述凝胶色谱柱，在40°C条件下，用去离子水溶液以O. 5BV/h的洗脱流速流经凝胶色谱柱。棉籽蛋白最先洗脱，棉籽糖随后被洗脱，少量盐分等低分子量杂质的保留最长，收集含棉籽糖的洗脱液馏分，经旋转蒸发得到棉籽糖粗品，通过HPLC分析，计算所得粗品中棉籽糖的含量为85. 4%，回收率 为85. 6%。
权利要求
1.一种棉籽糖的分离纯化方法，包括以下步骤 1)以凝胶为填料，湿法装填凝胶色谱柱； 2)以棉籽糖浓缩液配制原料液，上样于所述的凝胶色谱柱； 3)以去离子水或乙醇水溶液为洗脱液进行洗脱，收集含有棉籽糖的洗脱液，经旋转蒸发后得到纯化的棉籽糖； 所述的棉籽糖浓缩液由脱脂棉籽柏经水或醇的水溶液提取得到的棉籽糖提取液再经活性炭脱色浓缩后得到。
2.根据权利要求I所述的棉籽糖的分离纯化方法，其特征在于，所述的凝胶的排阻分子量范围为500 30000。
3.根据权利要求I或2所述的棉籽糖的分离纯化方法，其特征在于，所述的凝胶为葡聚糖G系列凝胶、聚丙烯酸酯凝胶中的一种。
4.根据权利要求3所述的棉籽糖的分离纯化方法，其特征在于，所述的凝胶为Sephadex G-IO> Sephadex G-25、 Sephadex G-50、 Sephadex G-75、 Sephadex G-100、Sephadex LH-20> Toyopearl HW-40C 或 ToyopearlHW-40F。
5.根据权利要求I所述的棉籽糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中，所述的原料液中固形物浓度为200mg/mL 800mg/mL。
6.根据权利要求I所述的棉籽糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中，上样体积为凝胶色谱柱床层体积的2% 10%。
7.根据权利要求I所述的棉籽糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤3)中，所述的乙醇水溶液为体积分数小于等于40%的乙醇水溶液。
8.根据权利要求I所述的棉籽糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤3)中，洗脱条件为洗脱温度为5°C 60°C，洗脱液流速为O. 5BV/h 3BV/h。
9.根据权利要求8所述的棉籽糖的分离纯化方法，其特征在于，步骤3)中，洗脱条件为洗脱温度为20°C 60°C，洗脱液流速为O. 5BV/h 2BV/h。
全文摘要
本发明公开了一种棉籽糖的分离纯化方法，包括1)以凝胶为填料，湿法装填凝胶色谱柱；2)以棉籽糖浓缩液配制原料液，上样于所述的凝胶色谱柱；3)以去离子水或乙醇水溶液为洗脱液进行洗脱，收集含有棉籽糖的洗脱液，经旋转蒸发后得到纯化的棉籽糖；所述的棉籽糖浓缩液由脱脂棉籽粕经水或醇的水溶液提取得到的棉籽糖提取液再经活性炭脱色浓缩后得到。本发明方法通过凝胶色谱法分离棉籽糖与蛋白等，工艺流程简单，操作简便，分离效率高，填料可重复利用，具有广阔的工业化应用前景。
文档编号C07H1/06GK102875607SQ20121037170
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者鲍宗必, 刘聪, 邢华斌, 苏宝根, 任其龙, 杨亦文, 杨启炜 申请人:浙江大学