专利名称：一种刺叶石竹苷a的提取分离方法
技术领域：
本发明属于天然产物分离领域，尤其涉及一种刺叶石竹苷A的提取分离方法。
背景技术：
刺叶石竹苷A (Squarroside A)三萜皂苷类，分子式为C71HlltlO36,分子量1539. 63。刺叶石竹苷A在体外淋巴细胞变异试验中显示与浓度有关的免疫调节作用，在高浓度(10 μ g/ml)下显示免疫抑制作用，在低剂量(10pg/ml)时显示免疫刺激作用。刺叶石竹苷A主要来源于石竹科(Caryophyllaceae)刺叶石竹squarrosum Boiss.的根。目前，国内尚未见刺叶石竹苷A的工业提取纯化方法的相关文献和专利的报道。
高速逆流色谱法(High-speedCountercurrent Chromatography,简称HSCCC),是一种新型的、连续高效的液液分配色谱技术，与其它色谱技术不同的是它不需任何固态载体，因此能避免固相载体表面与样品发生反应而导致样品的污染、失活、变性和不可逆吸附等不良影响。同时它也具有适用范围广、快速、进样量大、费用低、回收率高等优点。因此，在生物、医药、食品、材料、化妆品和环保等领域获得了广泛的应用，尤其是在天然产物活性成分的分离纯化领域。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种刺叶石竹苷A的提取分离方法，该方法操作
简单，产品含量高。本发明是采用以下技术方案来实现的
(O取刺叶石竹根粉碎至粗粉，加水浸润，加入组合酶35-48°C温度下进行酶解2-6h，得酶解原料；
(2)酶解原料中加8-15倍量60-75%的乙醇溶液微波提取1_3次，每次20_50min，过滤得到提取液；
(3)提取液浓缩至浸膏，加适量水分散后，上大孔树脂进行吸附，50-70%乙醇溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥得到粗品；
(4)以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水(5-7:2-4:3-4:3_5)作为两相溶剂系统，混匀后置分液漏斗中静置分层，取上相为固定相，下相为流动相，将粗品用下相溶解，注入高速逆流色谱仪，收集高含量刺叶石竹苷A流分，浓缩干燥即得刺叶石竹苷A产品。所述步骤(I)中组合酶为果胶酶、纤维素酶和淀粉酶中的两种或两种以上，用量为粗粉重量的0. 8-1. 5%。所述步骤(2)中微波功率为500-1000W。所述步骤(3)中大孔树脂可选AB-8、X_5、D101型中的一种。所述步骤(4)中高速逆流色谱仪转速750-950r/min,流动相流速I. 5-3. 0ml/min。
本发明的积极效果是1)采用组合酶解分解物质组织结构，提高了提取率，缩短了提取时间，而且采用微波提取提取杂质少，省时；
2)高速逆流色谱法分离无需使用载体，减少了操作过程中样品的损失，分离效果好，制备量大。下面将结合具体实施方式
进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施例。
具体实施例方式实施例I :
刺叶石竹根粉碎，过40目筛，称取3kg，加水浸润，加入15g果胶酶和30g淀粉酶，480C温度下进行酶解2h，酶解原料中加8倍量60%的乙醇溶液微波提取3次，每次50min，提取功率为500w，过滤得到提取液，浓缩至浸膏，加适量水分散后，上DlOl型大孔树脂进行吸附， 50%乙醇溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥得到粗品；以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水(5:2:3:3)作为两相溶剂系统，混匀后置分液漏斗中静置分层，取上相为固定相，下相为流动相，将粗品用下相溶解，再用上相泵满色谱柱，然后以2. Oml/min的流速泵入流动相，平衡后设定色谱仪转速为850r/min，通过进样阀进样，每次进样量为150mg，收集高含量刺叶石竹苷A流分，浓缩干燥即得刺叶石竹苷A,含量99. 3%。实施例2
刺叶石竹根粉碎，过60目筛,称取3kg,加水浸润,加14g果胶酶和IOg纤维素酶，450C温度下进行酶解2h，酶解原料中加12倍量65%的乙醇溶液微波提取2次，每次20min，提取功率为1000 ，过滤得到提取液，浓缩至浸膏，加适量水分散后，上X-5型大孔树脂进行吸附，60%乙醇溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥得到粗品；以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水(6:4:5:5)作为两相溶剂系统,混匀后置分液漏斗中静置分层，取上相为固定相，下相为流动相，将粗品用下相溶解，再用上相泵满色谱柱，然后以2. Oml/min的流速泵入流动相，平衡后设定色谱仪转速为750r/min，通过进样阀进样，每次进样量为150mg，收集高含量刺叶石竹苷A流分，浓缩干燥即得刺叶石竹苷A,含量98. 6%。实施例3:
刺叶石竹根粉碎，过20目筛，称取3kg，加水浸润，加入12g纤维素酶和12g淀粉酶，40°C温度下进行酶解3h，酶解原料中加10倍量60%的乙醇溶液微波提取2次，每次30min，提取功率为700w，过滤得到提取液，浓缩至浸膏，加适量水分散后，上AB-8型大孔树脂进行吸附，55%乙醇溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥得到粗品；以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水(7:4:3:5)作为两相溶剂系统,混匀后置分液漏斗中静置分层,取上相为固定相,下相为流动相，将粗品用下相溶解，再用上相泵满色谱柱，然后以2. Oml/min的流速泵入流动相，平衡后设定色谱仪转速为800r/min，通过进样阀进样，每次进样量为150mg，收集高含量刺叶石竹苷A流分，浓缩干燥即得刺叶石竹苷A,含量98. 9%。实施例4:
刺叶石竹根粉碎，过40目筛，称取10kg，加水浸润，加入40g果胶酶和40g淀粉酶，350C温度下进行酶解2h，酶解原料中加8倍量65%的乙醇溶液微波提取3次，每次20min，提取功率为500w，过滤得到提取液，浓缩至浸膏，加适量水分散后，上DlOl型大孔树脂进行吸附，60%乙醇溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥得到粗品；以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水(6:3:4:5)作为两相溶剂系统，混匀后置分液漏斗中静置分层，取上相为固定相，下相为流动相，将粗品用下相溶解，再用上相泵满色谱柱，然后以I. 5ml/min的流速泵入流动相，平衡后设定色谱仪转速为850r/min，通过进样阀进样，每次进样量为250mg，收集高含量刺叶石竹苷A流分，浓缩干燥即得刺叶石竹苷A,含量99. 5%。实施例5:
刺叶石竹根粉碎，过40目筛,称取20kg,加水浸润,加入60g果胶酶、60g纤维素酶和60g淀粉酶，48°C温度下进行酶解6h，酶解原料中加15倍量75%的乙醇溶液微波提取I次，每次50min，提取功率为1000 ，过滤得到提取液，浓缩至浸膏，加适量水分散后，上X_5型大孔树脂进行吸附，70%乙醇溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥得到粗品；以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水(7:4:4:5)作为两相溶剂系统，混匀后置分液漏斗中静置分层，取上相为固定相，下相为流动相，将粗品用下相溶解，再用上相泵满色谱柱，然后以3. Oml/min的流速泵入流动相，平衡后设定色谱仪转速为950r/min，通过进样阀进样，每次进样量为200mg，收集高含 量刺叶石竹苷A流分,浓缩干燥即得刺叶石竹苷A,含量98. 8%。
权利要求
1.一种刺叶石竹苷A的提取分离方法，其特征在于包含以下步骤 (O取刺叶石竹根粉碎至粗粉，加水浸润，加入组合酶35-48°C温度下进行酶解2-6h，得酶解原料； (2)酶解原料中加8-15倍量60-75%的乙醇溶液微波提取1_3次，每次20_50min，过滤得到提取液； (3)提取液浓缩至浸膏，加适量水分散后，上大孔树脂进行吸附，50-70%乙醇溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥得到粗品； (4)以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水(5-7:2-4:3-4:3_5)作为两相溶剂系统，混匀后置分液漏斗中静置分层，取上相为固定相，下相为流动相，将粗品用下相溶解，注入高速逆流色谱仪，收集高含量刺叶石竹苷A流分，浓缩干燥即得刺叶石竹苷A产品。
2.如权利要求I所述的刺叶石竹苷A的提取分离方法，其特征在于所述步骤(I)中组 合酶为果胶酶、纤维素酶和淀粉酶中的两种或两种以上，用量为粗粉重量的O. 8-1. 5%。
3.如权利要求I所述的刺叶石竹苷A的提取分离方法，其特征在于所述步骤(2)中微波功率为500-1000w。
4.如权利要求I所述的刺叶石竹苷A的提取分离方法，其特征在于所述步骤(3)中大孔树脂可选AB-8、X-5、D101型中的一种。
5.如权利要求I所述的刺叶石竹苷A的提取分离方法，其特征在于所述步骤(4)中高速逆流色谱仪转速750-950r/min,流动相流速I. 5-3. Oml/min。
全文摘要
本发明涉及一种刺叶石竹苷A的提取分离方法，方法是将刺叶石竹根粉碎，加水浸润，加入组合酶溶液进行酶解，酶解原料加8-15倍量60-75%的乙醇溶液微波提取1-3次，提取液浓缩回收乙醇，加适量水分散后，上大孔树脂进行吸附纯化，洗脱液浓缩干燥得到粗品，再采用高速逆流色谱法对粗品进行分离纯化，得到刺叶石竹苷A。本方法通过酶软化降解细胞壁，结合微波的选择性加热作用，充分破坏细胞壁，加速并增进活性成分的溶出，通过大孔树脂和高速逆流色谱对目标成分的分离纯化，制备出高含量的刺叶石竹苷A。本方法制备量大，样品损失少，产品含量高。
文档编号C07H15/256GK102827240SQ20121035031
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月20日 优先权日2012年9月20日
发明者苏刘花 申请人:南京泽朗农业发展有限公司