专利名称：缬酪肽片段及其制备方法和用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种缬酪肽截短后的片段，该多肽片段具有刺激分泌胰岛素的作用，本发明同时还提供了上述多肽片段的制备方法。
背景技术：
缬酪肽是ー种二十五肽，由二十五个氨基酸通过肽键连接而成，最初在猪小肠中分离而得，目前主要应用于治疗消化系统的肿瘤中。糖尿病是ー种血液中的葡萄糖容易堆积过多的疾病。国外给它的别名为“沉默的杀手” (Silent Killer)，特别是〃成人型糖尿病〃。四十岁以上的中年人染患率特别高，在日本，四十岁以上的人口中发病率占10%，即十人当中就有一位糖尿病患者，一旦患上〃糖 是促进胰岛素分泌的药物和直接补充胰岛素，但是这些药物要么效果不好要么会产生胰岛素抵抗性。所以寻找新的治疗糖尿病的药物一直在进行中。
发明内容
本发明提供了ー种多肽片段，经检测后发现其为缬酪肽的截断后的片段，由缬酪肽3 25位的氨基酸残基组成，其氨基酸序列如下YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY。本发明同时还提供了如上所述的多肽在生物医药上被认可的经化学修饰后的多肽。本发明提供了上述多肽的制备方法，包括以下步骤(I)、将猪肠道洗浄后浸入沸水中浸泡3 7分钟，浸泡完成后取出冷冻并剁碎，然后在O 10° C条件下用醋酸对肠道进行浸取后过滤得浸出液，用盐酸对浸出液中的浸出物洗脱并抽滤得耐热肠多肽；(2)、将耐热肠多肽溶解于水中，加入抗氧化剂及足量异丙醇溶液，室温下充分静置后离心除去沉淀，然后再加入足量温度为-25で -15 °C的异丙醇溶液并在-25°C _15°C条件下充分静置后抽滤去除沉淀，将所得滤液的PH值调节为5. 8 6. 1，再在-25で -15°C条件下充分静置后抽滤得白色沉淀，将白色沉淀充分洗涤后即制得粗肽；(3)、将步骤(2)中制得的粗肽溶解于醋酸溶液中制得肽溶液，将肽溶液过柱层析分离得到分离物，选取分离物中具有刺激胰腺分泌胰岛素功能的ー份，将其冻干即得粗提取物；(4)、将粗提取物溶解于碳酸氢铵溶液中并搅拌，离心后去除沉淀得上清液，将所得上清液过柱层析并采用PH值为8. O、浓度为O. 02mol/L的碳酸氢铵溶液进行洗涤，洗涤后得到的洗涤物冻干，再将洗涤物经过两次高效液相色谱分离后，将分离物冻干即制得权利要求I所述氨基酸序列的多肽。步骤(I)中醋酸的浓度为O. 5mol/L，盐酸的浓度为O. 2mol/L。步骤(2)中抗氧化剂为硫ニ甘醇，添加量为I. 2毫升；洗涤分两次进行，第一次洗涤选用异丙醇溶液，第二次洗涤选用こ醚溶液，第二次洗涤完成后将白色沉淀放入真空环境中使こ醚在真空中蒸发。所述步骤(4)中的两次高效液相色谱分离中，第一次分离所用洗提液为O. 1%的三氟こ酸水溶液，第二次分离所用洗提液为O. I %的三氟こ酸的こ腈溶液。本发明同时还提供了上述多肽及其药学上可接受的盐的用途，用于制造刺激胰腺分泌胰岛素的药物。本发明提供的多肽以及其在生物医药上被认可的经修饰后的多肽，能够有效的刺激胰腺细胞分泌胰岛素，与目前的治疗糖尿病药物中采用最多的高糖相比，本发明提供的多肽的效果更明显。
图I为本发明实施例I中的粗肽层析分离结果图；图2为本发明实施例I中第二次高效液相色谱分离结果图；图3为本发明提供的多肽的氨基酸序列图；图4为本发明提供的胰腺刺激试验的实验结果图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明。实施例I本实施例中采用以下制备步骤(I)、取30千克新鲜猪肠，将猪肠道洗浄后浸入沸水中浸泡4分钟，浸泡完成后取出冷冻并剁碎，然后在5° C条件下用O. 5mol/L的醋酸对肠道进行浸取后过滤得浸出液，然后用O. 2mol/L的盐酸对浸出液中的浸出物洗脱并抽滤得耐热肠多肽约30克，耐热肠多肽的产率约为猪肠湿重的O. 01%。(2)、将30克耐热肠多肽溶解于O. 24L水中，加入I. 2毫升抗氧化剂硫ニ甘醇及
I.08L异丙醇溶液，室温下静置2小时后离心除去沉淀，然后再加入I. 32L温度为_20°C的异丙醇溶液并在_20°C条件下静置24小时后抽滤去除沉淀，将所得滤液的PH值用盐酸调节为6，再在-20°C条件下充分静置后抽滤得白色沉淀，将白色沉淀分两次进行洗涤，第一次洗涤选用异丙醇溶液，第二次洗涤选用こ醚溶液，第二次洗涤完成后将白色沉淀放入真空环境中使こ醚在真空中蒸发即制得粗肽6. 5克。(3)、将步骤(2)中制得的粗肽6. 5克溶解于300mL0. 2mol/L的醋酸溶液中制得肽溶液，将肽溶液过柱层析分离得到分离物，选取分离物中具有刺激胰腺分泌胰岛素功能的ー份，将其冻干即得粗提取物，如图I所示，选取图I中所标记的ー份为目标物。(4)、将粗提取物溶解于81. 5mL0. 01mol/L的碳酸氢铵溶液中并搅拌20分钟，离心后去除沉淀得上清液，将所得上清液过柱层析并采用PH值为8. O、浓度为O. 02mol/L的碳酸氢铵溶液进行洗涤，洗涤后得到的洗涤物冻干，再将洗涤物经过两次高效液相色谱分离后，所述的两次高效液相色谱分离中，第一次分离所用洗提液为O. 1%的三氟こ酸水溶液；第二次分离所用洗提液为O. 1%的三氟こ酸的こ腈溶液，将第二次分离后所得沉淀收集并冻干即制得权利要求I所述氨基酸序列的多肽，如图2所示，目标物即为本发明所提供的多肽。对上述步骤中制的多肽经SDS-PAGE胶纯化。进行氨基酸测序用Edman降解法做肽序列分析。Applied Biosystems 477A仪器偶联120 Aanalyzer、Milligen 6600> Waters 440分析仪,进行氨基酸序列分析。测序结果如图3所示
多肽IYPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY 23与缬酪肽其序列为VQ YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY只有两个氨基酸的差异。由此可知，本发明中的多肽为缬酪肽第3至第25氨基酸残基所组成的多肽片段。对本发明中制得的多肽性能进行研究，测试在离体大鼠胰岛灌流系统进行葡萄糖诱导的胰岛素分泌的影响。雄性SD大鼠(体重200 250克)，经麻醉后取出胰腺，然后用胶原酶消化。上述胰腺在37°C下用RPMI 1640培养基培养过夜，所述的培养基中第一组添加有3. 3mM的葡萄糖，第二组中添加有16. 7mM的葡萄糖，第三组中添加有16. 7mM的葡萄糖和IOnM的缬酪肽3-25。用放射免疫分析法来确定三个胰腺所释放的胰岛素量。測定结果如图4所示，由此可见缬酪肽3-25具有明显的促胰岛素分泌的作用。实施例2本实施例中采用以下制备步骤(I)、取20千克新鲜猪肠，将猪肠道洗浄后浸入沸水中浸泡6分钟，浸泡完成后取出冷冻并剁碎，然后在8° C条件下用O. 5mol/L的醋酸对肠道进行浸取后过滤得浸出液，然后用O. 2mol/L的盐酸对浸出液中的浸出物洗脱并抽滤得耐热肠多肽约19克，耐热肠多肽的产率约为猪肠湿重的O. 01%。(2)、将19克耐热肠多肽溶解于O. 15L水中，加入I毫升抗氧化剂硫ニ甘醇及O. 7L异丙醇溶液，室温下静置2小时后离心除去沉淀，然后再加入O. 89L温度为_23°C的异丙醇溶液并在_20°C条件下静置24小时后抽滤去除沉淀，将所得滤液的PH值用盐酸调节为6，再在-18°C条件下充分静置后抽滤得白色沉淀，将白色沉淀分两次进行洗涤，第一次洗涤选用异丙醇溶液，第二次洗涤选用こ醚溶液，第二次洗涤完成后将白色沉淀放入真空环境中使こ醚在真空中蒸发即制得粗肽4. 3克。(3)、将步骤(2)中制得的粗肽4. 3克溶解于200mL0. 2mol/L的醋酸溶液中制得肽溶液，将肽溶液过柱层析分离得到分离物，选取分离物中具有刺激胰腺分泌胰岛素功能的ー份，将其冻干即得粗提取物。(4)、将粗提取物溶解于54mL0. 01mol/L的碳酸氢铵溶液中并搅拌20分钟，离心后去除沉淀得上清液，将所得上清液过柱层析并采用PH值为8. O、浓度为O. 02mol/L的碳酸氢铵溶液进行洗涤，洗涤后得到的洗涤物冻干，再将洗涤物经过两次高效液相色谱分离后，所述的两次高效液相色谱分离中，第一次分离所用洗提液为O. 1%的三氟こ酸水溶液；第二次分离所用洗提液为O. 1%的三氟こ酸的こ腈溶液，将第二次分离后所得沉淀收集并冻干即制得权利要求I所述氨基酸序列的多肽。对上述步骤中制的多肽经SDS-PAGE胶纯化。采用Edman降解法做肽序列分析。分析仪器为Applied Biosystems 477A仪器偶联120 A analyzer、Milligen 6600> Waters 440分析仪,进行氨基酸序列分析。测序结果如图3所示
多肽IYPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY 23与缬酪肽其序列为VQ YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY只 有两个氨基酸的差异。由此可知，本发明中的多肽为缬酪肽第3至第25氨基酸残基所组成的多肽片段。对本实施例中制得的多肽的性能进行研究，其结果与实施例I相同。
权利要求
1.一种多肽，其氨基酸序列如下YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY。
2.如权利要求I所述的多肽在生物医药上被认可的经修饰的多肽，其氨基酸序列如下YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY。
3.如权利要求I所述的多肽的制备方法，其特征在于采用以下步骤 (1)、将猪肠道洗浄后浸入沸水中浸泡3 7分钟，浸泡完成后取出冷冻并剁碎，然后在O 10° C条件下用醋酸对肠道进行浸取后过滤得浸出液，用盐酸对浸出液中的浸出物洗脱并抽滤得耐热肠多肽； (2)、将耐热肠多肽溶解于水中，加入抗氧化剂及足量异丙醇溶液，室温下充分静置后离心除去沉淀，然后再加入足量温度为_25°C _15°C的异丙醇溶液并在-25°C _15°C条件下充分静置后抽滤去除沉淀，将所得滤液的PH值调节为5. 8 6. 1，再在-25°C _15°C条件下充分静置后抽滤得白色沉淀，将白色沉淀充分洗涤后即制得粗肽； (3)、将步骤(2)中制得的粗肽溶解于醋酸溶液中制得肽溶液，将肽溶液过柱层析分离得到分离物，选取分离物中具有刺激胰腺分泌胰岛素功能的ー份，将其冻干即得粗提取物； (4)、将粗提取物溶解于碳酸氢铵溶液中并搅拌，离心后去除沉淀得上清液，将所得上清液过柱层析并采用PH值为8. O、浓度为O. 02mol/L的碳酸氢铵溶液进行洗涤，洗涤后得到的洗涤物冻干，再将洗涤物经过两次高效液相色谱分离后，将分离物冻干即制得权利要求I所述氨基酸序列的多肽。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤(I)中醋酸的浓度为0.5mol/L，盐酸的浓度为O. 2mol/L。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中抗氧化剂为硫ニ甘醇，添加量为I. 2毫升；洗涤分两次进行，第一次洗涤选用异丙醇溶液，第二次洗涤选用こ醚溶液，第二次洗涤完成后将白色沉淀放入真空环境中使こ醚在真空中蒸发。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中的两次高效液相色谱分离中，第一次分离所用洗提液为O. I %的三氟こ酸水溶液,第二次分离所用洗提液为O.I %的三氟こ酸的こ腈溶液。
7.权利要求I所述多肽的用途，其特征在于用于制造刺激胰腺分泌胰岛素的药物。
8.权利要求2所述多肽在生物医药上被认可的经修饰的多肽的用途，其特征在于用于制造刺激胰腺分泌胰岛素的药物。
全文摘要
本发明提供了一种多肽及其制备方法和用途，该多肽为缬酪肽截断后的片段，由其第3～25位的氨基酸残基组成，其氨基酸序列如下YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY。本发明提供的多肽的制备方法如下首先将耐热肠多肽从猪肠道中提取出，然后从耐热肠多肽中提取中粗肽，将粗肽溶于醋酸溶液中制得肽溶液，将肽溶液过柱层析分离得到分离物，选取分离物中具有刺激胰腺分泌胰岛素功能的一份，将其冻干即得粗提取物，将粗提取物进行提纯后即可制得上述多肽。本发明中还提供了上述多肽及其药学上可接受的盐的用途，用于制造刺激胰腺分泌胰岛素的药物。
文档编号C07K1/16GK102838669SQ20121027181
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月1日 优先权日2012年8月1日
发明者李臣鸿, 汪俊汉, 陈正望 申请人:中南民族大学