制备补骨脂素和异补骨脂素或包含它们的提取物的方法

专利名称：制备补骨脂素和异补骨脂素或包含它们的提取物的方法
技术领域：
本发明涉及中药提取分离技术领域，具体涉及补骨脂中有效成分补骨脂素和异补骨脂素或者包含它们的提取物的分离制备方法。
背景技术：
补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实，首见于《开宝本草》，分布于山西、陕西、安徽等 地，具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻的功效。现代化学研究表明补骨脂主要含有糖苷、香豆素、黄酮、单萜酚类成分，具有抑菌、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫等活性。目前，补骨脂的开发利用受到了药学工作者的重视，补骨脂滴鼻液、补骨脂滴丸、用于治疗白癜风的复方补骨脂酊等均有报道。临床上含补骨脂的中成药应用也相当普遍，如四神丸、生发酊、白癜风胶囊、壮骨关节丸、青蛾丸等。补骨脂素和异补骨脂素是补骨脂药材中的主要活性成分，《中华人民共和国药典》2010年版一部对补骨脂素和异补骨脂素的总量限度作出明确规定，补骨脂药材中补骨脂素和异补骨脂素的总量不得少于O. 70%。补骨脂素与异补骨脂素具有多种药理活性。研究表明，补骨脂素和异补骨脂素能明显提高酪氨酸酶的活性，促进皮肤黑色素合成，能够治疗白癜风等疾病；补骨脂素、异补骨脂素还具有雌激素样活性。另外，补骨脂素还可使血清肌酐浓度明显降低，肾小球滤过率增加，从而加快以肾脏排泄为主要清除途径的药物在体内的清除过程。补骨脂还具有抗癌活性，实验表明补骨脂素对KB细胞、Hela细胞、小鼠肉瘤、艾氏腹水癌等均有抑制作用。临床应用及现代药理研究结果都表明补骨脂有防治骨质疏松的作用，能够促进骨再生和重建。有报道补骨脂素有望成为治疗前列腺增生的比较理想的药物之一。已有报道，补骨脂素对化疗药物耐药的急性白血病(AL)患者有明确增敏作用。补骨脂素对多种细菌有抑制和杀灭作用，在加黑光和长波紫外线照射下，抗菌谱更广；平碟培养法实验证实补骨脂素及异补骨脂素对某些细菌加小孢子菌、石膏样小孢子菌、红色毛癣菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、乙型链球菌、大肠杆菌、绿脓球菌等均有较好的抵抗作用。如何快速大量的制备补骨脂素与异补骨脂素是工业生产中密切关注的问题。目前关于补骨脂素和异补骨脂素的制备方法有乙醇等有机溶剂提取法、超临界C02萃取法、超声法、高速逆流色谱法等。例如，乙醇等有机溶剂提取法是比较传统的提取方法，将补骨脂药材经醇提取三次，合并提取液，减压浓缩回收乙醇，得到浸膏，加适量水溶解分散，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩回收溶剂后得到各部分萃取物，利用硅胶柱、凝胶柱等柱层析技术对各部分萃取物进行分离，最后得到补骨脂素和异补骨脂素的单体。然而此法存在着有效成分损失大，周期长、工序多，提取效率不闻，广品提取不纯等缺点。黄芳等在《超临界C02流体从补骨脂中提取分离补骨脂素、异补骨脂素及脂肪油的工艺研究》中介绍了制备补骨脂素和异补骨脂素的超临界C02萃取方法。将适量已粉碎的补骨脂生药投人萃取釜，按预定温度、压力萃取，萃取时间为3小时。将萃取所得的油状物静置后析出结晶物，抽滤后得到补骨脂脂肪油和补骨脂素晶体，用石油醚洗涤结晶得到补骨脂素。油层继续加适量石油醚-乙醚(1:3)析晶得到异补骨脂素粗品。此法与传统工艺相比，在得到补骨脂素晶体的同时也获得异补骨脂素粗品，工艺简单，周期短，但是粉碎药材所需时间长，得到纯品量有限。本领域需要有能够快速和/或大量地制备补骨脂素和异补骨脂素或者包含它们的提取物的方法。

发明内容
本发明的目的是克服现有制备补骨脂素和异补骨脂素或者包含它们的提取物技术中存在的不足，提供一种能够快速和/或大量地制备补骨脂素和异补骨脂素或者包含它们的提取物的方法。本发明令人意外地发现，利用补骨脂大量存在的补骨脂素和异补骨脂
素的糖苷，即补骨脂苷、异补骨脂苷，通过酸水解反应得到补骨脂素和异补骨脂素粗品，经简单处理后得到大量补骨脂素和异补骨脂素纯品。本发明基于以上发现而得以完成。为此，本发明第一方面提供了一种制备补骨脂素和异补骨脂素或者包含它们的提取物的方法，其包括以下步骤i)使补骨脂药材用水回流提取，将合并提取液浓缩，得到浓缩液；ii)向所得浓缩液中加入酸，加热水解；iii)使水解液在大孔吸附树脂柱上用水洗脱除去杂质，然后用浓度大于50%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩或者任选地进一步干燥，得到含有补骨脂素和异补骨脂素的提取物；iv)任选地，使步骤iii)所得提取物在硅胶柱上用有机溶剂进行洗脱，收集补骨脂素流分和异补骨脂素流分，除去溶剂，分别得到补骨脂素和异补骨脂素。根据本发明的方法，其中步骤i)中提取1-4次，优选1-3次，优选2次。根据本发明的方法，其中步骤i)中每次提取O. 5-5小时，优选1-3小时，优选1-2小时，优选约I. 5小时。根据本发明的方法，其中步骤i)中每次提取所用的水量为药材重量的5-15倍，优选5-12倍，优选5-10倍。例如可以在第一次提取中使用约6-10倍量的水，在此后的各次提取中(如果进行提取)使用约5-8倍量的水。根据本发明的方法，其中步骤i)中的浓缩是将合并提取液浓缩至与药材重量1:1 ;根据本发明的方法，其中步骤ii)中所述酸是盐酸、硫酸、硝酸或磷酸，优选盐酸。在一个实施方案中，所述酸的加入量是使酸的浓度(以氢离子计)为O. 5 3mol/L，优选l 2mol/L,优选约I. 5mol/Lo例如可以使用3mol/L盐酸水溶液进行水解,使该3mol/L盐酸与浓缩液的体积比为1:1，由此使待水解的混合液中酸的浓度(以氢离子计)为O. 5^3mol/L0根据本发明的方法，其中步骤ii)中加热水解是在9(T10(TC的温度下水解，优选是在95 10(TC的温度下水解。水解的时间是可以根据具体条件而作适当调整的，这些具体条件例如但不限于酸的类型、酸的浓度、水解温度等。一般而言，水解的时间可以是1(Γ100分钟，优选15 60分钟，优选15 45分钟，优选约30分钟。
根据本发明的方法，其中步骤iii)中，所述的大孔吸附树脂选自D101型、AB-8、NKA、XDA-5、HP-10、LSI-004、CAD40、LSA-40。根据本发明的方法，在步骤iii)中，所述的乙醇水溶液的乙醇浓度为509Γ无水乙醇，优选6(Γ无水乙醇，优选75、8%，优选85、8%，优选9(Γ无水乙醇，优选约95%。根据本发明的方法，在步骤iii)中，每种洗脱液的用量是本领域技术人员根据已有知识和经验而可以容易地确定。在一个实施方案中，水洗脱是使用5 30倍柱体积的水进行洗脱，优选用1(Γ20倍柱体积的水进行洗脱。在一个实施方案中，乙醇洗脱是使用5 30倍柱体积的乙醇水溶液进行洗脱，优选 用1(Γ20倍柱体积的乙醇水溶液进行洗脱。根据本发明的方法，在步骤iv)中，所述有机溶剂为石油醚与乙酸乙酯的混合物。在一个实施方案中，所述有机溶剂为石油醚与乙酸乙酯体积比84:16 95:5的混合物，优选体积比84:16 90:10的混合物，优选体积比约87:13的混合物。在用有机溶剂进行洗脱时，收集补骨脂素流分和异补骨脂素流分的过程中可用本领域技术人员公知的方法进行检测流分组成的变化，例如使用紫外检测仪进行监测，在富含补骨脂素的流分或者富含异补骨脂素的流分洗脱出来时，收集这些流分，合并富含补骨脂素的流分或者富含异补骨脂素的流分，分别将它们浓缩除去溶剂，即可得到纯度较高的补骨脂素或者异补骨脂素。根据本发明的方法，其基本上包括以下步骤i)使补骨脂药材用热水回流提取2次，每次使用6-8倍药材量的水，每次O. 5^3h,水提物减压浓缩至与药材量1:1后，得到浓缩液；ii)向所得浓缩液中加入稀HCl溶液，使酸的浓度(以氢离子计)为f2mol/L，在9(Tl00°C下水解 O. 25 Ih ；iii)使水解液在大孔吸附树脂柱上用水洗脱除去杂质，然后用85、8%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩或者任选地进一步干燥，得到提取物，为含有补骨脂素和异补骨脂素的混合物；iv)任选地，使步骤iii)步骤所得提取物在硅胶柱上用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱，收集补骨脂素流分和异补骨脂素流分，除去溶剂，分别得到补骨脂素和异补骨月旨素。在本发明方法的一个实施方案中，所述方法基本上包括以下步骤使补骨脂药材用热水回流提取2次(8倍量、6倍量)，每次I. 5h，水提物I: I减压浓缩后，得到含有大量补骨脂苷和异补骨脂苷的浓缩液，加入稀HCl溶液，在95 10(TC下水解I. 5h，水解液上大孔吸附树脂柱，蒸馏水洗脱除去水溶性杂质，再用95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，制得含有补骨脂素和异补骨脂素浸膏，通过硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯溶剂系统等度洗脱，收集流分，分别得到高纯度的补骨脂素和异补骨脂素。本发明第二方面提供了一种补骨脂的提取物，其中包含补骨脂素和异补骨脂素。根据本发明第二方面的提取物，其中补骨脂素和异补骨脂素二者的重量比为I :
O.01 100，例如 I 0. 01 10，例如 I 0. I 10，例如 I 0. I 100，例如 I 0. 2 5。根据本发明第二方面的提取物，其中补骨脂素和异补骨脂素总量占提取物总重量的10%以上，例如10 80%，例如10 60%，例如10 50%，例如15 50%，例如20 50%。根据本发明第二方面的提取物，其基本上是由本发明第一方面任一实施方案所述方法制备。
本发明第三方面提供了一种组合物，包含本发明第二方面所述提取物，以及任选的生理学可接受的载体或赋形剂。本发明任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用于该方面的其它任一实施方案，本发明任一方面或其任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用于其它任一方面或该其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾；当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和
短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。在本发明中，任一数值范围均包括该数值范围的任一子范围或该数值范围内的任一具体数值。例如在提及“步骤i)中提取1-4次”时，所述I 4次包括该数值范围内的任一子集或任一具体数值，例如广4次包括但不限于广2次、f 3次、2 4次、2 3次等。如本发明使用的，短语“制备补骨脂素和异补骨脂素或者包含它们的提取物的方法”，是指本发明的方法，该方法可以制备补骨脂素单体、异补骨脂素单体，还可以制备包含补骨脂素和异补骨脂素两者的提取物。本文所用的术语“单体”，是指主要成分含量在90%以上(例如92%以上、95%以上、98%以上)的物质，例如提及补骨脂素单体时，其中补骨脂素的含量在90%以上(例如92%以上、95%以上、98%以上)。如本发明使用的，术语“两素”，是指补骨脂素和异补骨脂素；术语“两苷”，是指补骨脂苷和异补骨脂苷。本发明人针对现有技术存在的问题，采用一种简易方法即可得到大量补骨脂素和异补骨脂素纯品。该方法主要使用的溶剂有水、乙醇、低浓度的盐酸、石油醚、乙酸乙酯等，基本未使用有毒试剂，符合国际绿色化学的理念。此外，该法能够在短时间内得到大量的补骨脂素与异补骨脂素混合物及高纯度的单体，可以为相关中成药的生产提供大量的原料，也可以为补骨脂的质量控制提供大量高纯度的标准品。在一个实施方案中，本发明提供的可以快速大量制备补骨脂素和异补骨脂素或者包含它们的提取物的方法，其特征是补骨脂水提物为符合中国药典质量要求的补骨脂热水回流提取两次(8倍量、6倍量)，每次I. 5h，得到水提液。在一个实施方案中，本发明提供的可以快速大量制备补骨脂素和异补骨脂素或者包含它们的提取物的方法，其特征是盐酸的浓度是3mol/L，使用体积为1:1(相对于浓缩液的体积)，另外类似酸浓度的硫酸、磷酸、硝酸等中强酸均可使用。在一个实施方案中，本发明提供的可以快速大量制备补骨脂素和异补骨脂素或者包含它们的提取物的方法，其特征是水解反应温度95 100°C，反应时间O. 5小时。在一个实施方案中，本发明提供的可以快速大量制备补骨脂素和异补骨脂素或者包含它们的提取物的方法，其特征是进行硅胶柱层析是采用的流动相是石油醚乙酸乙酯=87:13。本发明方法具有至少一个以下的优点本发明方法制备周期短，3-5天即可完成一个周期；本发明方法能够得到补骨脂素和异补骨脂素的提取物(补骨脂素和异补骨脂素的含量大于20%)及纯度90%以上的单体；本发明方法工艺简单、成本低；本发明方法符合绿色化学的理念，整个工艺流程中使用有机试剂少且未使用有毒试剂。


图I是在不加入盐酸时于95 100°C反应30min后反应液中两苷和两素的含量。图2是在加入lmol/L HCl于95 100°C反应30min后反应液中两苷和两素的含量。图3是在加入2mol/L HCl于95 100°C反应30min后反应液中两苷和两素的含量。图4是在加入3mol/L HCl于95 100°C反应30min后反应液中两苷和两素的含量。图5是在加入4mol/L HCl于95 100°C反应30min后反应液中两苷和两素的含量。图6是在加入3mol/L HCl于室温下反应液中两苷和两素的含量。图7是在加入3mol/L HCl于95 100°C反应IOmin后反应液中两苷和两素的含量。图8是在加入3mol/L HCl于95 100°C反应20min后反应液中两苷和两素的含量。附图中的标号I代表补骨脂苷，标号2代表异补骨脂苷，标号3代表补骨脂素，标号4代表异补骨脂素。
具体实施例方式通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。在本发明中，如未特别注明，检测提取物或单体成分所使用的HPLC方法见下表所示色谱柱AgilentEclipse XDB-C18 (4· 6 X 150mm, 5 μ m);流动相乙腈-O. 1%甲酸水梯度洗脱流速lmL/min;柱温50°C；检测波长246nm
时间Cmm)I A% (乙腈)I B% (0.丨％甲酸水)一
O1090
1864362180 20
258020
261090
36_[10_[_90_试验例本发明一种方法的制备条件考察制备浓缩液使补骨脂药材Ikg用热水回流提取2次(第一次的水用量为药材的8倍量、第二次为6倍量)，每次I. 5h，提取液I: I减压浓缩后，得到含有大量补骨脂苷和异补骨脂苷的浓缩液1L。以下试验分别使用该浓缩液。试验I :量取上述浓缩液IOml置于50ml具塞三角瓶中，在三角瓶中加入等体积的蒸懼水，加入后摇匀置于95 100°C水浴锅中，反应30min,反应完毕后取出放冷,取样,用HPLC进行检测。以上样品平行处理两份。经HPLC检测后，反应液中补骨脂苷、异补骨脂苷和补骨脂素、异补骨脂素的含量均无变化，见图I。试验2 :量取上述浓缩液IOml置于50ml具塞三角瓶中，在三角瓶中加入等体积的lmol/LHCl，加入后摇匀置于95 100°C水浴锅中，反应30min，反应完毕后取出放冷，取样，用HPLC进行检测。以上样品平行处理两份。经HPLC检测后，反应液中补骨脂苷的含量减小40%，异补骨脂苷的含量减小65% ;补骨脂素的含量增大4倍，异补骨脂素的含量增大6倍，见图2。试验3 :量取上述浓 缩液IOml置于50ml具塞三角瓶中，在三角瓶中加入等体积的2mol/LHCl，加入后摇匀置于95 100°C水浴锅中，反应30min，反应完毕后取出放冷，取样，用HPLC进行检测。以上样品平行处理两份。经HPLC检测后，反应液中补骨脂苷的含量减小93%，异补骨脂苷的含量减小98. 7% ;补骨脂素的含量增大7倍，异补骨脂素的含量增大7. 5倍，见图3。试验4 :量取上述浓缩液IOml置于50ml具塞三角瓶中，在三角瓶中加入等体积的3mol/LHCl，加入后摇匀置于95 100°C水浴锅中，反应30min，反应完毕后取出放冷，取样，用HPLC进行检测。以上样品平行处理两份。经HPLC检测后，反应液中基本不含补骨脂苷、异补骨脂苷，补骨脂苷、异补骨脂苷几乎完全转化成补骨脂素和异补骨脂素，见图4。试验5 :量取上述浓缩液IOml置于50ml具塞三角瓶中，在三角瓶中加入等体积的4mol/LHCl，加入后摇匀置于95 100°C水浴锅中，反应30min，反应完毕后取出放冷，取样，用HPLC进行检测。以上样品平行处理两份。经HPLC检测后，反应液中不含补骨脂苷、异补骨脂苷，补骨脂苷、异补骨脂苷全部转化成补骨脂素和异补骨脂素，结果与试验4基本无差另O，见图5。试验6 :量取上述浓缩液IOml置于50ml具塞三角瓶中，在三角瓶中分别加入等体积的3mol/L HC1，在室温下反应30min，反应完毕后取出放冷，取样，用HPLC进行检测。以上样品平行处理两份。经HPLC检测后，反应液中补骨脂苷、异补骨脂苷的含量和补骨脂素、异补骨脂素的含量与试验I中的相比基本一致，见图6。试验7 :量取上述浓缩液IOml置于50ml具塞三角瓶中，在三角瓶中加入等体积的3mol/LHCl，加入后摇匀置于95 100°C水浴锅中，反应lOmin，反应完毕后取出放冷，取样，用HPLC进行检测。以上样品平行处理两份。经HPLC检测后，反应液中补骨脂苷的含量减小48%，异补骨脂苷的含量减小76% ;补骨脂素的含量增大4. 4倍，异补骨脂素的含量增大6. 4倍，见图7。试验8 :量取上述浓缩液IOml置于50ml具塞三角瓶中，在三角瓶中加入等体积的3mol/LHCl，加入后摇匀置于95 100°C水浴锅中，反应20min，反应完毕后取出放冷，取样，用HPLC进行检测。以上样品平行处理两份。经HPLC检测后，反应液中补骨脂苷的含量减小87%，异补骨脂苷的含量减小98% ;补骨脂素的含量增大7. 2倍，异补骨脂素的含量增大8倍，见图8。由以上试验可以得到本发明的一个优选实施方案，其中本发明方法中使用的酸的量是使体系中酸的浓度(以氢离子计)为约1.5mol/L，水解温度约95 100°C，水解时间约30分钟。
实施例I、制备包含补骨脂素和异补骨脂素的提取物及各单体制备步骤步骤i):取补骨脂药材1kg，用水回流提取2次，第一次用水量为药材量的8倍，第二次用水量为药材量的6倍，每次I. 5小时，将合并提取液浓缩至与药材重量1:1，即为1L，得到浓缩液；步骤ii):向所得浓缩液中加入酸(盐酸)，使酸的浓度(以氢离子计)达到I. 5mol/L，在95 100°C下加热水解30分钟；步骤iii):使水解液在大孔吸附树脂柱(DlOl)上用水洗脱除去杂质，然后用浓度95%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到含有补骨脂素和异补骨脂素的本
实施例提取物63g ；步骤iv):取步骤iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混悬，然后加于硅胶柱上，用石油醚-乙酸乙酯(87 13)进行洗脱，紫外检测器监测目标流份，分别收集补骨脂素流分和异补骨脂素流分，减压除去溶剂，分别得到补骨脂素单体I. 24g和异补骨脂素单体I. 04g。经检测，本实施例提取物中，补骨脂素含量为15. 6%，异补骨脂素含量为14. 1%，二者总含量为29. 7% ;补骨脂素单体的纯度为99. 5%，异补骨脂素单体的纯度为98. 7%。实施例2、制备包含补骨脂素和异补骨脂素的提取物及各单体参考实施例I的方法进行。其中步骤i)中水回流提取I次5小时，用水量为药材量的10倍，将合并提取液浓缩至与药材重量1:1;步骤ii)中所用酸为硫酸，使酸的浓度(以氢离子计)达到3mol/L，在9(TlO(TC下加热水解15分钟；步骤iii)中使水解液在大孔吸附树脂柱(AB-8)上用水洗脱除去杂质，然后用无水乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到含有补骨脂素和异补骨脂素的本实施例提取物IlOg;iv)取步骤iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混悬，然后加于硅胶柱上，用石油醚-乙酸乙酯(88 12)进行洗脱，紫外检测器监测目标流份，分别收集补骨脂素流分和异补骨脂素流分，减压除去溶剂，分别得到补骨脂素单体O. 002g和异补骨脂素单体O. 027g。经检测，本实施例提取物中，补骨脂素含量为O. 02%，异补骨脂素含量为O. 27%，二者总含量为O. 29% ;补骨脂素单体的含量为98. 3%，异补骨脂素单体的含量为98. 5%。实施例3、制备包含补骨脂素和异补骨脂素的提取物及各单体参考实施例I的方法进行。其中步骤i)中水回流提取4次，每次O. 5小时，每次用水量为药材量的8倍，将合并提取液浓缩至与药材重量1:1;步骤ii)中所用酸为硝酸，使酸的浓度(以氢离子计)达到O. 5mol/L，在9(Tl00°C下加热水解60分钟；步骤iii)中使水解液在大孔吸附树脂柱(NKA)上用水洗脱除去杂质，然后用浓度90%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到含有补骨脂素和异补骨脂素的本实施例提取物83. 3g ；iv)取步骤iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混悬，然后加于硅胶柱上，用石油醚-乙酸乙酯(86:14)进行洗脱，紫外检测器监测目标流份，分别收集补骨脂素流分和异补骨脂素流分，减压除去溶剂，分别得到补骨脂素单体O. 164g和异补骨脂素单体O. 152g。经检测，本实施例提取物中，补骨脂素含量为I. 64%，异补骨脂素含量为I. 52%，二者总含量为3. 16% ;补骨脂素单体的含量为99. 3%，异补骨脂素单体的含量为98. 3%实施例4、制备包含补骨脂素和异补骨脂素的提取物及各单体参考实施例I的方法进行。其中步骤i)中水回流提取3次，每次I小时，每次用水量为药材量的5倍，将合并提取液浓缩至与药材重量1:1;步骤ii)中所用酸为磷酸，使酸的浓度(以氢离子计)达到3mol/L，在95 100°C下加热水解45分钟；步骤iii)中使水解液在大孔吸附树脂柱(XDA-5)上用水洗脱除去杂质，然后用浓度85%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到含有补骨脂素和异补骨脂素的本实施例提取物170g ；iv)取步骤iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混悬，然后加于硅胶柱上，用石油醚-乙酸乙酯(85 15)进行洗脱，紫外检测器监测目标流份，分别收集补骨脂素流分和异补骨脂素流分，减压除去溶剂，分别得到补骨脂素单体O. 121g和异补骨脂素单体O. 123g。经检测，本实施例提取物中，补骨脂素含量为I. 21%，异补骨脂素含量为I. 23%，二者总含量为2. 44% ;补骨脂素单体的含量为98. 3%，异补骨脂素单体的含量为99%。实施例5、制备包含补骨脂素和异补骨脂素的提取物及各单体参考实施例I的方法进行。其中步骤i)中水回流提取2次，每次3小时，每次用水量为药材量的6倍，将合并提取液浓缩至与药材重量1:1;步骤ii)中所用酸为盐酸，使酸的浓度(以氢离子计)达到2mol/L，在95 100°C下加热水解40分钟；步骤iii)中使水解液在大孔吸附树脂柱(HP-10)上用水洗脱除去杂质，然后用浓度80%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到含有补骨脂素和异补骨脂素的本实施例提取物76. 7g ；iv)取步骤iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混悬，然后加于硅胶柱上，用石油醚-乙酸乙酯(84 16)进行洗脱，紫外检测器监测目标流份，分别收集补骨脂素流分和异补骨脂素流分，减压除去溶剂，分别得到补骨脂素单体O. 189g和异补骨脂素单体O. Hg。经检测，本实施例提取物中，补骨脂素含量为I. 89%，异补骨脂素含量为1.4%，二者总含量为3. 29% ;补骨脂素单体的含量为99. 3%，异补骨脂素单体的含量为98. 3%。实施例6、制备包含补骨脂素和异补骨脂素的提取物及各单体参考实施例I的方法进行。其中步骤i)中水回流提取I次4小时，用水量为药材量的15倍，将合并提取液浓缩至与药材重量1:1;步骤ii)中所用酸为硫酸，使酸的浓度(以氢离子计)达到lmol/L，在95 100°C下加热水解50分钟；步骤iii)中使水解液在大孔吸附树脂柱(LSI-004)上用水洗脱除去杂质，然后用浓度75%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到含有补骨脂素和异补骨脂素的本实施例提取物70g ；iv)取步骤iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混悬，然后加于硅胶柱上，用石油醚-乙酸乙酯(84 16)进行洗脱，紫外检测器监测目标流份，分别收集补骨脂素流分和异补骨脂素流分，减压除去溶剂，分别得到补骨脂素单体O. 136g和异补骨脂素单体O. 119g。经检测，本实施例提取物中，补骨脂素含量为I. 36%，异补骨脂素含量为I. 19%，二者总含量为2. 55% ;补骨脂素单体 的含量为98. 8%，异补骨脂素单体的含量为99. 3%。实施例7、制备包含补骨脂素和异补骨脂素的提取物及各单体参考实施例I的方法进行。其中步骤i)中水回流提取3次，每次2小时，每次用水量为药材量的9倍，将合并提取液浓缩至与药材重量1:1;步骤ii)中所用酸为磷酸，使酸的浓度(以氢离子计)达到I. 5mol/L，在95 100°C下加热水解20分钟；步骤iii)中使水解液在大孔吸附树脂柱(LSI-004)上用水洗脱除去杂质，然后用浓度65%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到含有补骨脂素和异补骨脂素的本实施例提取物86. 7g ；iv)取步骤iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混悬，然后加于硅胶柱上，用石油醚-乙酸乙酯(85:15)进行洗脱，紫外检测器监测目标流份，分别收集补骨脂素流分和异补骨脂素流分，减压除去溶剂，分别得到补骨脂素单体O. 015g和异补骨脂素单体O. OlSg0经检测，本实施例提取物中，补骨脂素含量为O. 15%，异补骨脂素含量为O. 18%，二者总含量为O. 33% ;补骨脂素单体的含量为99. 4%，异补骨脂素单体的含量为98. 8%。实施例8、制备包含补骨脂素和异补骨脂素的提取物及单体参考实施例I的方法进行。其中步骤i)中水回流提取2次，每次3. 5小时，每次用水量为药材量的10倍，将合并提取液浓缩至与药材重量1:1;步骤ii)中所用酸为盐酸，使酸的浓度(以氢离子计)达到3mol/L，在95 100°C下加热水解25分钟；步骤iii)中使水解液在大孔吸附树脂柱(DlOl)上用水洗脱除去杂质，然后用浓度60%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到含有补骨脂素和异补骨脂素的本实施例提取物IOOg ；iv)取步骤iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混悬，然后加于硅胶柱上，用石油醚-乙酸乙酯(88:12)进行洗脱，紫外检测器监测目标流分，分别收集补骨脂素流分和异补骨脂素流分，减压除去溶剂，分别得到补骨脂素单体O. 151g和异补骨脂素单体O. 112g。经检测，本实施例提取物中，补骨脂素含量为I. 51%，异补骨脂素含量为I. 12%，二者总含量为2. 63% ;补骨脂素单体的含量为98. 3%，异补骨脂素单体的含量为98. 5%。实施例9、制备包含补骨脂素和异补骨脂素的提取物及各单体参考实施例I的方法进行。其中步骤i)中水回流提取I次3. 5小时，用水量为药材量的10倍，将合并提取液浓缩至与药材重量1:1;
步骤ii)中所用酸为硫酸，使酸的浓度(以氢离子计)达到3mol/L，在95 100°C下加热水解70分钟；步骤iii)中使水解液在大孔吸附树脂柱(AB-8)上用水洗脱除去杂质，然后用浓度55%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到含有补骨脂素和异补骨脂素的本实施例提取物160g ；iv)取步骤iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混悬，然后加于硅胶柱上，用石油醚-乙酸乙酯(86:14)进行洗脱，紫外检测器监测目标流分，分别收集补骨脂素流分和异补骨脂素流分，减压除去溶剂，分别得到补骨脂素单体O. OOSg和异补骨脂素单体O. 044g。经检测，本实施例提取物中，补骨脂素含量为O. 08%，异补骨脂素含量为O. 44%，二者总含量为O. 52% ;补骨脂素单体的含量为99. 5%，异补骨脂素单体的含量为99. 3%。参考制各例:参考CN03115689. 4，CN1446814A实施例的方法。取补骨脂1000克粉碎后，过60目筛，用氯仿在室温下浸提3次，每次I升，合并浸提液，在60°C温度和O. IMPa压力真空减压回收溶剂，得氯仿浸膏78克，将氯仿提取物加硅胶130g拌匀，低温烘干后研细、上色谱柱(硅胶1300g、200-300目)。用石油醚-乙酸乙酯(8 2)洗脱，分离得化合物补骨脂素493mg (HPLC 纯度 96. 3%)和异补骨脂素 1020mg(HPLC 纯度 95. 6%)。
权利要求
1.制备补骨脂素和异补骨脂素或者包含它们的提取物的方法，其包括以下步骤 i)使补骨脂药材用水回流提取，将合并提取液浓缩，得到浓缩液； ii)向所得浓缩液中加入酸，加热水解； iii)使水解液在大孔吸附树脂柱上用水洗脱除去杂质，然后用浓度大于50%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩或者任选地进一步干燥，得到含有补骨脂素和异补骨脂素的提取物； iv)任选地，使步骤iii)所得提取物在硅胶柱上用有机溶剂进行洗脱，收集补骨脂素流分和异补骨脂素流分，除去溶剂，分别得到补骨脂素和异补骨脂素。
2.根据权利要求I的方法，其中步骤i)中的浓缩是使提取液浓缩至原体积的3/10 7/10。
3.根据权利要求I的方法，其中步骤ii)中所述酸是盐酸、硫酸、硝酸或磷酸。
4.根据权利要求I的方法，其中步骤ii)中所述酸的加入量是使酸的浓度以氢离子计为 O.5 3mol/L。
5.根据权利要求I的方法，其中步骤ii)中加热水解是在9(noo°c的温度下水解。
6.根据权利要求I的方法，其中步骤iii)中，所述的大孔吸附树脂选自D101型、AB-8、NKA。
7.根据权利要求I的方法，在步骤iii)中，所述的乙醇水溶液的乙醇浓度为5(Γ99%。
8.根据权利要求I的方法，其包括以下步骤 i)使补骨脂药材用热水回流提取2次，每次使用6-8倍药材量的水，每次O.5^3h,水提物减压浓缩至原体积的4/1(Γ6/10后，得到浓缩液； ii)向所得浓缩液中加入稀HCl溶液，使酸的浓度以氢离子计为f2mol/L，在9(Tl00°C下水解O. 25 Ih ； iii)使水解液在大孔吸附树脂柱上用水洗脱除去杂质，然后用85、8%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩或者任选地进一步干燥，得到提取物，为含有补骨脂素和异补骨脂素的混合物； iv)任选地，使步骤iii)步骤所得提取物在硅胶柱上用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱，收集补骨脂素流分和异补骨脂素流分，除去溶剂，分别得到补骨脂素和异补骨脂素。
9.一种补骨脂的提取物，其中包含补骨脂素和异补骨脂素。
10.权利要求9的提取物，其中补骨脂素和异补骨脂素二者的重量比为I:0. Of 100。
全文摘要
本发明涉及制备补骨脂素和异补骨脂素或包含它们的提取物的方法。具体地说，本发明方法其包括以下步骤i)使补骨脂药材用水回流提取，将合并提取液浓缩，得到浓缩液；ii)向所得浓缩液中加入酸，加热水解；iii)使水解液在大孔吸附树脂柱上用水洗脱除去杂质，然后用浓度大于50%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩或者任选地进一步干燥，得到含有补骨脂素和异补骨脂素的提取物；iv)任选地，使步骤iii)所得提取物在硅胶柱上用有机溶剂进行洗脱，收集补骨脂素流分和异补骨脂素流分，除去溶剂，分别得到补骨脂素和异补骨脂素。本发明方法不仅操作简单、生产周期短、而且得率高，污染少，适用于工业化大生产。
文档编号C07D493/04GK102875562SQ20121026404
公开日2013年1月16日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者高秀梅, 王跃飞, 彭四威, 刘二伟, 熊文, 朱彦, 杨静 申请人:天津中医药大学