专利名称：具有美白功能的小球藻类金属硫蛋白的提取方法
技术领域：
本发明涉及小球藻类金属硫蛋白的制备及其美白功能的试验方法，特别是涉及ー种具有美白功能的小球藻类金属硫蛋白的提取方法。
背景技术：
金属硫蛋白(metallothioneins, MTs)是ー类低分子量、高巯基含量,且能大量结合金属离子的蛋白质。由于MTs具有特殊的分子结构和氨基酸组成，该类蛋白质具有抗氧化、抗辐射、排出体内重金属离子等生理功能。但目前MTs大多从哺乳动物中诱导提取，其产品制备成本高、技术难度大，造成MTs价格昂贵。随着研究的深入，发现在植物、原核藻类
和真核微生物中都有MTs的存在，虽然它们在正常生物体环境中通常含量很低，但可诱导提高其含量。故本发明采用生长周期短、对锌胁迫敏感，且易于培养和分离的普通海洋小球藻{Chlorella vulgaris)为原材料,通过胁迫、提取和分离エ艺的优化,可从小球藻中制取大量类金属硫蛋白。目前国内外主要是通过以下方法来制备金属硫蛋白(1)以硫酸锌诱导动物，以其肝组织为原料进行MTs提取。如周攀登在《广东化工》2011，12 (38) :187-188,报道的以硫酸锌诱导家兔肝组织产生MTs，采取超滤、凝胶层析和离子交換方法对金属硫蛋白进行纯化，制备其精品。这种方法的优点在于利用人体所需的微量元素Zn，但其生产成本昂贵。(2)通过重金属诱导微生物获得MTs，如李明春在《南开大学学报》2003，36 (3) : 123-128，报道通过Cu2+诱导假丝酵母获得类金属硫蛋白。利用第二种方法获得的类金属硫蛋白成本比动物诱导(即第一种方法)的要低，但由于培养基物质复杂，操作难度高。综上所述，目前金属硫蛋白的提取要么以动物为原料，其生产成本高且不符合国际上对动物保护的要求；要么以微生物为原材料，其微生物培养及蛋白分离提取较为困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产成本低、适用于エ业化生产的具有美白功能的小球藻类金属硫蛋白的提取方法，并对该蛋白进行美白功能试验。为实现上述目的，本发明的技术解决方案是
本发明是ー种具有美白功能的小球藻类金属硫蛋白的提取方法，它包括以下步骤
(1)利用O.05 mol/L的ZnCl2诱导处于对数生长期的普通海洋小球藻ipdorellavulgaris),培养24-120 h后，考察不同锌胁迫浓度及培养不同时间对藻细胞内锌结合类金属硫蛋白诱导量的影响，确定ZnCl2的最佳诱导浓度和诱导时间；
(2)根据步骤(I)确定的最佳ZnCl2胁迫浓度和胁迫时间，大量培养小球藻，取离心收集的藻细胞，按藻泥重量和提取液体积以1:10 (w/v)的比例加入pH值为7. 8的Tris-HCl缓冲液，进行超声波细胞破碎，经高速离心弃去沉淀，收集上清液；
(3)上清液过层析柱G-75，每10min收集一管洗脱液，測定254 nm的吸光度值，并测定各收集管的锌含量，以第二个信号峰即254 nm吸收信号弱而锌信号强的组分峰为目标峰，确定类金属硫蛋白在G-75洗脱分离的收集时间段，收集的组分经真空冷冻干燥即为类金属硫蛋白粗提物；
(4)获得的类金属硫蛋白粗提物用超纯水复溶后，过层析柱G-25进行脱盐，再次真空冷冻干燥后即得到类金属硫蛋白制品；
(5)通过酪氨酸酶进行单酚酶和ニ酚酶的酶活性抑制率试验，确定类金属硫蛋白的美白功能。步骤(I)中最佳ZnCl2胁迫浓度和最佳诱导时间的确定方法如下利用凝胶色谱与电感耦合等离子体质谱联用的检测手段，以锌检测信号及对应的蛋白质分子量大小确定小球藻锌结合类金属硫蛋白峰在色谱曲线上的位置，以锌信号強度代表锌结合类金属硫蛋白的诱导量，确定最佳的锌胁迫浓度和诱导时间。步骤(2)中藻细胞破碎时，以藻泥重量与缓冲液体积按1:10 (w/v)的比例加入，缓冲液由内含1% ニ硫苏糖醇、pH为7. 8的10 mmol/L Tris-HCl组成；进行藻细胞破碎时， 破碎过程采用间歇式进行，用显微镜观察直至细胞破碎完全。步骤(3)中以固定间隔时间连续收集经G-75分离的洗脱液，检测每一收集管洗脱液在254 nm的吸光度值和锌信号值，以收集管序号为横坐标、以254 nm和锌信号值为纵坐标作图，可得到两个组分峰，第一个峰的254 nm吸光度值高而锌的信号值低，第二个峰的254 nm吸光度值低而锌的信号值高，因此第二个峰对应的组分即类金属硫蛋白的目标物。本发明采用氯化锌胁迫培养普通海洋小球藻，通过不同锌胁迫浓度和胁迫时间的考察，可获得类金属硫蛋白的最优诱导条件，通过提取、分离和纯化过程，得到类金属硫蛋白制品。通过抑制酪氨酸酶活性试验证明，小球藻类金属硫蛋白浓度为1.2 mg/mL时,能使ニ酚酶的活性下降87%，使单酚酶在2300秒内未呈现出活性，说明该蛋白质具有良好的美白功能。下面结合附图和具体实施例对本发明作进ー步的说明。
图I为ZnCl2胁迫浓度和胁迫时间与锌结合类金属硫蛋白的关系 图2为提取锌结合类金属硫蛋白经凝胶层析柱G-75分离的锌检测信号与紫外检测信号的洗脱曲线 图3为单酚酶的美白功能试验结果 图4为ニ酚酶的美白功能试验结果图。具体实验方式
本发明是ー种具有美白功能的小球藻类金属硫蛋白的提取方法，以下是本发明的几个具体实例，它包括以下エ艺步骤
实施例I
I)在处于对数生长期的小球藻藻液中加入O. 05 mol/L氯化锌，控制锌在藻液中的最終浓度为5-100 MmoI/L范围内，继续培养小球藻24-120 h，培养过程中每天定时手工摇瓶5次，姆次约3 min。取培养组小球藻藻液各100 mL,经10000 r/min离心,收集藻细胞,分别用5 mmol/L EDTA_2Na和超纯水清洗藻细胞2次，加入10 mmol/L Tris-HCl缓冲液5 mL,冰浴下超声波破碎藻细胞5 min,经12000 r/min离心10 min,收集上清液。
2)利用 TSK-gel 凝胶色谱柱(G3000PWxl, 7. 8 mm i. d. X 300 mm, 6 μ m)进行色谱分离，以10 mmol/L Tris-HCl缓冲液为流动相，洗脱液经电感耦合等离子体质谱在线检测锌信号強度，以锌信号为纵坐标、保留时间为横坐标作色谱流出曲线图，通过锌信号峰与对应蛋白质分子量确定小球藻锌结合类金属硫蛋白峰在色谱曲线上的位置。如图I所示，获得不同锌胁迫浓度和不同诱导时间小球藻锌结合类金属硫蛋白的诱导量，以确定锌胁迫的浓度和胁迫时间。3)在确定的培养条件下大量培养小球藻，离心收集藻细胞后，分别用5 mmol/LEDTA-2Na和超纯水清洗藻细胞2次，以除去细胞壁吸附的锌。按藻泥重量和提取液体积1:10 (w/v)的比例加入内含1% ニ硫苏糖醇、pH为7. 8的10 mmol/L Tris-HCl,冰浴下采用间歇式超声波破碎藻细胞，破碎过程用显微镜检查直至细胞破碎完全。然后经12000 r/min离心10 min,收集上清液。4)将上清液注入凝胶层析柱G-75 ( Φ3.0Χ80 cm),以pH为7. 8的10 mmol/LTris-HCl为洗脱液，以固定每10 min连续收集经G-75分离的洗脱液，检测每一收集管洗脱液在254 nm的吸光度值和锌信号值，以收集管序号为横坐标、以254 nm和锌信号值为纵坐标作图。如图2所示，可得到两个组分峰，第一个峰的254 nm吸光度值高而锌的信号值低，·第二个峰的254 nm吸光度值低而锌的信号值高，因此第二个峰对应的组分即类金属硫蛋白的目标物，收集过程中通入惰性气体，如氮气或氩气，以防止样品被氧化。5)将G-75收集组分经真空冷冻干燥后，复溶于超纯水中，过G-25脱盐柱(Φ I. 5X30 cm)，用纯水脱盐纯化，收集锌结合蛋白质组分并经真空冷冻干燥即得到具有美白功能的小球藻类金属硫蛋白制品。6)通过抑制酪氨酸酶活性试验，证明该提取蛋白具有美白功能。实施例2
O向处于对数生长期的小球藻中加入ZnCl2，使藻液中锌的最终浓度达到50 Mmol/L,并通气培养72小吋。2)通过离心法收集藻细胞，经反复冻融5次后，再经超声波细胞破碎，经12000 r/min离心10 min收集上清液。3)同实施例I中步骤(4)和(5)
4)通过抑制酪氨酸酶活性试验，证明当小球藻类金属硫蛋白浓度为I. 2 mg/mL时，可使单酚酶在2300 s内未表现出活性、使ニ酚酶的活性下降87%，说明该蛋白质具有较强的美白功效。实施例3
I)向处于对数生长期的小球藻中加入ZnCl2，使藻液中锌的最终浓度达到5 Mmol/L，并通气培养120小时。2)通过离心法收集藻细胞，在冰浴下经超声波细胞破碎(540 W，每次开I. 2 S、关3 S)，用显微镜观察直至细胞破碎完全。经12000 r/min离心10 min收集上清液。3)同实施例I中步骤(4)和(5)
4)通过抑制酪氨酸酶活性试验，类金属硫蛋白对单酚酶活性的半抑制率浓度为0. 5mg/mL、对ニ酚酶活性的半抑制率浓度为0. 7 mg/mL，说明该蛋白质具有美白功能。实施例4I)向处于对数生长期的小球藻中加入ZnCl2，使藻液中锌的最终浓度达到100 Mmol/L,并通气培养24小时。2)通过离心法收集藻细胞，在冰浴下经超声波细胞破碎(540 W，每次开I. 2 S、关3 S)，用显微镜观察直至细胞破碎完全。经12000 r/min离心10 min收集上清液。3)同实施例I中步骤(4)和(5)；
4)通过抑制酪氨酸酶活性试验，类金属硫蛋白对单酚酶活性的半抑制率浓度为O. 5mg/mL、对ニ酚酶活性的半抑制率浓度为O. 7 mg/mL，说明该蛋白质具有美白功能。抑制酪氨酸酶活性试验即美白功能检测方法
I、在试管中加入 I mL 0.5 mmol/L 酪氨酸、2 mL PBS 缓冲液(100 mmol/L pH,6. 8),30°C下水浴10 min,加入O. 2 mL不同浓度的类金属硫蛋白制品和O. I mL酪氨酸酶,控制酶的终浓度为124 Pg/mL。通过测定OD475的动力学曲线，如图3所示，计算单酚酶的抑制率。在试管中加入I mL 0.5 mmol/L左旋多巴(L-DOPA)溶液、3 mL PBS缓冲液(pH6. 8), 30°C下水浴10 min,加入 O. 2 mL不同浓度的类金属硫蛋白和O. I mL酪氨酸酶,控制酶的终浓度为740 Pg/mL。通过测定OD475的动力学曲线，如图4所示，计算ニ酚酶的抑制率。
权利要求
1.ー种具有美白功能的小球藻类金属硫蛋白的提取方法，其特征在于它包括以下步骤 (1)利用O.05 mol/L的ZnCl2诱导处于对数生长期的普通海洋小球藻ipdorellavulgaris),培养24-120 h后，考察不同锌胁迫浓度及培养不同时间对藻细胞内锌结合类金属硫蛋白诱导量的影响，确定ZnCl2的最佳诱导浓度和诱导时间； (2)根据步骤(I)确定的最佳ZnCl2胁迫浓度和胁迫时间，大量培养小球藻，取离心收集的藻细胞，按藻泥重量和提取液体积以1:10 (w/v)的比例加入pH值为7. 8的Tris-HCl缓冲液，进行超声波细胞破碎，经高速离心弃去沉淀，收集上清液； (3)上清液过层析柱G-75，每10min收集一管洗脱液，測定254 nm的吸光度值，并测定各收集管的锌含量，以第二个信号峰即254 nm吸收信号弱而锌信号强的组分峰为目标峰，确定类金属硫蛋白在G-75洗脱分离的收集时间段，收集的组分经真空冷冻干燥即为类金属硫蛋白粗提物； (4)获得的类金属硫蛋白粗提物用超纯水复溶后，过层析柱G-25进行脱盐，再次真空冷冻干燥后即得到类金属硫蛋白制品； (5)通过酪氨酸酶进行单酚酶和ニ酚酶的酶活性抑制率试验，确定类金属硫蛋白的美白功能。
2.如权利要求I所述的具有美白功能的小球藻类金属硫蛋白的提取方法，其特征在于步骤(I)中最佳ZnCl2胁迫浓度和最佳诱导时间的确定方法如下利用凝胶色谱与电感耦合等离子体质谱联用的检测手段，以锌检测信号及对应的蛋白质分子量大小确定小球藻锌结合类金属硫蛋白峰在色谱曲线上的位置，以锌信号強度代表锌结合类金属硫蛋白的诱导量，确定最佳的锌胁迫浓度和诱导时间。
3.如权利要求I所述的具有美白功能的小球藻类金属硫蛋白的提取方法，其特征在于步骤(2)中藻细胞破碎时，以藻泥重量与缓冲液体积按1:10 (w/v)的比例加入，缓冲液由内含1%ニ硫苏糖醇、PH为7. 8的10 mmol/L Tris-HCl组成；进行藻细胞破碎时，破碎过程采用间歇式进行，用显微镜观察直至细胞破碎完全。
4.如权利要求I所述的具有美白功能的小球藻类金属硫蛋白的提取方法，其特征在于步骤(3)中以固定间隔时间连续收集经G-75分离的洗脱液，检测每一收集管洗脱液在254 nm的吸光度值和锌信号值，以收集管序号为横坐标、以254 nm和锌信号值为纵坐标作图，可得到两个组分峰，第一个峰的254 nm吸光度值高而锌的信号值低,第二个峰的254 nm吸光度值低而锌的信号值高，因此第二个峰对应的组分即类金属硫蛋白的目标物。
全文摘要
本发明公开了一种具有美白功能的小球藻类金属硫蛋白的提取方法，本发明采用氯化锌胁迫培养普通海洋小球藻，通过不同锌胁迫浓度和胁迫时间的考察，可获得类金属硫蛋白的最优诱导条件，通过提取、分离和纯化过程，得到类金属硫蛋白制品。通过抑制酪氨酸酶活性试验证明，小球藻类金属硫蛋白浓度为1.2mg/mL时，能使二酚酶的活性下降87%，使单酚酶在2300秒内未呈现出活性，说明该蛋白质具有良好的美白功能，在化妆品、保健品领域有广阔的应用前景。
文档编号C07K14/405GK102675436SQ20121018013
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月4日 优先权日2012年6月4日
发明者杨洪, 黄志勇 申请人:集美大学