专利名称：分离i型前胶原氨基末端肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离I型前胶原氨基末端肽(PINP)的方法。
背景技术：
PINP是ー个非常灵敏的骨转化速率的指标；PINP的变化与骨密度的变化高度相关，并与抗骨吸收的疗效相关。PINP在用于检测抗骨吸收治疗的时候，在短短的几个月内对骨转化的治疗作用给予评价。相反如果通过检测病人的骨密度(BMD)来判断治疗效果，这ー过程需要大约两年时间。最近的数据也表明PINP对于检测骨质疏松病人的合成代谢治疗的效果特别有效。早期通过PINP来评定骨质疏松的治疗，不仅能帮助患者选择正确的治疗方案，而且能增强患者治疗的信心。乳腺癌的发病程度与PINP的水平相关。 PINP的分子量35KD，高度磷酸化，在体内的浓度男性20-76 μ g/L，女性19-84 μ g/しPINP最初由羊水分离，并命名为胎儿抗原2，测序表明其大部分为两条al链形成的同聚体，少部分为2条al和一条a2链非共价键组成的三联体结构。然而，传统方法要求用第4 6个月的胎儿羊水，使PINP的生产受到极大的限制。因此，本发明主要寻求ー种更高效、更实用的PINP制备方法。在偶然的实验中，我们用芬兰公司的I型前胶原肽免放药盒(UniQ PINP RIA)随机測定了 3份癌性病人的腹水，发现其PINP的含量都达到了标准品的最高值，即都大于250ng/ml。但到目前还未见从人的腹水中提取了 PINP的报道。
发明内容
本发明是要解决I型前胶原氨基末端肽的提取方法、效率、纯度、活性的问题。采用硫酸氨分级分离发法，第一歩去除了大部分的杂蛋白。采用等电点分离法又去除大部分的杂蛋白。Qs印harose FF，上样量大，流速快，分辩高，大大提高了效率。最后用高分辨率的Superdex200代替S印hacryl200，进ー步提高纯度。经SDS-PAGE分析纯度达98%，活性和纯度非常满意。
图I :腹水纯化前后SDS/PAGE电泳结果图2 :Superdex2OO 分子筛层析
具体实施例方式取癌性病人腹水2升，10000RPM离心，取上清。目的是去掉组织块和癌性细胞；这一步必须穿戴防护手套和眼镜，因为决大多数肝癌病人都携帯肝炎病毒；首先，我们采用硫酸铵分级沉淀法，收集硫酸铵浓度达到40 60%的馏分。方法为先加入40%硫酸铵后搅拌过夜，10000RPM离心，弃沉淀，上清继续加硫酸铵至60%，10000RPM离心，留沉淀。沉淀用Buffer A溶解、透析,姆_ 12小时换液,透析两天,其中BufferA 的配方为20mM Tris, ImM EDTA, 50mM NaCl，pH7. 4 ;透析液的配方为20mM Tris,ImM EDTA, 50mM NaCl，pH7. 4。其次，我们根据序列分析，PINP的等电点为6. 2。上述第一歩透析好的样品，10000RPM离心，留上清。上清用盐酸调溶液的pH为6. 2，搅拌4个小时，10000RPM离心，留沉淀；沉淀用生理盐水溶解后，用Buffer A透析过夜,取出透析好的样品，10000RPM离心，
留上清。采用柱层析法第二步中经过Buffer A透析的样品上阴离子交換柱Q-S印haroseFF，用 Buffer A 和 Buffer B(20mM Tris, ImM EDTA，IM NaC)进行梯度洗脱，收集40 60% Buffer B部分洗脱液；此收集物用BufferC (O. IM HAC-NaAC, pH4. 4)透析，上阳离子交换柱CM-SepharoseFF,用Buffer C和Buffer A进行梯度洗脱，收集20 50%Buffer A懼分；浓缩成5mg/ml,取200 μ I上superdex200分子筛层析，收集35KD位置的峰，浓缩成lmg/ml，加入O. 1%叠氮钠，ImM PMSF，-20°C保存即可。其中Buffer B的配方是20mM Tris, ImM EDTA, IM NaCl ；Buffer C 的配方是0. IM HAC-NaAC, pH4. 4。 标记底物是放免药盒的重要组成部分，其质量对药盒至关重要。对于标记底物质量的检定，最終通过标记后对药盒的各个指标来体现的。用芬兰公司的I型前胶原肽免放药盒UniQ PINP RIA (国家食品药品监瞀管理局特殊药品进ロ准许证P-04-05-27-03)检验各峰中PINP的含量，获得纯度高的PINP(见附图1、2)。通过标记物替代实验，各项指标都完全达到要求。纯度鉴定经多步纯化可得到95%的目的蛋白，结果见附图I、图2。图1:A:蛋白质分子量标准，B :腹水稀释1000倍,C Q-SepharoseFF后蛋白，D CM-SepharoseFF后蛋白，E :superdex200分子筛后蛋白。图2 :superdex200分子筛层析结果,2号为目标峰。目标峰 经用芬兰试剂盒检测，结果稀释1000倍后测值仍然大于250ng/ml。
权利要求
1.一种分离I型前胶原氨基末端肽的方法 第一歩，采用硫酸铵分级沉淀法取癌性病人腹水，10000RPM离心，取上清；上清中加入40%硫酸铵后搅拌过夜，10000RPM离心，弃沉淀，上清继续加硫酸铵至60%，10000RPM离心，留沉淀；沉淀用Buffer A溶解、透析,姆_ 12小时换液,透析两天,其中BufferA的配方为20mM Tris, ImM EDTA, 50mM NaCl, pH7. 4 ;透析液的配方为20mM Tris, ImM EDTA, 50mMNaCl，ρΗ7· 4。
第二步，采用等电点分离法PINP的等电点为6. 2，上述第一歩透析好的样品，10000RPM离心，留上清，上清用盐酸调溶液的pH为6. 2，搅拌4个小时，10000RPM离心，留沉淀；沉淀用生理盐水溶解后，用BufferA透析过夜,取出透析好的样品，10000RPM离心，留上清。
第三步，采用柱层析法第二步中经过Buffer A透析的样品上阴离子交换柱Q-SepharoseFF,用 Buffer A 和 Buffer B 进行梯度洗脱，收集 40 60 % BufferB 部分洗脱液，此收集物用Buffer C透析；经过Buffer C透析的样品上阳离子交换柱CM-SepharoseFF,用 Buffer C 和 Buffer A 进行梯度洗脱，收集 20 50% Buffer A 部分洗脱液；浓缩成5mg/ml,取200μ I上superdex200分子筛层析,收集35KD位置的峰,浓缩成lmg/ml，加入O. I %叠氮钠，ImM PMSF, -20°C保存即可；其中Buffer B的配方是20mMTris, ImMEDTA, IM NaCl ；Buffer C 的配方是0. IM HAC-NaAC, pH4. 4。
全文摘要
本发明涉及一种分离I型前胶原氨基末端肽的方法，解决了I型前胶原氨基末端肽的大量提取方法、效率、纯度、活性的问题，第一步采用硫酸氨分级分离发法，去除了大量的杂蛋白。采用等电点分离法又去除大部分的杂蛋白。采用Qsepharose FF，上样量大，流速快，提高了纯化效率。最后用高分辨率的Superdex200代替Sephacryl200，进一步提高纯度，经SDS-PAGE分析纯度达98％。
文档编号C07K1/30GK102690347SQ20121015380
公开日2012年9月26日 申请日期2012年5月18日 优先权日2012年5月18日
发明者赵玉军 申请人:北京北方生物技术研究所