专利名称：一种植物耐硒蛋白及其编码基因与应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中一个植物耐硒相关基因及其编码蛋白与应用和利用该基因增强植物耐硒的方法。
背景技术：
硒是环境中一种重要的生命元素，是人体必需的微量元素，对机体发挥着极其重要的作用。然而一方面硒在地壳中的含量相当稀少和分散，硒缺乏在全世界是一种很普遍的现象，另一方面硒污染在某些地区也同时存在着。硒污染的产生主要与人类的生产活动有关，它可以从一些矿业、农业、石化产品和工业制造业所产生的废弃原料中释放出来，从而在土壤、水体中富集形成污染。植物、动物吸收了土壤或水体中过量的硒就会产生毒害作用，在植物、动物体内形成富集，并最终通过食物链对人体产生毒害作用。因此，硒的缺乏和过剩都与人的生命活动休戚相关，深入探讨植物对硒耐受性机制具有重要理论意义和实践价值。利用先进的分子生物学手段分离耐硒的抗性基因，再利用转基因技术培育出更多的耐硒植物是未来的发展趋势。其潜在的应用价值一方面是通过在农作物中表达硒代谢关键基因来调节农产品含硒水平，满足人类健康摄硒的需要；另一方面利用转基因技术实现通过植物治理环境硒污染的目标。拟南芥是一种模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学等研究领域。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到，有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物研究。因此，对拟南芥耐硒的分子生物学机制的研究对提高植物的耐硒能力具有重要的理论与经济意义。拟南芥基因组已完全测序，根据拟南芥测序数据库寻找和发现新的具有自主知识产权的功能基因是国际植物学研究领域的热点之一。利用突变技术研究基因功能已成为一种有效的方法，通过对突变体的研究，发现了一些耐硒基因的功能，如AtGPX， AtHMT，APS等，这些基因在突变体和野生型中的转录水平不一样。目前定位出的耐硒基因还非常有限，我们从化学诱导型激活标签子系统构建的拟南芥突变体库中筛选到功能获得性耐硒及增加硒吸收的突变体vsel，克隆获得具有耐硒功能的基因VSEl，基因转录水平分析显示，在硒盐胁迫条件下，其转录水平提高。为此，我们研究了该基因功能，并在分子生物学水平上阐明了该基因耐硒胁迫的机理。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白及其编码基因，本发明所提供的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因VSE1，来源于哥伦比亚野生型的拟南芥(Col-O)，其蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质，氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID No :2所示或是将SEQ ID No :2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID No :2限定的蛋白质具有相同活性的由SEQ ID No 2衍生的氨基酸残基序列。序列表中的序列2由250个氨基酸残基组成。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。VSEl的编码基因也属于本发明的保护范围。VSEl的cDNA基因，选自下述核甘酸序列之一；(I)序列表中 SEQ ID No 1 的 DNA 序列；(2)编码序列表中SEQ ID No 2蛋白质序列的多核苷酸；(3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列杂交的核甘酸序列；(4)与序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列具有90%以上同源性、且编码相同功能蛋白质的DNA序列。序列表中的序列I由1269个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5’端第446 位至1876位喊基，编码序列SEQ ID No 2的蛋白质。含有本发明VSEl的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增 VSEl中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。本发明的第二个目的是提供一种利用该基因增强植物对硒耐受性及增加植物中硒含量的方法。本发明所提供的增强植物对硒耐受性及增加硒含量的方法，是抑制植物耐硒及增加植物硒含量相关蛋白编码基因的表达，该表达可通过多种方法实现。本发明抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制VSEl表达即可。利用任何一种植物基因敲除技术，将此基因敲除后，植物表现为耐硒性状；利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的VSEl转入野生型植物中，植物就表现出对硒非耐受。本发明利用正向遗传学手段从化学诱导型激活标签子系统构建的突变体库中筛选并通过表型和生理生化鉴定得到功能获得型耐硒突变体vsel，用经典的CTAB法提取 vsel基因组DNA，再通过Tail-PCR获得耐硒基因VSE1，后经上海生工生物工程有限公司测序鉴定并在TAIR数据库中进行序列比对，最后进行基因定位，获得一个新的耐硒基因。构建了 VSEl基因的过量表达载体，并导入根癌农杆菌C58菌株中，用花絮浸溃法进行拟南芥植株的遗传转化，并用抗生素筛选转化株，以期观察该转基因植株在硒胁迫下的表型，并研究其功能。本发明的VSEl基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以植物耐硒症状来筛选转化植株。携带有本发明VSEl基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。本发明的植物耐硒相关基因为农作物耐硒育种提供基因与技术的支持。下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
图1是本发明以40mg/LNa2Se03作为筛选的临界浓度，获得耐硒突变体vsel图2是本发明突变体vsel和野生型植株在土培条件下生长状况比较图3是本发明突变vse 1在不同Na2Se03浓度下发芽率比较图4是本发明突变体vsel和野生型植株对硒盐耐受性比较图5是本发明vsel和野生型主根长、鲜重、蛋白质、GSH_Px、APX、硒含量等比较图6是本发明vsel突变体在硒盐胁迫下相关基因的表达图7是本发明T-DNA插入位点图谱分析图8是本发明VSE1基因基因表达模式分析
具体实施例方式
下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。实施例1、VSE1基因的获得利用正向遗传学手段从化学诱导型激活标签子系统构建的突变体库中通过对野 生型和突变体拟南芥在20mg/L、30mg/L和40mg/L三个Na2Se03浓度梯度选择培养基中进行 培养，在40mg/L Na2Se03浓度下，WT完全不能存活而突变体有三株能够生长，得到疑似耐硒 突变体，并通过表型和生理生化鉴定得到功能获得型耐硒突变体vsel，用经典的CTAB法提 取vsel基因组DNA，以提取出来的DNA为模板，进行如下Tail-PCR反应20iil反应体系， 内含10XPCR缓冲液、dNTPs(2. 5mM)混合物、巢式引物(2 u M)和随机引物(50yM)、Taq酶 (5U/iU)，其余加双蒸水至 20iU。其中，巢式引物 1 :LexA2、LexA3、LexA4、LexA5、LexA6 以 及随机引物2 :AD1、AD2、AD3、AD4见表一。Tail-PCR所用的引物序列
权利要求
1.一种植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白，其特征在于氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID No 2所示或是将SEQ ID No 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID No 2限定的蛋白质具有相同活性的由SEQ ID No 2衍生的氨基酸残基序列。
2.权利要求I所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因，其特征在于 选自下列核苷酸之一(1)序列表中SEQID No I的DNA序列；(2)编码序列表中SEQID No 2蛋白质序列的多核苷酸；(3)在高严谨条件下与SEQID No 1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；(4)与SEQID No :1限定的DNA序列具有90%以上同源性、且编码相同功能蛋白质的 DNA序列。
3.根据权利要求2所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因，其特征在于，所述基因序列的开放阅读框架为SEQ ID No 2自5’端第446位至1876位碱基。
4.含有权利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因序列的载体。
5.含有权利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因序列的转基因细胞系。
6.含有权利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因序列的宿主菌。
7.一种增强植物对硒耐受性及增加植物中硒含量的方法，其特征在于是抑制植物中如权利要求2所述的耐硒及增加植物硒含量相关蛋白编码基因的表达。
8.根据权利要求7所述的一种增强植物对硒耐受性及增加植物中硒含量的方法，其特征在于抑制植物中耐硒相关蛋白编码基因表达的方法包括植物病毒载体介导基因沉默的方法，或者反义核酸技术沉默基因的方法，或者SiRNA介导的基因沉默方法。
9.权利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因在增强植物对硒耐受性及增加植物中硒含量的应用。
全文摘要
本发明公开了一种植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白及其编码基因与应用。植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白是序列表中SEQ ID No2，其编码基因是序列表中SEQ ID No1 DNA序列。本发明所提供的增强植物耐硒及增加植物中硒含量的方法，是抑制植物中的上述植物耐硒及增加植物中硒含量相关蛋白编码基因的表达。为农作物耐硒育种提供基因与技术支持。
文档编号C07K14/415GK102603877SQ20121004484
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者卢云峰, 慈凌坤, 曹树青, 江力 申请人:合肥工业大学