专利名称：基因重组vpac2受体特异激动剂dbayl及其制备方法与应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种基因重组VPAC2型受体特异激动剂 DBAYL及其制备方法，与其用于制备治疗VPAC2型受体相关疾病的药物，如促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌，提高机体对高浓度血糖的应急能力，有效降低血糖浓度，保护胰腺β细胞功能、增加β细胞数量和抑制β细胞凋亡及调节免疫系统功能等作用。
背景技术：
垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)是1990年被发现由脑垂体分泌的具有重要生物学功能的神经多肽，是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成员。PACAP有两种存在形式PACAP38，由38个氨基酸组成；PACAP27，由PACAP38氮端的27个氨基酸组成。PACAP通过激活其特异的G蛋白偶联受体，提高靶细胞cAMP等第二信使的浓度，从而发挥广泛而重要的生物学功能。PACAP有三类G蛋白偶联受体PAC1、VPAC1和VPAC2 ；三类受体在生物体中分布不同，所起的作用也不相同。其中VPAC2型受体分布于胰岛等组织，与能量代谢密切相关，从临床观点看，作为VPAC2型受体特异激动剂的特定PACAP衍生物可有效地降低血液葡萄糖水平，保护β-细胞功能及阻止疾病发展的潜力，且无低血糖症风险，可用于糖尿病的任何病期，作为具有广泛作用的神经多肽，对于二期和三期糖尿病患者具有优于其他药物的综合治疗作用，为公认的治疗II型糖尿病的新型药物。PACAP与VPAC2受体作用主要与腺苷酸环化酶(AC)藕联通过cAMP信号传导通路，激活AC，催化ATP转化为cAMP，cAMP随之激活其依赖性蛋白激酶A (PKA)，PKA可使细胞内多种蛋白质磷酸化，产生生理效应，尤其是在促进相关基因转录有重要作用。PACAP通过 VPAC2受体介导的生物学功能主要有神经递质/调质、促进激素分泌，调节内分泌平衡；调节性腺功能和生殖细胞的产生；调节能量代谢平衡等。研究表明，VPAC2型受体特异激动剂可有效促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌，提高机体对高浓度血糖的应急能力有效降低血糖浓度，保护胰腺β细胞功能、增加β细胞数量和抑制β细胞凋亡。但PACAP及其许多衍生物，如ΒΑΥ55-9837等，在体内很快被二肽基肽酶IV (DPPIV)降解；而且由于自身结构中含有影响其液体环境中稳定性的氨基酸组成， 许多药物肽在生物体内稳定性较差。因此，研发生理环境下新型高稳定性VPAC2受体特异激动剂是PACAP及其衍生多肽用于II型糖尿病治疗及临床应用急待解决的问题，研发作为 VPAC2型受体特异激动剂的高稳定性PACAP衍生多肽，具有重要的药用价值。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有更高稳定性和更高生物活性的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL。本发明的另一目的在于提供所述基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的制备方法。该制备方法根据PACAP衍生多肽DBAYL的氨基酸序列及大肠杆菌密码子的偏好性，设计DBAYL在原核表达系统的基因序列，采用基因工程技术，结合蛋白内含肽(intein)的可诱导剪切功能实现目的多肽DBAYL的高效制备；该制备方法生产效率高，生产成本低。本发明的再一目的在于提供所述基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种基因重组VPAC2型受体特异激动剂 DBAYL，其氨基酸序列如下所示MHSDAVFTDQYTRLRKQLAAKKYLQSLKQKRY ；编码所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的苷酸序列为 ATGCATAGCGATGCGGTGTTTACCGATCAGTATACCCGTCTGCGTAAACAGCTGGCGGCGAAAAAATAT CTGCAGAGCATTAAACAGAAACGTTAT ；所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的制备方法，包括以下步骤(1)设计并合成DBAYL基因采用3条引物两步法合成DBAYL基因引物Fl:5，-GGTGGT CATATG' CATAGCGATGCGGTGTTTACCGATCAGTATACCCGTCTGCGTAAA-3，；引物F2:5’ -CAGATATTTTTTCGCCGCCAGCTGTTTACGCAGACGGGT-3，；引物F3:5 ’ -CCACCA TGCTCTTCCGCA ATAACGTTTCTGTTTAATGCTCTGCAGATATTTTTT-3 ’ ；其中，GGTGGT或 CCACCA 为保护碱基,CATATG为 NdeI 酶切位点，TGCTCTTCCGCA 为SapI酶切位点；首先将引物Fl和引物F2进行链延伸反应，然后以其产物为DNA模板，以Fl和F3 为引物，PCR反应制得DBAYL基因；(2)构建重组载体 pKY-DBAYL 用Ndel酶和Sapl酶分别对质粒pKYB和步骤(1)制得的DBAYL基因进行双酶切， 再将双酶切后的DBAYL基因和双酶切后的质粒pKYB连接，得到重组载体pKY-DBAYL ；(3)制备表达工程菌 pKY-DBAYL/ER2566 用重组载体pKY-DBAYL转化表达宿主菌大肠杆菌E coli Strain ER2566，得到表达工程菌 pKY-DBAYL/ER2566 ；(4)表达和纯化①诱导表达工程菌pKY-DBAYL/ER2566表达由目的多肽、蛋白内含肽和几丁质结合域(Chitin binding domain，CBD)组成的“三元”融合蛋白；②得到的“三元”融合蛋白用几丁质柱进行纯化，“三元”融合蛋白吸附于几丁质柱中，然后含有硫醇的溶液过柱并充满几丁质柱环境中，反应；硫醇的作用是诱导蛋白内含肽的N端切割，释放目的多肽C端硫酯；接着洗脱几丁质柱，得到目的多肽C端硫酯，透析目的多肽C端硫酯，从而产生稳定的水解产物；③利用高效液相色谱技术纯化目的多肽，得到基因重组VPAC2型受体特异激动剂 DBAYL0步骤(1)中所述的链延伸反应的条件优选为94°C IOmin;降至58°C 5min;72 0C IOmin ；步骤(1)中所述的PCR反应的条件优选为95°C 5min ；95°C lmin、55°C lmin、 72°C lmin, 32 个循环；72°C延伸 IOmin ；步骤(4)②中所述含有硫醇的溶液的组成如下20mM Tris_HCI，0. 5M NaCl,lmM EDTA，50mM3 -巯基乙醇，pH 8.0;步骤⑷②中所述反应的条件优选为25V反应M小时；步骤(4)②中所述洗脱几丁质柱的溶液的组成优选如下20mM Tris-HCl, 500mM NaCI，ImM EDTA,pH 8. 0 ；步骤(4)③中所述利用高效液相色谱技术纯化目的多肽DBAYL的步骤如下A、流动相A为在体积百分比5%乙腈(CNCH3,溶质为纯水)中添加三氟乙酸(TFA) 得到，TFA的终浓度为体积百分比0. 1% ；流动相B为100%乙腈(CNCH3)中添加三氟乙酸 (TFA)，TFA的终浓度为体积百分比0. 1% ；流速lmL/min，25min线性梯度洗脱；B、线性梯度洗脱中流动相B由0 60% (ν/ν)，收集目的多肽洗脱峰，光吸收检测波长为218nm ；并进行质谱鉴定。所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL应用于制备治疗如下疾病的药物糖尿病及其并发症，高血糖症，高血压，血栓症，肥胖症、心血管疾病、神经系统疾病、心脏及肾衰竭。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(1)本发明所制备的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL，是PACAP衍生多肽，与野生型PACAP相比，在其N端多了一个甲硫氨酸，并具有特殊的氨基酸序列，即在C端通过巯酯键结合硫醇，成为多肽硫酯，多肽硫酯可以水解产生天然的羧基端，也可特异水解成为硫代羧酸。(2)该VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的氨基酸序列不同于其他与PACAP同源或非同源的VPAC2型受体特异激动剂，与BAY55-9837的区别点在于突变原BAY55-9837的第九位氨基酸天冬酰胺(N)为谷氨酰胺⑴)，突变原BAY55-9837的第十七位氨基酸缬氨酸 (V)为亮氨酸(L)，突变原BATO5-9837的第二十八位氨基酸天冬酰胺(N)为谷氨酰胺⑴)。这些区别使得DBAYL在生理环境中具有更高的稳定性和对VPAC2受体更高的特异激活活性，与VPAC2受体特异结合后，促进胰岛素的产生和分泌，保护胰腺β细胞功能、增加β细胞数量和抑制β细胞凋亡，并激活胰岛素受体信号通路，从而发挥治疗II型糖尿病的功效。(3)本发明所制备的高稳定性VPAC2型受体特异激动剂DBAYL在治疗糖尿病及其并发症，高血糖症，高血压，血栓症，肥胖症、心血管疾病、神经系统疾病、心脏及肾衰竭疾病中有显著的疗效。(4)利用本发明所述的制备方法得到的重组多肽DBAYL的稳定性比化学合成 DBAYL多肽提高约7倍，比化学合成ΒΑΥ55-9837多肽的稳定性提高约25倍。本发明的表达方法效率高、成本低，应用前景广阔。
图1为重组多肽DBAYL的制备示意图。
图2为DBAYL基因合成及重组表达质粒pKY_DBAYL构建示意图；图中MCS_多克隆位点；CBD-几丁质结合结构域；intein-内含肽。图3为SDS-PAGE检测融合蛋白htein-CBD-DBAYL表达的鉴定图；其中，泳道1是 IPTG诱导前菌体破碎上清液；泳道2是IPTG诱导后菌体破碎上清液。图4为制备的重组多肽DBAYL的飞行质谱鉴定图。图5为重组多肽DBAYL与BAY55-9837的稳定性比较与检测结果图。图6为重组多肽DBAYL/BAY55-9837和[125I]PACAP38对VPAC2受体的竞争性结合检测结果图。图7为重组多肽DBAl与BAY55-9837促进CH0-VPAC2细胞cAMP生成的活性测定
结果图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的制备基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的制备过程如图1所示，具体步骤如下(1) DBAYL编码序列的获得按照大肠杆菌的密码偏好性设计编码DBAYL的cDNA，设计3条引物，采用两步法获得该序列(如图2所示)引物Fl:5， -GGT GGT CAT ATG CAT AGC GAT GCG GTG TTT ACC GAT CAG TAT ACC CGT CTGCGT AAA-3，；引物F2:5' -CAG ATA TTT TTT CGC CGC CAG CTG TTT ACG CAG ACG GGT-3'；引物F3:5’ -CCA CCA TGC TCT TCC GCA ATA ACG TTT CTG TTT AAT GCT CTG CAG ATA TTT TTT-3'；其中，GGT GGT或CCA CCA为保护碱基，CATATG为Nde I酶切位点，TGC TCT TCC GCA为SapI酶切位点；①链延伸反应反应体系为引物FK250yM/L)2y L，弓丨物 F2 Q50 μ M/L) 2 μ L， 10 X iTaKaRaBuffer (含有 4mmol/L MgCl2) 2 μ L, dNTP 2 μ L, H2O 11. 5 μ L，TaKaRa Taq 酶 0. 5μ L ；反应条件为94°C，IOmin；降至 58°C 5min ；72°C IOmin ；得到延伸反应液。②PCR 反应反应体系为以延伸反应液为DNA模板，引物Fl (25 μ M/L) 2 μ L，F3 (25 μ M/ L) 2 μ L，延伸反应液 1· 5 μ L，dNTP 2 μ L，10XTaKaRa Ex Buffer 2 μ L, TaKaRa Taq 酶0. 5μ L, H2O 10μ L ；反应条件为94"C 5min ；94 "C 30s, 55 "C 30s, 72 "C 30s, 32 个循环；72 °C 延伸 IOmin ；得到长度为12!3bp的PCR产物(2)构建重组载体pKY-DBAYL，如图2所示用NdeI和SapI进行酶切步骤(1)得到的PCR产物，利用PCR产物纯化试剂盒进行纯化(根据说明书进行操作)。纯化后的PCR产物先进行LguI (SapI的同功酶，Fermatas 产品)单酶切，酶切条件为在IXTango buffer反应体系中，1 μ g PCR产物加入15unit LguI (3 μ L), 37°C酶切4h ；LguI单酶切完成后，加入适量体积的10 X Tango buffer,使得反应体系成为 2 X Tango buffer 体系，加入 20unit NdeI (2 μ L, !^ermatas 产品)，37°C酶切4h ；质粒pKYB(New England Biolabs(NEB)公司)的双酶切=LguI (SapI 的同功酶)和 NdeI的双酶切条件同上。将双酶切后的DBAYL基因和双酶切后的质粒pKYB连接，连接体系和连接时间、大肠杆菌DH5ci (购自大连宝生物公司)感受态细胞的制作、转化以及筛选(卡那霉素)，根据 《分子克隆》进行操作。将DBAYL基因克隆到质粒pKYB的NdeI和SapI位点间，得到重组载体 pKY-DBAYL。(3)表达和纯化①将重组质粒pKY-DBAYL 转化表达宿主菌 E. coli Strain ER2566 (New England Biolabs (NEB)公司)，得到表达工程菌pKY_DBAYL/ER2566 ；挑取单克隆于5mL含50 μ g/mL 卡那霉素的Luria-Bertani (broth)培养基(简称LB培养基)，摇菌培养过夜，再扩大，以体积比为1 100的比例接于IL含50mg/L卡那霉素的LB培养基，37°C摇菌至OD600为0. 6，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))至终浓度0. 6mmol/L，37°C诱导表达6h。IOOOOrpm 离心 20min 收集菌体，将菌体重悬于60mL Buffer A溶液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCI, ImM EDTA, pH 8.0)中，然后用低温超高压连续流细胞破碎仪进行破碎，破碎条件为=BufferA溶液稀释菌体的浓度为18% (m/v)，破碎压力为1700bar，制冷温度为3°C。破碎产物在4°C，IOOOOrpm离心30min，收集上清，该上清称为破碎上清。SDS-PAGE 检测融合蛋白Intein-CBD-DBAYL的表达，鉴定结果如图3所示。取25mL几丁质珠(NEB公司产品#S6651L)装填4. 5X 20cm层析柱，以10倍柱体积的BufferA溶液洗柱；破碎上清以0. 5mL/min的流速上注；用10倍柱体积的Buffer A溶液以2mL/min过柱，以洗去杂蛋白或未亲和结合的融合蛋白，用80mL Buffer B溶液(20mM Tris-HCI,0. 5M NaCl，ImM EDTA，50mM β -巯基乙醇，pH 8.0)自然过柱，使β-巯基乙醇均勻分布并浸泡柱内填料，然后封闭进、出口端，上述反应体系在25°C反应Mh，以诱导蛋白内含肽的N端切割，释放目的多肽C端硫酯。用Buffer A溶液洗脱并用洁净的烧杯收集目的多肽溶液C端硫酯，4°C透析过夜除去β -巯基乙醇并使目的多肽C端硫酯水解，再经高效液相色谱(HPLC)纯化、制备得到纯度为质量百分比96%以上的重组多肽DBAYL，目的多肽的制备条件为流动相A[在体积百分比5%乙腈(CNCH3，溶质为纯水)中添加三氟乙酸 (TFA)得到，TFA的终浓度为体积百分比0. ]，流动相Β[100%乙腈(CNCH3)中添加三氟乙酸(TFA)，TFA的终浓度为体积百分比0. ]，流速lmL/min，25min线性梯度洗脱，线性
8梯度洗脱中流动相B由0 60 % (ν/ν)，收集目的多肽洗脱峰，光吸收检测波长为218nm。 目的多肽DBAYL的纯度通过分析性HPLC测定(条件同目的多肽的制备条件)。制备的高稳定性VPAC2型受体特异激动剂DBAYL利用质谱技术鉴定(如图4所示)，质谱检测分子量为 3. 916kDa.，与其理论值相符合。实施例2重组肽DBAYL (即实施例1制备的DBAYL)的体外稳定性测定重组肽DBAYL、化学合成DBAYL(与重组肽DBAYL相比，其N端无甲硫氨酸)和 BAY55-9837 (Tocris Bioscience 公司产品 #2711)以终浓度 lmg/ml 分别溶解在 2OmM 磷酸钠缓冲液(PH 8.0，含150mM氯化钠)，37°C水浴锅中孵育，在不同的时间点取样，利用液相色谱-质谱联用技术(LC-MQ检测多肽在水溶液环境中随时间的存留量，以确定重组肽DBAYL在体外水溶液环境中的稳定性，结果如图5所示孵育1周时，BAY55-9837消减35. 2%，孵育2周时，BAY55-9837消减75. 1%，孵育3周和4周时，BAY55-9837分别消减88. 9%和96. 7% ；化学合成DBAYL多肽在孵育2周时，消减25. 8%，孵育4周时，消减 51.6% ；而重组肽DBAYL在孵育2周时，仅消减2.5%，孵育4周时，仅消减7.7%。实验结果统计学处理表明，重组肽DBAYL的体外半衰期约为BAY55-9837的25倍，约为化学合成 DBAYL多肽的7倍。实施例3重组肽DBAYL对VPAC2受体的竞争性结合活性测定VPAC2-CH0细胞Qnvitrogen公司)接种至12孔板上培养，实验前2h，用0. 5mL无血清Ham’ s F-12培养基洗涤细胞两次。然后，细胞用含2% (mg/ml)牛血清白蛋白(BSA) 和IOmM葡萄糖的Ham，s F-12培养液4°C培养过夜，培养液中加入0. InM[125I]PACAP38和待测多肽(即为BAY55-9837或重组肽DBAYL)，并逐步提高待测多肽浓度(10_"Μ 。 培养完毕后，弃掉上清液，用冰冷PBS (0. 01Μ, ρΗ值为7. 4)洗细胞3次，细胞在室温下用 0. 5mL 0. 5M NaOH和0. 1 % (mg/ml) SDS混合lOmin，然后用、计数法测定细胞裂解物放射量，计算重组肽 DBAYL 或 BAY55-9837 的半抑制量(IC50，half-maximal inhibitory concentration)，每组实验重复3次。实验结果如图6，BATO5-9837对VPAC2受体的半抑制量IC50为68. 3士8. InM ；重组肽DBAYL对VPAC2受体的半抑制量IC50为48. 4士6. 9nM ；结果表明，重组肽DBAYL对VPAC2 受体的竞争性结合活性高于VPAC2受体特异激动剂BAY55-9837。实施例4 重组肽DBAYL促进VPAC2-CH0细胞cAMP生成的活性测定取对数生长期的VPAC2-CH0细胞，PBS (0. 01M, ρΗ值为7. 4)洗2次，调整细胞悬液浓度为ι χ lOVmL,分别加入相同浓度的多肽DBAYL或BAY55-9837 (Tocris Bioscience 公司产品#2711)，调节多肽的浓度至KT11M 10_%，371温育201^11。再将分别被多肽 DBAYL和BAY55-9837作用过的各100 μ L细胞悬浮液与200 μ L 0. 2Μ HCl溶液混合，室温放置20min，tip头吹打溶解细胞并混勻，1500g离心lOmin，吸取上清按Cyclic AMP Enzyme Immunoassay Kit 说明测定 cAMP 的量。实验结果如图7，BAY55-9837对VPAC2受体的半激活浓度EC50 (half-maximal stimulatory concentration)为 1. 10士0. 23nM ；多肽 DBAYL 对 VPAC2 受体的半激活浓度EC50为0. 68士0. 2InM ；结果表明，多肽DBAYL对VPAC2受体的选择性激活活性明显高于 BAY55-9837o实施例5重组多肽DBAYL对ICR小鼠血糖及胰岛素水平的影响正常雄性ICR小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号 SCXK[京]2002-000 按体重均分为3组，正常对照组、BAY55-9837组(50 μ g/kg)、重组肽 DBAYL组(50 μ g/kg)。动物禁食过夜(1池)，取空腹血(Omin)后，腹腔注射给药，正常对照组注射生理盐水，分别于给药后15min灌胃给予葡萄糖溶液(2g/kg)，并在给糖后20min时取血，用OneTouch Ultra Meter血糖仪(Johnson公司)测定血糖值，利用RIA kit (Linco Research公司)测定胰岛素水平。实验结果如表1所示重组肽DBAYL可有效促进胰岛素的分泌和明显降低葡萄糖依赖的血糖水平，效果明显优于BAY55-9837。表IICR小鼠血糖及胰岛素水平检测
权利要求
1.一种基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.根据权利要求1所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL，其特征在于编码所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.权利要求1或2所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)设计并合成DBAYL基因采用3条引物两步法合成DBAYL基因引物Fl 5’ -GGTGGT CATATG CATAGCGATGCGGTGTTTACCGATCAGTATACCCGTCTGCGTAAA-3 ’ ；引物F2 5' -CAGATATTTTTTCGCCGCCAGCTGTTTACGCAGACGGGT-3’ ；引物F3 5，-CCACCA TGCTCTTCCGCA ATAACGTTTCTGTTTAATGCTCTGCAGATATTTTTT-3'；其中，GGTGGT或CCACCA为保护碱基，CATATG为NdeI酶切位点，TGCTCTTCCGCA为 SapI酶切位点；首先将引物Fl和引物F2进行链延伸反应，然后以其产物为DNA模板，以Fl和F3为引物，PCR反应制得DBAYL基因；(2)构建重组载体pKY-DBAYL用Ndel酶和Sapl酶分别对质粒pKYB和步骤(1)制得的DBAYL基因进行双酶切，再将双酶切后的DBAYL基因和双酶切后的质粒pKYB连接，得到重组载体pKY-DBAYL ；(3)制备表达工程菌pKY-DBAYL/ER2566用重组载体pKY-DBAYL转化表达宿主菌大肠杆菌E coli Strain ER2566，得到表达工程菌 pKY-DBAYL/ER2566 ；(4)表达和纯化①诱导表达工程菌PKY-DBAYL/ER2566表达由目的多肽、蛋白内含肽和几丁质结合域组成的“三元”融合蛋白；②得到的“三元”融合蛋白用几丁质柱进行纯化，“三元”融合蛋白吸附于几丁质柱中， 然后含有硫醇的溶液过柱并充满几丁质柱环境中，反应；硫醇的作用是诱导蛋白内含肽的 N端切割，释放目的多肽C端硫酯；接着洗脱几丁质柱，得到目的多肽C端硫酯，透析目的多肽C端硫酯，从而产生稳定的水解产物；③利用高效液相色谱技术纯化目的多肽，得到基因重组VPAC2型受体特异激动剂 DBAYL。
4.根据权利要求3所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的链延伸反应的条件为94°C IOmin ；降至58°C 5min ；72°C IOmin0
5.根据权利要求3所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的PCR反应的条件为95°C 5min ；95°C lmin、55°C lmin、72°C lmin， 32个循环；72°C延伸IOmin。
6.根据权利要求3所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的制备方法，其特征在于步骤(4)②中所述含有硫醇的溶液的组成如下20mMTris-HCI，0. 5M NaCl, ImM EDTA，50mM3 -巯基乙醇，pH 8.0;步骤(4)②中所述反应的条件为25V反应M小时；步骤⑷②中所述洗脱几丁质柱的溶液的组成如下20mM Tris-HCl,500mMNaCI,lmM EDTA, pH 8· 0。
7.根据权利要求3所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的制备方法，其特征在于步骤(4)③中所述利用高效液相色谱技术纯化目的多肽DBAYL的步骤如下Α、流动相A为在体积百分比5%乙腈中添加三氟乙酸得到，三氟乙酸的终浓度为体积百分比0. 1% ；流动相B为100%乙腈中添加三氟乙酸得到，三氟乙酸的终浓度为体积百分比0. ；流速lmL/min,25min线性梯度洗脱；B、线性梯度洗脱中流动相B由体积百分比0 60%，收集目的多肽洗脱峰，光吸收检测波长为218nm ；并进行质谱鉴定。
8.权利要求1或2所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL的应用，其特征在于所述的基因重组VPAC2型受体特异激动剂DBAYL用于制备治疗如下疾病的药物糖尿病及其并发症，高血糖症，高血压，血栓症，肥胖症、心血管疾病、神经系统疾病、心脏及肾衰竭。
全文摘要
本发明公开了一种如SEQ ID NO.1所示基因重组VPAC2受体特异激动剂DBAYL及其制备方法与应用。通过关键氨基酸突变得到的DBAYL，与现有VPAC2型受体特异激动剂相比，在血液中具有更高的稳定性和生理活性，显著提高了其对VPAC2型受体的特异激活活性。该激动剂DBAYL对VPAC2受体的特异性半激活浓度EC50为0.68±0.21nM(BAY55-9837的EC50为1.10±0.23nM)，表明其对VPAC2型受体的选择性激活活性明显高于BAY55-9837，且实验证明该重组激动剂DBAYL的体外半衰期约为BAY55-9837的25倍，约为化学合成DBAYL多肽的7倍，表明其稳定性显著高于BAY55-9837。该重组激动剂DBAYL可应用于制备具有如下功能的药物治疗糖尿病及其并发症，治疗高血糖症，治疗高血压，治疗血栓症，治疗肥胖症、心血管疾病等。
文档编号C07K14/47GK102558335SQ201210005129
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者洪岸, 马义 申请人:暨南大学