专利名称：用于递送白介素-1受体拮抗剂的方法和组合物的利记博彩app
用于递送白介素-1受体拮抗剂的方法和组合物引言本发明技术涉及包含白介素-1受体拮抗剂的组合物，以及产生、分离和施用此类组合物的方法。白介素-1 (IL-1)包括能够刺激淋巴细胞和巨噬细胞、活化吞噬细胞、增加前列腺素产生、促使骨关节退化、增强骨髓细胞增殖并参与许多慢性炎性病症的细胞因子家族。IL-1能够由巨噬细胞、单核细胞和树突细胞产生，并可作为针对感染的炎性应答的一部分。IL-1的作用模式可由白介素-1受体拮抗剂蛋白(IL-1ra ;也称为“IRAP”)介导。IL-1ra与IL-1结合细胞表面上的相同受体，由此阻止IL-1向该细胞发送信号。如ArendWPjMalyak M,Guthridge CJ,Gabay C(1998)" Interleukin-1receptor antagonist:rolein biology " Annu.Rev.1mmunol.16:27-55中所述，IL-1ra由白细胞包括单核细胞、巨嗤细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞(PMN)和其他细胞分泌，并可调节多种IL-1相关的免疫和炎性应答。IL-1ra的产生是受几种物质包括粘附的免疫球蛋白G(IgG)、其他细胞因子以及细胞或病毒组分刺激。IL-1ra在关节炎、结肠炎和肉芽肿性肺病中是一种重要的天然抗炎蛋白。IL-1ra可以用于治疗类风湿性关节炎(IL-1在其中起关键作用的一种自身免疫病)，减少与该疾病相关 的炎症和软骨降解。例如，Kineret (阿那白滞素)是IL-1ra的非糖基化重组形式(Amgen Manufacturing,Ltd.,Thousand Oaks,California)。2003 年 7 月29日授权的Sommer等人的美国专利号6，599，873、1991年12月24日授权的Hannum等人的美国专利号5，075，222以及2005年9月8日公布的Mellis等人的美国专利申请公布号2005/0197293中描述了多种重组白介素-1抑制剂和治疗方法。此外，2003年9月23日授权的Reincke等人的美国专利号6，623，472、2004年3月30日授权的Reincke等人的美国专利号6，713，246以及2004年7月6日授权的Reincke等人的美国专利号6，759，188中描述了从体液产生IL-1ra的方法，包括使用自体液体。使用IL-1ra的组合物和方法为本领域所熟知。例如，如2000年8月I日授权的Collins等人的美国专利号6，096, 728中所述，IL-1ra已作为与透明质酸的组合物的一部分递送。不过，许多此类方法和组合物带有有关IL-1ra的稳定性和半衰期以及所提供IL-1ra的数量和速率的问题。因此，递送IL-1ra的改进的组合物和方法是期望的，会有助于治疗由白介素-1受体介导的症状和病理，包括炎症的管理。概述本发明技术提供关于白介素-1受体拮抗剂，产生白介素-1受体拮抗剂，和向患者施用白介素-1受体拮抗剂以治疗由白介素-1受体介导的病症、诸如炎症的组合物、设备和方法。用于产生白介素-1受体拮抗剂的方法包括将包含白细胞的液体与固态提取材料接触。该液体可以是全血、骨髓穿刺液(bone marrow aspirate)、脂肪组织、其级分(例如，富含血小板的血浆)、和其混合物。固态提取材料可包括诸如玻璃、矿物、聚合物、金属或多糖的材料，其中这些材料可以以珠、纤维、粉末、和/或多孔材料的形式。接触可包括将液体与固态提取材料培养从约30秒至约24小时的时间段。然后可从固态提取材料分离溶液，其中溶液中白介素-1受体拮抗剂的浓度大于接触步骤之前液体中白介素-1受体拮抗剂的浓度。用于产生白介素-1受体拮抗剂的方法还包括将包含白细胞的液体与固态提取材料接触，和对所述液体进行电磁场处理。然后从固态提取材料分离包含白介素-1受体拮抗剂的溶液。与固态提取材料接触和对所述液体进行电磁场处理的组合可比单独施加任一步骤导致白细胞产生更多的白介素-1受体拮抗剂或更快地产生白介素-1受体拮抗剂。例如，组合效应可在数分钟至多达约I小时中，产生与当包含白细胞的液体与固态提取材料接触达24小时而不经受电磁场时产生的大约相等量的白介素-1受体拮抗剂。可使用脉冲电磁场或电容耦合电磁场。溶液中所得的白介素-1受体拮抗剂浓度大于接触之前液体中白介素-1受体拮抗剂的浓度。提供了制备包含白细胞的液体的多种方式。一些方法包括离心组织诸如血液，以相对于全血增加白细胞和血小板的浓度。此类方法包括以下那些方法，其中将所述组织上样到试管中，所述试管包括在所述试管中布置的浮标，其中所述浮标具有的密度使得所述浮标可被操作以在所述试管中的所述组织被离心后到达平衡位置，所述位置在白细胞级分与第二级分之间，所述白细胞级分具有大于所述第二级分中白细胞浓度的白细胞浓度。其他方法包括混合包含白细胞的组织或组织级分和与可被操作以结合单核白细胞的抗体偶合的磁珠。然后收集被所述抗体结合的单核白细胞，用作所述包含浓缩的白细胞的液体。其他方法包括将包含白细胞的组织或组织级分通过尺寸排阻滤器。本发明方法的结果提供白介素-1受体拮抗剂的组合物和溶液。白介素-1受体拮抗剂的溶液可包含白介素-1受体拮抗剂(例如，至少约30，000pg/mL)、可溶性肿瘤坏死因子受体、活的白细胞、和/或生长因子。例如，溶液中血浆蛋白的总浓度可以是至少约80mg/mL。提供了治疗人类或动物受治疗者的炎症的方法，包括向炎症部位施用白介素-1受体拮抗剂的溶液，其中所述溶液是使用本发明方法制备的。例如，治疗方法可用于人类或动物受治疗者的炎症、诸如与在人工关节植入物部位的磨屑相关的骨质溶解，或其中所述炎症与骨关节炎相关。
图1为根据本发明技术的一个实施方案产生富含IL-1ra的溶液的一种方法的图解说明。图2为根据本发明技术的一个实施方案产生富含IL-1ra的溶液的另一种方法的图解说明。图3为根据本发明技术的一个实施方`案产生富含IL-1ra的溶液的另一种方法的图解说明。图4为根据本发明技术的一个实施方案用于分离包含白细胞的液体的代表性装置的部分横断面剖视图。图5A和5B为根据本发明技术的一个实施方案用于将一定体积的白细胞与聚丙烯酰胺珠培养的代表性装置的横断面剖视图。
图6为根据本发明技术的一个实施方案产生富含IL-1ra的溶液的另一种方法的图解说明。图7为根据本发明技术的一个实施方案产生富含IL-1ra的溶液的另一种方法的图解说明。图8为根据本发明技术的一个实施方案产生富含IL-1ra的溶液的另一种方法的图解说明。图9A和9B分别为可用在本发明技术的方法中的血液组分分离装置的等距视图(isometric view)和部分横断面剖视图。图10为根据本发明技术的一个实施方案施用IL-1ra的方法的图解说明。图11为根据本发明技术的一个实施方案用于施用IL-1ra的代表性装置的部分横断面剖视图。应当注意的是，本文所列附图旨在举例说明本发明技术中材料、装置和方法的一般特征，其目的是为了描述一些实施方案。这些附图可以未必准确反映任何给定实施方案的特征，并且不一定旨在完全限定或限制本发明技术范围内的具体实施方案。详述
以下描述技术的性质仅为对一个或多个发明的主题、生产和使用进行示例，并非旨在限制本申请中或可要求本申请优先权的其他申请或其授权专利中要求保护的任何具体发明的范围、应用或用途。意为帮助理解本发明技术的对术语和短语的非限制性的讨论在本详述的结尾提供。本发明技术涉及产生、使用和包括白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)的组合物、设备和方法。参考图1，以图解方式显示了用于产生富含白介素-1受体拮抗剂的溶液的方法100。将包含白细胞的液体体积110与固态提取材料120接触，如在130所示。电磁场用于刺激细胞，如在140所示。接触130和刺激140产生富含IL-1ra的溶液，如在150所示。然而，在一些实施方案中，包含白细胞的液体不被电磁场刺激或不经受电磁场；即，省略了步骤140。当包含白细胞的液体不经受电磁场时，步骤130直接进行到步骤150，如箭头160所示。在150的富含IL-1ra的溶液可用于治疗炎症。富含IL-1ra是指该溶液比相等体积的全血包含更大量的IL-lra。将包含白细胞的液体110与固态提取材料120接触140连同电磁场刺激140比单独进行接触130或刺激140可更快地产生IL-1ra和/或可产生更大量的IL_lra。例如，将包含白细胞的液体暴露于电磁场可加速白细胞与固态提取材料接触后蛋白产生的速率。在一些情形中，本发明方法可在小于I小时内提供富含IL-1ra的溶液，而产生IL-1ra的其他方法可花费从约4至约24小时来产生相等的量。再次参考图1，包括步骤130和140的方法比绕开步骤140的如箭头160所示的方法可以更快的速率产生IL-1ra和/或可产生更多 IL-1ra0因此，本发明方法可提供比其他方法更快和/或更大量的IL-1ra产生。例如，本发明技术可比2003年9月23日授权的Reincke等的美国专利号6，623，472 ；2004年3月30日授权的Reinecke等的美国专利号6，713，246 ;和2004年7月6日授权的Reinecke等的美国专利号6，759，188中所述的方法；和Higgins等的美国专利申请公布号2010/0055087,Higgins等的美国专利申请公布号2009/0220482和Higgins等的PCT申请公布号W0/2009/108890中所述的方法更快和/或更大量地产生IL_lra。不限于本发明技术的机制、效用或功能，固态提取材料表现为由白细胞产生IL-1ra的激活物。类似地，与仅与固态提取材料接触的白细胞相比，白细胞的电磁刺激表现为增加IL-1ra产生的速率和/或产生的IL-1ra的量。以这种方式，本发明方法的接触和刺激表现为以协同方式起作用来产生富含IL-1ra的溶液。如图1的步骤130所示，包含白细胞的液体110与固态提取材料120接触。包含白细胞的液体110可以是全血、骨髓穿刺液、脂肪组织、其级分、和其混合物。例如，富含血小板的血浆是可包括白细胞的全血级分。骨髓穿刺液还包括浓缩的骨髓穿刺液，可通过从骨髓穿刺液去除液体来制备。包含白细胞的液体还可包括包含浓缩的白细胞的液体，其是指具有大于全血中白细胞浓度的白细胞浓度的液体。浓缩的白细胞可通过混合包含白细胞的组织或组织级分和与可被操作以结合单核白细胞的抗体偶合的固态支撑物诸如磁珠来制备。例如，包含白细胞的组织或组织级分可以是全血、骨髓穿刺液、脂肪组织、其级分、和其混合物。然后收集被抗体结合的单核白细胞(例如，用磁体保留)，而除去和/或洗去带有未结合的细胞或其他组织成分的液体。结合的或保留的白细胞提供浓缩的白细胞。实例包括可与固态支撑物诸如磁珠偶合的抗体，其中该抗体与支撑物直接偶合或经由一种或多种分子诸如二抗或其他亲和性配偶来偶合。在一些实施方案中，选择性结合白细胞的特异性结合元件(例如，抗体)用于通过磁力捕获从样品收集白细胞。优选地，特异性结合元件用于为了直接捕获而包被磁珠，或以生物素化形式使用为了由链霉素包被的磁珠间接捕获白细胞。选择性结合白细胞的特异性结合元件可以是结合白细胞但不明显结合其他细胞诸如红细胞的抗体。实例包括针对⑶3、⑶I lb、⑶14、⑶17、⑶31、⑶45、⑶50、⑶53、⑶63、⑶69、⑶81、⑶84、⑶102或⑶166的抗体。可使用本领域已知的方法试验抗体结合白细胞的能力。例如，抗体可与固态支撑物诸如珠、膜或柱基质(column matrix)结合,在包含白细胞的液体与抗体培养后，可从固态支撑物洗涤和除去未结合的组分。浓缩的白细胞还可通过将包含白细胞的组织或组织级分通过尺寸排阻滤器来制备。滤器可具有保留白细胞并允许组织或组织级分的液体和比白细胞小的组分通过的孔径。可选地，滤器可具有允许通过白细胞并保留组织或组织级分的比白细胞大的组分的孔径。经由过滤浓缩白细胞的此类滤器和装置的实例包括本领域已知的多种白细胞减少或耗竭滤器。实例包括来自 Pall Life Sciences (Ann Arbor,MI)的LeukoGuard 和Leukotrap 滤器，并包括2003年11月11日授权的Sheikh-Ali等的美国专利号6，645，388和1999年4月20日授权的Kraus等的美国专利号5，895，575中描述的那些，其通过引用并入本文。固态提取材料120可包括提供接触细胞的特定表面积的多种材料。固态提取材料可包括连续材料，或可以是不连续的，并包括多个离散颗粒。例如，固态提取材料可以以多个珠、纤维、粉末、多孔材料、或包括包含细胞的液体的容器表面的形式。固态提取材料可包括具有多种横截面形状诸如球形、卵形或多边形 、及其他的几何形式。固态提取材料还可包括与海绵相似的连续的多孔网，或可包括多个单独的多孔颗粒。固态提取材料还可因为多孔而提供与非多孔材料相比较大的表面积。在一些实施方案中，固态提取材料包括具有大的长宽比的颗粒，例如，其中颗粒是针状形状。固态提取材料还可形成为长纤维，并可以是、或采取类似玻璃棉的形式。在一些情形中，固态提取材料可包括容器的容纳包含白细胞的液体的内壁。例如，固态提取材料可包括注射器的包括包含白细胞的液体的内腔。其他容器包括管、诸如离心管、或本文别处描述的血液分级装置或浓缩器组件。当固态提取材料是连续材料、诸如多孔海绵样材料时，固态提取材料可以以在固态提取材料的孔或空隙内足以吸收或包括基本上白细胞的全部液体体积的量使用。当固态提取材料是不连续材料、诸如多个颗粒时，固态提取材料可与包含细胞液体的组合来形成浆状组合物。浆的稠度可变化，从具有高的固体比例的糊状、到具有低的固体比例的易流动浆。固态提取材料可提供用于接触细胞的大的表面积。然而，在一些情形中，固态提取材料可被进一步处理以增加其表面积，例如，通过物理或化学蚀刻或腐蚀固态提取材料的表面。关于化学蚀刻，取决于材料的性质，可使用腐蚀剂来改变固态提取材料的表面。改变的表面可通过采用碱或酸来产生，例如铬磺酸、尤其是强度约20%至约80%、优选地约50%铬磺酸。固态提取材料可与腐蚀剂一起培养约5min至约30min，以化学蚀刻表面并增加表面积。然后可洗涤固态提取材料来去除腐蚀剂。例如，固态提取材料可包括容器的用于容纳包含白细胞的液体的内壁，其中该内壁被蚀刻以随后增加接触液体的表面积。多种聚合物、金属、陶瓷和玻璃可用作固态提取材料。这些包括，例如，玻璃的连续固态提取材料或多个玻璃颗粒、玻璃棉、金属诸如钛的连续固态提取材料、多个金属珠、金属粉末、和其组合。金属的连续固态提取材料可包括由多孔金属或具有开放的孔眼结构的金属合金形成的块或其他三 维形状。固态提取材料可包括多种尺寸的多种珠或颗粒，包括基本上球形的珠。珠包括聚苯乙烯珠、聚丙烯酰胺珠、玻璃珠、金属(例如，钛)珠、或任何其他适合的珠。珠可以是适合所用的容器和包含白细胞的液体的量的任何尺寸。在一些情形中，珠尺寸可以从直径约0.001毫米至约3毫米变化。当珠尺寸足够小时，珠可以外观上更像粉末。与固态提取材料的表面接触可以活化细胞，而且在一些情形中，固态提取材料可帮助所得的富含IL-1ra的溶液的分离和浓缩。例如，在多孔固态提取材料的情形中，包含细胞的液体的一部分可进入孔并保留在其中。液体中的细胞可接触这一额外的表面积。在一些实施方案中，孔对于细胞过小而不能进入，但一部分液体可进入孔。液体可通过例如离心从固态提取材料和孔去除。在一些实施方案中，固态提取材料可包括吸湿材料诸如干燥聚丙烯酰胺珠，其吸收一部分液体，从而浓缩未被吸收进入吸湿材料的物质。适合的固态提取材料的多种实例包括玻璃、矿物、聚合物、金属和多糖。矿物包括刚玉和石英。聚合物包括聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和聚丙烯酰胺。金属包括钛。多糖包括葡聚糖和琼脂糖。固态提取材料的灭菌可使用本领域已知的技术进行，以阻止包含白细胞的液体的污染。例如，取决于固态提取材料的具体组成，可使用加热和压力灭菌方法、诸如高压灭菌法。当固态提取材料可被高压灭菌法不利地影响时，可使用替代方法、诸如化学灭菌或辐射。在一些实施方案中，在接触期间搅动包含白细胞的液体和固态提取材料以更充分地混合这些组分。搅动可通过倒转、摇动、摇摆、搅拌或涡流液体和固态提取材料来实现。搅动可增加液体中的细胞与固态提取材料的接触。搅动可进行一次、重复多次、周期地重复，或可以是连续的。当用电磁场刺激液体时，还可搅动包含细胞的液体和固态提取材料。包含白细胞的液体可用电磁场刺激，如图1中的140所示。应注意的是，在一些实施方案中，对包含细胞的液体的刺激可在将液体与固态提取材料接触之前进行。即，开始本发明方法的接触和刺激步骤的顺序可以颠倒。然而，接触步骤的至少一部分与刺激步骤的至少一部分在时间上重叠是优选的，使得包含细胞的液体同时地接触固态提取材料和被电磁场刺激。用电磁场刺激包含白细胞的液体可包括多种形式的电磁刺激，诸如脉冲电磁场或电容稱合电磁场。在一些实施方案中，使用与刺激线圈稱合的电源(power source)刺激液体。流经线圈的电流产生脉冲磁场，其在液体中引起脉冲电场。当液体被容纳在容器诸如试管或注射器中时，线圈可部分地围绕液体。线圈可整合于容纳包含白细胞的液体的容器，或可以是可拆卸的。例如，塑料管可形成为带有整体式线圈，或线圈可暂时地耦合于容器或放在容器中；例如，可构造试管使得线圈能够扣在容器上。电源可以如所需地耦合于线圈以进行刺激步骤。用电磁场刺激液体还可包括跨液体放置至少两个电极。然后可向电极施加电能以电容耦合电极并在其间产生电磁场。因此电磁场能够穿过液体，从而增加IL-1ra产生的速率和/或量。在其他实施方案中，电极可用于产生直流电，或一个或多个线圈可用于产生脉冲电磁场。刺激期间电磁场的强度可以是至少每厘米约0.5微伏，无论由直流电、电容耦合电流或脉冲电磁场产生。在直流电电极的情形，电流的振幅可以是从约I至约200微安，在一些实施方案中，振幅可以是从约20至约100微安。在又进一步的实施方案中，电流可以是约20、约60或约100微安。然而应理解的是，电流的振幅可以是其他适合的量级。刺激步骤期间施加的电磁场可以是恒定的或随时间变化。例如，可使用跨液体放置的电极施加正弦时变电磁场。此类正弦`时变电磁场可具有为从约I伏至约10伏的跨电极的峰值电压，在一些实施方案中，峰值电压可以是约5伏。产生的相应电场可具有从每厘米约0.1毫伏(mV/cm)至约100mV/cm的振幅,在一些实施方案中可以是约20mV/cm。正弦时变电场可具有从约1，OOOHz至约200，OOOHz的频率，在一些实施方案中频率可以是约60，OOOHz。施加于液体的电磁场也可以是脉冲电磁场。脉冲电磁场可使用外部线圈和脉冲发生器来引起。在这方面，脉冲电磁场可具有从每脉冲约10微秒至每脉冲约2000微秒的脉冲持续时间。在一个实施方案中，脉冲持续时间可以是约225微秒。脉冲可包括电磁脉冲串(burst)，其中脉冲串可包括从I个脉冲至约200个脉冲。可选地，电磁场可具有包括从约10个脉冲至约30个脉冲的脉冲串。在这方面,在一个实施方案中，每个脉冲串可包括约20个脉冲。脉冲电磁中施加脉冲串的频率可变化。在这方面，在一些实施方案中，脉冲串可以从约IHz至约IOOHz的频率重复，在其他实施方案中可以约IOHz至约20Hz的频率重复。此夕卜，脉冲串可以约1.5Hz、约15Hz或约76Hz的频率重复。脉冲串可具有从约10微秒至高达约40，000微秒的持续时间。在这方面，脉冲串可具有约4.5毫秒的持续时间。用于产生电容耦合电磁场的适合装置包括SpinalPak 脊柱刺激器(EBI，L.P.，Parsippany, New Jersey)或DC刺激装置诸如SpF XL IIb脊柱融合刺激器(EBI, L.P.，Parsippany, New Jersey)。脉冲电磁场可使用多种已知的方法和设备产生，诸如使用单个线圈或一对赫姆霍兹线圈。例如，适合的设备包括EBI Bone Healing System Model2001 (EBI,L.P.,Parsippany,New Jersey)和 BTBS 刺激线圈。对于直流电，电场可使用用于产生直流电电场的任何已知装置、诸如例如，Osteogen 可植入骨生长刺激器(EBI，L.P., Parsippany, New Jersey)来产生。可使用用于产生电磁场的其他适合装置。关于液体与固态提取材料的接触，包含白细胞的液体的电磁刺激可如所需地继续和/或重复。然而应理解的是，可选地或另外地，用电磁场刺激液体的步骤包括环境条件带来的电场或电磁场(诸如偶然暴露于收音机、电话、台式电脑或类似装置产生的电磁场)。在一些实施方案中，如图1所示的接触步骤130和刺激步骤140 二者在小于约I小时中进行。接触和刺激步骤还可在从约20°C至约37°C范围内的温度进行。在一个优选的实施方案中，在接触和刺激步骤期间将包含白细胞的液体的温度保持在约37°C。接触和刺激步骤之一或二者通过在活体外(ex vivo)进行。在一些实施方案中，如图1所示，从接触步骤130和刺激步骤140产生的富含IL-1ra的溶液150，被从固态提取材料分离。从固态提取材料分离可以多种方式进行。例如，富含IL-1ra的溶液可 通过以下从固态提取材料取出:使用注射器、过滤富含IL-1ra的溶液，离心富含IL-1ra的溶液和固态提取材料，或使用本领域已知的适于从固态提取材料分离液体的方法。可组合多种分离技术；例如，当用注射器取出富含IL-1ra的溶液时，多孔固态提取材料中包含的剩余溶液可经受离心，形成沉淀的任何溶液也可用注射器取出。在一些实施方案中，例如当固态提取材料是弹性和海绵样时，可使用压力从固态提取材料取出富含IL-1ra的溶液，或可使用真空抽出。在一些实施方案中，在其中产生富含IL-1ra的溶液的容器可被构造以帮助从固态提取材料分离溶液。例如，容器可在一侧、在底部、或在容器帽或盖上包括滤器、网筛或玻璃粉(glass frit)。然后可离心容器，其中液体穿过滤器、网筛或玻璃粉，而且固态提取材料和其他材料诸如细胞被保留。在一些情形中，仅保留固态提取材料，而且基本上所有其他材料穿过滤器、网筛或玻璃粉。以这种方式，可离心富含白介素-1受体拮抗剂的溶液并收集例如到新的容器中。当容器的表面形成固态提取材料时，分离包括从容器取出液体。现在参考图2，显示了用于产生富含IL-1ra的溶液的另一种方法200。在步骤210从患者诸如人类受治疗者取血。如以下进一步讨论的，这一血液可在步骤230直接使用，或可在步骤220被处理以产生血液级分。血液或血液级分提供包含白细胞的液体。本文使用的富含血小板的血浆(PRP)理解为包括白细胞，可在本发明方法和系统中用作包含白细胞的液体。例如，如步骤220所示，可离心血液以分离包含白细胞和血小板的PRP。在一些实施方案中，包含白细胞的液体包括全血沉淀后形成的血沉棕黄层。可用于在步骤220分离富含血小板的血浆的装置的一个实例如图4所示。就这一点而言，装置400包括装有血液后置于离心机中的容器405,如管。容器405包括具有隔离器410和浮标415的浮标系统(buoy system)。浮标415具有选定的密度,其调整成以在离心后达到选定的平衡位置；该位置位于更大密度的血液级分和更小密度的血液级分之间。离心过程中，浮标415通过沉降至两个级分之间的位置而在容器405中将血液分离成至少两个级分，级分之间基本不会混杂。就这一点而言，隔离器410和浮标415限定了包括富含血小板的血浆420的层，而更小密度的缺少血小板的血浆425通常分级在隔离器410上方，更大密度的红细胞430通常分级在浮标415下面。离心装置400后，注射器或离心管可与浮标系统的一部分互相连接以抽取富含血小板的血浆。不同的实施方案中，此类装置可用于产生包括血小板浓度约为全血中8倍且白细胞浓度约为5倍的富含血小板的血浆。该富含血小板的血浆可包括约80%至约90%的存在于全血中的白细胞。此类装置的市售实施方案包括来自BiometBiologies,LLC(Warsaw, Indiana,USA)的GPS II 血小板浓缩系统(GPS 工工 PlateletConcentrate System)和来自 Biomet Biologies,LLC(Warsaw, Indiana,USA)的GPS'!.工工工血小板分离系统(G1)S III Platelet Separation System)。可用于在图2中的步骤220中分离富含血小板的血浆的装置包括以下描述的那些，例如，2002年6月4日授权的Blasetti等的美国专利号6，398，972，2003年11月18日授权的Brandt等的美国专利号6，649，072，2004年9月14日授权的Dolocek的美国专利号6，790，371，2006 年 3 月 14 日授权的 Sukavaneshvar 等的美国专利号 7，011，852，2004 年 12月16日公布的Leach等的美国专利申请公布号2004/0251217(通过引用并入本文)，2005年5月26日公布的Leach等的美国专利申请公布号2005/0109716 (通过引用并入本文)，2005年9月8日公布的Dorian等的美国专利申请公布号2005/0196874 (通过引用并入本文)，以及2006年8月10日公布的Dorian等的美国专利申请公布号2006/0175242 (通过引用并入本文)。在步骤220中也可使用其他方法分离富含血小板的血浆。例如，可对全血进行离心而不使用浮标系统，可对全血进行多阶段离心，可以使用连续流离心，还可以过滤。此外，包括富含血小板的血浆和白细胞在内的血液组分可以通过将红细胞与血浆分离而产生，其中使用低速离心步骤以防止血小板沉淀。在其他实施方案中，可将从离心血液中形成的血沉棕黄层级分与余下的血浆分离，并重悬形成包括白细胞的富含血小板的血浆。
除了 GPSu.血小板浓缩系统及分离系统之外，许多其他的市售装置也可用于步骤220分离富含血小板的血衆,包括Medtronic, Inc.(Minneapolis, Minnesota, USA)出售的Magellan 自体血小板分离器系统(Magellan Autologous Platelet Separator System)、Harvest Technologies Corporation (Plymouth, Massachusetts, USA)出售的 SmartPReP 、DePuy (Warsaw, Indiana, USA)、Cytomedix, Inc.(Rockville, Maryland, USA)出售的AutoloGel Process、EmCyte Corporation (Fort Myers, Florida, USA)出售的 GenesisCS系统以及 Biomet3i, Inc.(Palm Beach Gardens, Florida, USA)出售的 PCCS 系统。再次参考图2，在随后用于步骤220或230之前，在步骤210从受治疗者抽取的血液可以与抗凝血剂混合。适用的抗凝血剂包括本领域已知的那些，诸如肝素、柠檬酸磷酸葡萄糖(CPD)、乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸葡萄糖溶液(AOT)及其混合物。抗凝血剂可以置于用于从受试者抽取血液的注射器内，或者可在血液抽出后与其混合。可选地或此外，可在步骤230中将来自步骤210、未经受步骤220中离心的血液与包括聚丙烯酰胺珠的固态提取材料混合并培养。这一选项在图2中由直接从步骤210导向步骤230的箭头示出。在这种情形，聚丙烯酰胺珠活化血液中IL-1ra的产生,但IL-1ra的浓度可以低于使用包含白细胞或血小板的富含血小板的血浆或其中细胞已经相对于全血浓缩的另一种白细胞液体体积。
包含白细胞的液体还可使用本领域熟知的方法制备。例如，白细胞可通过溶解红细胞而从全血中制备，或通过使用密度梯度离心全血，其中白细胞沉降物位于离心管底部。密度离心法的一个实例包括采用Ficoll-Paque Plus产品(GE HealthcareBio-Sciences, Piscataway, New Jersey, USA)的方法。一些情况下中，密度梯度可以用于进一步分离单核细胞和多形核细胞。白细胞还可用过滤法从全血中制备；一个实例包括Ace I ere MNC Harvest System (Pall Life Sciences, Ann Arbor, Michigan, USA)。白细胞还可从骨髓中获取。如图2的步骤230所示，将来自步骤220的富含血小板的血浆与包括聚丙烯酰胺珠的固态提取材料接触。在一些实施方案中，将富含血小板的血浆与干燥聚丙烯酰胺珠培养足以去除富含血小板的血浆中一部分液体的时间。培养可以进行约30秒至约72小时的时间段，并且可以在约20°C至约41°C温度下进行。例如，培养可以从约I分钟至48小时，从约5分钟至约12小时，或从约10分钟至约6小时。在一些实施方案中，培养在约37°C下进行。在一些实施方案中，富含血小板的血浆不进行培养，而是与聚丙烯酰胺珠仅接触至进行后续处理所必需的时间。接触可发生在环境条件下，例如约20-25°C的温度下。步骤230中用作固态提取材料的聚丙烯酰胺珠可使用本领域已知的可控的标准操作流程由丙烯酰胺单体聚合形成，以产生由聚丙烯酰胺凝胶形成的相对均一的珠。通常，聚丙烯酰胺由丙烯酰胺与适当的双官能团交联剂聚合形成，最常用的为N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺(双丙烯酰胺)。凝胶聚合通常用过硫酸铵来起始，并通过加入催化剂例如N，N, N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)加快反应速度。在多个实施方案中，聚丙烯酰胺珠包括每毫升珠0.5微摩尔的羧基，赋予轻微的阴离子特征(负电荷)。珠通常也耐受pH值的变化，并在许多水溶液和有机溶液中稳定。通过调整总丙烯酰胺浓度，可以形成多种孔径范围的聚丙烯酰胺凝胶。此外，可形成许多种尺寸的聚丙烯酰胺珠，并具有相对均一的大小分布。珠大小可从直径几微米至直径几毫米。例如，多种类型的Bio-GelTMP聚丙烯酰胺凝胶珠(Bio-RadLaboratories, Hercules, California, USA)具有的粒径从小于约 45 μ m 到多至约 180 μ m。聚丙烯酸胺珠还可购于 SNF Floerger (Riceboro, Georgia, USA)、Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford, Illinois, USA)和 Polymers, Inc.(Fayetteville, Arkansas, USA)。聚合后，聚丙烯酰胺珠可以干燥并以粉末样形式贮存。干燥的珠不溶于水，但经再水化后可显著膨胀。再水化还原了聚丙烯酰胺珠的凝胶稠度，可变成干燥状态的约2倍至约3倍大小。因此，干燥的聚丙烯酰胺珠(即，干燥聚丙烯酰胺珠)可用于吸收一部分液体体积，包括小于珠孔径大小的溶质，并可用于浓缩由白细胞产生的IL-lra。例如，步骤230中干燥聚丙烯酰胺珠与血液和/或富含血小板的血浆的结合激活了白细胞对IL-1ra的产生，也因为干燥珠的再水化和膨胀而减少了总液体体积。不作为对本发明技术的机制、效用或功能的限制，聚丙烯酰胺珠可作为白细胞产生IL-1ra的活化剂。因此，就干燥聚丙烯酰胺珠而言，不仅液体被从白细胞的体积中吸收，从而浓缩了所形成的IL-lra，而且珠还作为刺激白细胞产生IL-1ra的表面。例如，利用使用按照图4的装置诸如GPSu II系统获得的富含血小板的血浆收集的IL-lra，可导致IL-1ra浓度相对于全血的约5倍增加。如以下进一步描述的，使用按照图5A和5B的装置诸如 PlasmaxTM 装置(Biomet Biol ogies, LLC, Warsaw, Indiana, USA)培养和分离富含IL-1ra的溶液后，随后IL-1ra的浓度可增加约40倍或更多，至终浓度增加约200倍。因此，IL-1ra量的增加并非简单地由于通过减少样品体积来增加浓度引起的，而是表现为部分地由于白细胞和来自血小板的其他生长因子被聚丙烯酰胺珠活化而增加了 IL-1ra的产生和/或释放。参考图2，用电磁场刺激富含血小板的血浆，如240所示。使用靠近富含血小板的血浆放置的线圈施加脉冲电磁场(PEMF)。例如，可将一个或多个线圈放置在容纳富含血小板的血浆和聚丙烯酰胺珠的容器诸如PlasmaxTM装置中或一部分附近。在一些情形中，使用两个线圈，其中将包括富含血小板的血浆的容器排列在线圈之间。PEMF可使用Simon的美国专利号7,744,869(2010年6月29日授权)、7，520，849 (2009年4月21日授权)和6，955，642 (2005年10月18日授权)中描述的参数来施加，其通过引用并入本文。在将富含血小板的血浆与聚丙烯酰胺珠接触和电磁场刺激后，如图2中步骤250所述，产生富含IL-1ra的溶液并可从珠分离。可以通过抽出液体体积并留下珠来完成富含IL-1ra的溶液的分离。一些情况下，可以在抽出富含IL-1ra的溶液之前通过离心使珠沉淀。还可以通过过滤进行分离，其中聚丙烯酰胺珠被滤器保留，富含IL-1ra的溶液流过滤器，例如利用离心力或利用真空。如果步骤230中与聚丙烯酰胺珠的接触利用干燥的聚丙烯酰胺珠，则液体体积可由于珠的再水化膨胀而减少，从而浓缩所得富含IL-1ra的溶液。为保持增加的浓度，步骤250中应十分小心，以避免挤压珠或从已膨胀珠中抽出液体。例如，高离心力或高真空度可能压碎珠和/或从珠内部体积中抽出液体。在一些情况下，富含血小板的血浆与聚丙烯酰胺珠的接触(有关步骤230)、电磁场刺激(有关步骤240)、和所得富含IL-1ra溶液的分离(有关步骤250)可用同一装置进行。将富含血小板的血浆与聚丙烯酰胺珠一起培养的装置的一个实例如图5A和5B所示。就这一点而言，装置500具有上室505和下室510。上室505具有端壁515，被凝胶珠搅拌器525的搅拌器杆520从中穿 过。装置500还具有穿过端壁515进入上室505的入口 530。装置500还包括与血浆浓缩液导管540相通的出口 535。上室505的底面包含滤器545，其上表面支撑干燥的浓缩聚丙烯酰胺珠550。使用过程中，将含有白细胞的流体555 (如，富含血小板的血浆)通过入口 530注射到上室505中，与聚丙烯酰胺珠550混合。流体555和聚丙烯酰胺珠550可通过旋转搅拌器杆520和凝胶珠搅拌器525来混合，以帮助混合流体555和珠550。混合的流体555和聚丙烯酰胺珠550随后在期望的温度下培养期望的时间。在此期间，用电磁场刺激混合的流体555和聚丙烯酰胺珠550，诸如使用跨上室505的包括混合的流体555和聚丙烯酰胺珠550的部分放置的两个线圈施加脉冲电磁场。随后对装置500进行离心以使液体进入到下室510而聚丙烯酰胺珠550被滤器545保留，从而将聚丙烯酰胺珠550与下室510中收集的所得IL-1ra溶液560分离。溶液560可通过出口 535从装置中移出。2006年8月10日公布的Dorian等人的美国专利申请公布号2006/0175268和2006年11月2日公布的Swift等人的美国专利申请公布号2006/0243676中公开了图5的示例性装置；两者均通过引用并入本文。此类装置作为Biomet Biologies,LLC(Warsaw,Indiana, USA)的Plasmax Plus血衆浓缩机以商品销售。再参考图2,步骤260中向患者诸如人或动物受治疗者施用富含IL-1ra的溶液。接受富含IL-1ra的溶液的患者可以是步骤210中获得或取得血液的同一患者。这种情况下，该方法提供了 IL-1ra的自体制备。可以使用多种手段给药，例如通过使用注射器注射富含IL-1ra的溶液、手术施用或在其他外科手术时同时施用。然而，应当理解，步骤260可包括用于植入、注射或以其他方式在部位处或附近施用富含IL-1ra的溶液的任何生物医药可接受的方法或程序，以便介导与白介素-1受体刺激例如炎症相关的效应。例如，为治疗由关节炎导致的炎症，可通过注射向患者施用富含自体IL-1ra的溶液。注射可在炎症关节的滑液腔处或之内，或在关节处或附近。以与图2所示的方法类似的方式，脂肪组织可用于提供包含脂肪细胞的液体，以用于图3中图解显示的另一种方法300。在这种情形中，在步骤310从患者获得脂肪组织，其中脂肪组织被进一步处理320，或直接用作包含脂肪细胞的液体。脂肪组织可与包括聚丙烯酰胺珠的固态提取材料接触和培养330，用电磁场刺激340，和分离富含IL-1ra的溶液350，并以对图2中所示的类似步骤描述的方式施用360于患者。然而，获得脂肪组织310和处理脂肪组织320可进一步包括以下方面。脂肪细胞的液体体积可以是分离的脂肪组织的一部分；例如，其中所述脂肪组织可包括其他细胞类型。脂肪细胞与聚丙烯酰胺珠的接触330可包括将脂肪细胞的液体体积与聚丙烯酰胺珠培养约30秒至约24小时的时间，优选地小于约I小时，包括电磁场刺激340。除了脂肪细胞的液体体积与聚丙烯酰胺珠的接触外，接触330还可包括将含有白细胞的液体体积与聚丙烯酰胺珠接触。白细胞的液体体积可以是全血、富含血小板的血浆，或者全血和富含血小板的血浆。白细胞还可以从骨髓获得。脂肪组织指任何脂肪组织，白色或棕色脂肪组织均可，其可来源于皮下、网膜/内脏、乳腺、性腺或其他脂肪组织部位。一些实施方案中，脂肪组织来源于通过抽吸辅助脂肪切除术或抽脂术分离的人皮下脂肪。脂肪细胞和可包括白细胞的其他细胞，可以用任何适宜方法从脂肪组织和/ 或组织部分中分离和/或解聚，包括本领域已知方法，例如机械离心和分解离心。脂肪细胞和其他细胞还可用酶解消化的方法分离。例如，脂肪细胞和其他细胞可以从脂肪抽吸物(Iipoaspirate)中分离，用超声波和/或酶解消化处理，并通过离心富集。从脂肪组织中分离的脂肪细胞和其他细胞可进行一次或多次清洗和沉淀。分离脂肪组织和脂肪细胞的方法可以包括如下方面。可通过抽吸辅助的肿胀抽脂术(tumescent liposuction)将约50cc的脂肪组织收集在与抽吸胶管和抽脂套管相连的专门的收集容器中。收集容器可以带有纱布型格栅滤器，其允许使肿胀液(tumescentfluid)通过并保留固体脂肪组织。收集完脂肪组织后，将收集容器从抽吸装置中移出，再与离心装置相连。过滤单元还可包含具有约100微米孔径的滤器。一旦含有脂肪组织的收集容器与离心装置相连，即对组织进行超声处理。超声完成后，将整个装置放入离心桶内离心，以约300Xg离心约5分钟。离心后，将收集容器以及过滤单元分离。含有脂肪细胞和其他细胞的沉淀可重悬于生物相容性溶液中，例如自体血浆、血浆浓缩液和/或富含血小板的血浆。脂肪组织也可用消化酶类和减弱相邻细胞间连接的螯合剂处理，使其能够将组织分散成单细胞(包括脂肪细胞)的悬液，而无明显的细胞破损。解聚后，可从细胞和解聚组织的悬液中分离脂肪细胞和其他细胞。多种用于分离和/或分级分离脂肪组织和脂肪细胞的方法和装置包括Leach等在美国专利号7，374，678(2008年5月20日授权)和7，179，391 (2007年2月20日授权)中以及Leach等在美国专利申请公布号2009/0014391(2009年I月15日公布)、2008/0283474(2008年11月20日公布)和2007/0208321(2007年9月6日公布)中描述的那些。诸如GPS 血小板浓缩系统(Biomet，WarSaw，IN)的装置可用于分离脂肪细胞。这些方法可包括如下获得脂肪细胞和其他细胞:通过对患者实施抽脂术获得脂肪组织，对脂肪组织进行酶促消化，并用这些装置分离和/或清洗脂肪细胞。在一些实施方案中，脂肪组织的分离可通过以下进行:由标准脂肪抽吸提取组织，从切除的脂肪组织分离，或通过使用VASER 超声破裂仪连同可从Sound SurgicalTechnologies, LLC, Louisville, Colorado 获得的 VENTX 插管。脂肪细胞和包括白细胞的其他细胞与固态提取材料(例如，聚丙烯酰胺珠)的表面的接触表现为刺激IL-1ra的产生和分泌。产生IL-1ra的量与白细胞浓度之间也表现为存在相关性，其中脂肪组织可包括白细胞。因此，本发明方法可使用脂肪组织和解聚的脂肪组织来获得脂肪细胞，其中白细胞可存在于脂肪组织和从脂肪组织获得的脂肪细胞二者中。参考图6，显示了用于产生富含IL-1ra的溶液的另一种方法600。在这一情形中，首先在步骤610中从患者取血。进行到步骤620，离心血液以分离富含血小板的血浆。如同图2的方法，可用多种装置、诸如图4所示的装置分离富含血小板的血浆。例如，包括双重浮标机构的装置可在浮标415与分离器410之间包括聚丙烯酰胺珠。聚丙烯酰胺珠可以是干燥或水合的，如参考图2步骤230所述的。在步骤620的离心期间，在浮标415与分离器410之间收集富含血小板的血浆并接触聚丙烯酰胺珠。较不稠的贫血小板血浆组分在富含血小板的血浆之上形成，较稠的红细胞组分在之下形成。离心完成后，可在期望温度培养包含分离的血液组分的试管期望的时间，如步骤630所示，其中富含血小板的血浆被电磁场进一步刺激。以这种方式，由位于浮标与分离器之间的富含血小板的血浆和聚丙烯酰胺珠的混合物中的白细胞产生IL-lra。在使用干燥聚丙烯酰胺珠的情形中，在步骤620中的离心完成后，在培养前可从试管去除上方的贫血小板血浆组分和下方的红`细胞组分，留下两个浮标部分之间的富含血小板的血浆和聚丙烯酰胺珠的混合物。可选地，可从试管取出富含血小板的血浆和聚丙烯酰胺珠的混合物。在任一种情形中，从接触贫血小板血浆和红细胞组分的流体分离富含血小板的血浆和聚丙烯酰胺珠的混合物，允许干燥聚丙烯酰胺珠的随后膨胀和再水合，以有效减少富含血小板的血浆的液体体积，进一步浓缩所得的IL-1ra溶液。如步骤640所示，在步骤630中接触和刺激后从聚丙烯酰胺珠分离富含IL-1ra的溶液。从珠分离富含IL-1ra的溶液可使用多种手段实现，诸如参考图2步骤250所述的那些。如步骤650所示，然后将富含IL-1ra的溶液施用于患者。施用可使用多种手段进行，诸如参考图2步骤260所述的那些。现在参考图7，显示了用于产生富含IL-1ra的溶液的另一种方法700。在步骤710中从患者取血。使用大体积浓缩装置来过滤血液和有效地去除一些血液组分，如步骤720所示，以产生包含白细胞和血小板的富含血小板的血浆。步骤720中使用的适合装置包括分离器组件和浓缩器组件。分离器组件在滤器诸如毡滤器中捕获红细胞。滤器具有尺寸定制为在离心期间接收和捕获红细胞的孔和通道。该装置通过在与滤器成行的平衡柱状分离室中以一定速度旋转血液来捕获红细胞，其中分离室和滤器由径向伸入分离区的板来分段。分离室的转速允许在分离区中分离包括白细胞的富含血小板的血浆。浓缩器组件可使用干燥聚丙烯酰胺珠吸收富含血小板的血浆中的液体来浓缩富含血小板的血浆，如参考图2步骤230所述的。当珠被搅拌时，富含血小板的血浆在旋转浓缩室中与聚丙烯酰胺珠接触来产生富含血小板的血浆浓缩物。然后可用电磁场刺激浓缩器组件中的富含血小板的血浆和聚丙烯酰胺珠的混合物以允许产生IL-lra，包括由于珠的膨胀和对液体的吸收而对溶液的任何另外的浓缩。通过以从珠分离富含血小板的血浆浓缩物的速度旋转浓缩室来 收集所得的富含IL-1ra的溶液。此类装置的实例包括Vortech 浓缩系统(Biomet Biologies, LLC, Warsaw,Indiana, USA),并包括在2006年8月10日公布的Dorian等的美国专利申请公布号2006/0175244、2006年8月10日公布的Dorian等的美国专利申请公布号2006/0175242中公开的那些，其通过引用特此并入。代替具有参考图2步骤220所述的浮标的试管或除了其以外使用这些装置，以制备包括白细胞和血小板的富含血小板的血浆。如步骤730所示，然后将富含IL-1ra的溶液施用于患者。施用可使用多种手段进行，诸如参考图2步骤260所述的那些。参考图8，显示了用于产生富含IL-1ra的溶液的另一种方法800。从患者取血，如步骤810所示，并与聚丙烯酰胺珠混合，如步骤820所示。聚丙烯酰胺珠可以是干燥或水合的，如参考图2步骤230所述的。然后在步骤830中使用过滤来从红细胞分离一定体积的白细胞和聚丙烯酰胺珠。过滤可使用单个滤器或一系列尺寸排阻滤器来完成，以捕获白细胞和珠，而其他血液组分诸如红细胞与一种或多种滤液一起通过。过滤完成后，培养白细胞和聚丙烯酰胺珠的体积，如步骤840所示，以活化IL-1ra的产生并且如果使用的是干燥的聚丙烯酰胺珠，以进一步减少液体体积。此时，当液体处于与聚丙烯酰胺珠接触时，白细胞的液体体积还经受电磁场以产生IL-lra，如步骤850所示。在步骤840和850的培养期间还可向液体加入血小板。在步骤860中从聚丙烯酰胺珠分离富含IL-1ra的溶液。可使用分离的多种手段，诸如通过脱去液体体积并留下珠。在一些情形中，在脱去富含IL-1ra的溶液之前通过离心沉淀珠。分离还可通过过滤进行，其中例如使用离心机产生的力或通过使用真空，聚丙烯酰胺珠被滤器保留，富含IL-1ra的溶液穿过滤器。在一些情形中，富含IL-1ra的溶液经由步骤830中使用的相同滤器或系列滤器取出溶液来从聚丙烯酰胺珠分离。可将富含IL-1ra的溶液取至新的收集室，或取至此前使用的滤液收集室，其中一种或多种此前的滤液已被去除。然后向患者施用富含IL-1ra的溶液，如步骤870所示。可以通过包括无菌滤器来处理最终分离的IL-1ra产物而对通过本发明方法和系统产生的富含IL-1ra的溶液的多种制备物进行灭菌。同样地，抗生素可以在培养过程中包含在聚丙烯酰胺中，或在本文所述方法的各种步骤的一步或多步中加入。本发明技术提供了制备富含IL-1ra的溶液、包括富含自体IL-1ra的溶液的改进的方法，其减少和/或基本上消除了使用非自体材料或重组材料时可能出现的免疫学问题。此外，由于IL-1ra由患者的细胞产生，因此天然的翻译后修饰如糖基化已经存在。大部分重组蛋白不是这样，因为它们是在原核宿主中产生的。以本发明方法和系统产生的富含IL-1ra的溶液可如下表征:包含活的全血细胞，具有相对于全血增加浓度的IL-lra、可溶性肿瘤坏死因子受体包括sTNF_rI和sTNFr_I1、血浆蛋白和生长因子。然而，应该理解，在任何给定溶液中存在的浓度可因本发明方法中所用全血或血浆中存在的组分的起始水平而变化，并且浓度的增加是与那些材料的起始水平相比较而言的。通常，IL-1ra在富含IL-1ra的溶液中可以以至少约10，000pg/mL、至少约25，000pg/mL或至少约30，000pg/mL的浓度存在。血衆蛋白水平通常以至少约50mg/mL、至少约80mg/mL、至少约100mg/mL、至少约200mg/mL或至少约250mg/mL的浓度存在。具体地，白蛋白以约40mg/mL或至少约100mg/mL的浓度存在；纤维蛋白原以至少约2mg/mL或至少约4mg/mL的浓度存在。sTNF_rl通常以大于全血的浓度存在，诸如至少约1500pg/mL。增加浓度的生长因子包括:血小板衍生生长因子P⑶F-AB，以大于50，000pg/mL或大于70，000pg/mL的浓度；转化生长因子TGF-β 1，以大于150，000pg/mL或大于190，000pg/mL的浓度；胰岛素样生长因子IGF-1,以大于约140，000pg/mL或大于160，000pg/mL的浓度；碱性成纤维细胞生长因子bFGF，以大于150，000pg/mL或大于170，000pg/mL的浓度；和血管内皮生长因子VEGF，以大于1，200pg/mL或大于1，400pg/mL的浓度。炎性细胞因子(例如，白介素Ia、白介素I β、肿瘤坏死因子-α和白介素10)的浓度通常不显著大于全血，并可以更低。组分的具体水平的实例列在以下表I。表1.组合物组分的实例
权利要求
1.一种组合物，包含: 白介素-1受体拮抗剂；和 可溶性肿瘤坏死因子受体； 其中所述白介素-1受体拮抗剂和所述可溶性肿瘤坏死因子受体来源于同一受治疗者，且所述白介素-1受体拮抗剂和所述可溶性肿瘤坏死因子受体的浓度各自大于全血或血浆中存在的浓度。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述白介素-1受体拮抗剂的浓度是所述可溶性肿瘤坏死因子受体的浓度的至少约5，OOO倍。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述白介素-1受体拮抗剂的浓度是全血中存在的浓度的至少约10，000倍。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述溶液中所述白介素-1受体拮抗剂的浓度是约30,000pg/mL 至约 110，000pg/mL。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述可溶性肿瘤坏死因子受体包括可溶性肿瘤坏死因子受体1、可溶性肿瘤坏死因子受体I1、或二者。
6.如权利要求1所述的组合物，还包含白介素-1a，其中所述溶液中所述白介素-1受体拮抗剂的浓度是所述白介素-1 a的浓度的至少约10，000倍。
7.如权利要求1所述的组合物，还包含活的白细胞、溶解的白细胞、或二者。
8.如权利要求1所述的组合物,还包含血小板。
9.如权利要求1所述的组合物，其中总的蛋白浓度比全血的总的蛋白浓度大。
10.一种治疗受治疗者的炎症的方法，包括向炎症部位施用权利要求1的组合物。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述炎症与骨质溶解相关。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述炎症与骨关节炎相关。
13.如权利要求10所述的方法，还包括向所述炎症部位施用纤维蛋白原、凝血酶、钙、或其组合。
14.一种产生富含白介素-1受体拮抗剂的溶液的方法，包括: 将包含白细胞的液体与固态提取材料接触；和 从所述固态提取材料分离包含白介素-1受体拮抗剂的溶液，其中所述溶液中白介素-1受体拮抗剂的浓度大于将所述液体与所述固态提取材料接触之前所述液体中白介素-1受体拮抗剂的浓度。
15.如权利要求14所述的 方法，其中将包含白细胞的液体与固态提取材料接触包括在容器中合并所述包含白细胞的液体和所述固态提取材料。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述接触包括将所述液体与所述固态提取材料培养约30秒至约24小时。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述固态提取材料包括选自珠、纤维、粉末、多孔材料、和其组合组成的组的形式。
18.如权利要求14所述的方法，其中所述固态提取材料的表面被蚀刻以增加其表面积。
19.如权利要求14所述的方法，其中所述固态提取材料包括选自矿物、聚合物、金属、多糖、和其组合组成的组的成员。
20.如权利要求14所述的方法，其中所述固态提取材料包括选自刚玉、石英、钛、葡聚糖、琼脂糖、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、和其组合组成的组的成员。
21.如权利要求14所述的方法，其中所述包含白细胞的液体包括全血、骨髓穿刺液、月旨肪组织、其级分、和其混合物。
22.如权利要求14所述的方法，其中所述包含白细胞的液体包括富含血小板的血浆。
23.如权利要求14所述的方法，其中所述包含白细胞的液体包括浓缩的骨髓穿刺液。
24.如权利要求14所述的方法，其中所述包含白细胞的液体包括骨髓穿刺液且所述固态提取材料包括聚丙烯酰胺。
25.如权利要求14所述的方法，其中所述溶液中可溶性肿瘤坏死因子受体的浓度是以大于将所述包含白细胞的液体与所述固态提取材料接触之前所述液体中存在的所述可溶性肿瘤坏死因子受体的浓度的浓度。
26.如权利要求14所述的方法，其中所述包含白细胞的液体包括来源于选自全血、骨髓穿刺液、或其组合组成的组的组织的白细胞级分。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述白细胞级分通过离心所述组织以相对于全血增加白细胞的浓度来制备。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述白细胞级分由包括以下的方法制备: 将所述组织上样到试管中，所述试管包括在所述试管中布置的浮标，其中所述浮标具有的密度使得所述浮标可被操作以在所述试管中的所述组织被离心后到达平衡位置，所述平衡位置在第一级分与包含白细胞的第二级分之间，所述第二级分具有大于所述第一级分中白细胞浓度的白细胞浓度； 离心所述试管，从而所述浮标界定所述第一级分与所述第二级分之间的界面；和 取出所述白细胞级分。
29.如权利要求26所述的方法，其中所述组织包括全血且所述白细胞级分由包括以下的方法制备: 将一定体积的全血上样到包含两个浮标的分离器中，所述浮标可被操作以将血液分离为包括包含白细胞的级分的三种或更多种级分； 离心所述分离器以产生所述白细胞级分；和 从所述分离器提取所述白细胞级分。
30.如权利要求26所述的方法，其中所述组织包括骨髓穿刺液，且所述白细胞级分由包括以下的方法制备: 将一定体积的骨髓穿刺液上样到包含两个浮标的分离器中，所述浮标可被操作以将所述骨髓穿刺液分离为包括包含白细胞的级分的三种或更多种级分； 离心所述分离器，产生所述白细胞级分；和 从所述分离器提取所述白细胞级分。
31.一种治疗受治疗者的炎症的方法，包括向炎症部位施用根据权利要求14的方法制造的富含白介素-1受体拮抗剂的溶液。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述炎症与骨质溶解相关。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述炎症与骨关节炎相关。
34.如权利要求31所述的方法，还包括向所述炎症部位施用纤维蛋白原、凝血酶、钙、或其组合。
35.如权利要求31所述的方法，其中所述包含白细胞的液体得自或来源于被治疗的受治疗者。
36.一种产生用于治疗受治疗者的炎性病症的富含白介素-1受体拮抗剂的溶液的方法，所述方法包括: (1)从所述受治疗者获得包括全血、骨髓穿刺液、或二者的组织； (2)将所述组织和抗凝血剂上样到试管中，所述试管包括在所述试管中布置的浮标，其中所述浮标具有的密度使得所述浮标在所述试管中的所述组织被离心后到达平衡位置，所述平衡位置在第一级分与包含白细胞的第二级分之间，所述第二级分具有大于所述第一级分中白细胞浓度的白细胞浓度； (3)离心所述试管，从而所述浮标界定所述第一级分与所述第二级分之间的界面；和 (4)收集所述第二级分； (5)将所述第二级分上样到包含固态提取材料的浓缩器组件，并培养与所述固态提取材料接触的所述第二级分；和 (6)以离心速度旋转所述浓缩器组件 以从所述固态提取材料分离具有大于全血的白介素-1受体拮抗剂浓度的白介素-1受体拮抗剂浓度的富含白介素-1受体拮抗剂的溶液。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述第一级分包括红细胞。
38.如权利要求36所述的方法，其中所述第二级分包括包含白细胞的富含血小板的血浆。
39.如权利要求36所述的方法，其中所述固态提取材料包括包含选自刚玉、石英、钛、葡聚糖、琼脂糖、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、和其混合物组成的组的材料的珠。
40.一种治疗受治疗者的炎症的方法，包括向炎症部位施用根据权利要求36的方法制造的富含白介素-1受体拮抗剂的溶液。
41.根据权利要求36的方法制造的富含白介素-1受体拮抗剂的溶液，所述溶液包含: 白介素-1受体拮抗剂和可溶性肿瘤坏死因子受体，其中二者以大于步骤(I)中所述组织中其各自的浓度的浓度存在； 活的白细胞、溶解的白细胞、或二者；和 生长因子。
42.一种产生富含白介素-1受体拮抗剂的溶液的方法，包括: 将包含浓缩的白细胞的液体与固态提取材料接触；和 从所述固态提取材料分离富含白介素-1受体拮抗剂的溶液，其中所述溶液中白介素-1受体拮抗剂的浓度大于将所述液体与所述固态提取材料接触之前所述液体中白介素-1受体拮抗剂的浓度； 其中所述包含浓缩的白细胞的液体由包括以下的方法制造: 混合包含白细胞的组织或组织级分和与可被操作以结合单核白细胞的抗体偶合的磁珠；和 收集被所述抗体结合的单核白细胞，用作所述包含浓缩的白细胞的液体。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述组织或组织级分选自全血、富含血小板的血浆、骨髓穿刺液、脂肪组织、和其混合物组成的组。
44.如权利要求42所述的方法，其中所述组织或组织级分包括全血。
45.如权利要求42所述的方法，其中所述组织或组织级分还包含抗凝血剂。
46.如权利要求42所述的方法，其中所述抗体是针对CD45的。
47.如权利要求42所述的方法，其中所述固态提取材料包括选自刚玉、石英、钛、葡聚糖、琼脂糖、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、和其混合物组成的组的成员。
48.如权利要求42所述的方法，其中所述固态提取材料包括聚丙烯酰胺。
49.一种治疗受治疗者的炎症的方法，包括向炎症部位施用根据权利要求42的方法制造的富含白介素-1受体拮抗剂的溶液。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述炎症与骨质溶解相关。
51.如权利要求49所述的方法，其中所述炎症与骨关节炎相关。
52.如权利要求49所述的方法，还包括向所述炎症部位施用纤维蛋白原、凝血酶、钙、或其组合。
53.如权利要求49所述的方法，其中所述组织或组织级分得自或来源于被治疗的受治疗者。
54.如权利要求49所述的·方法，其中所述富含白介素-1受体拮抗剂的溶液还包含以大于所述组织或组织级分中存在的可溶性肿瘤坏死因子受体的浓度的浓度的可溶性肿瘤坏死因子受体。
55.—种产生富含白介素-1受体拮抗剂的溶液的方法，包括: 将包含浓缩的白细胞的液体与固态提取材料接触；和 从所述固态提取材料分离液体以获得富含白介素-1受体拮抗剂的溶液，其中所述溶液中白介素-1受体拮抗剂的浓度大于将所述液体与所述固态提取材料接触之前所述液体中白介素-1受体拮抗剂的浓度； 其中所述包含浓缩的白细胞的液体通过将包含白细胞的组织或组织级分通过尺寸排阻滤器来制备。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述组织或组织级分选自全血、富含血小板的血浆、骨髓穿刺液、脂肪组织、和其混合物组成的组。
57.如权利要求55所述的方法，其中所述组织或组织级分包括全血。
58.如权利要求55所述的方法，其中所述组织或组织级分还包含抗凝血剂。
59.如权利要求55所述的方法，其中所述尺寸排阻滤器是白细胞减少或耗竭滤器。
60.如权利要求55所述的方法，其中所述组织或组织级分是全血或包含白细胞的富含血小板的血浆，且所述尺寸排阻滤器可被操作以捕获红细胞。
61.如权利要求55所述的方法，其中所述固态提取材料包括选自刚玉、石英、钛、葡聚糖、琼脂糖、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、和其混合物组成的组的成员。
62.如权利要求55所述的方法，其中所述固态提取材料包括聚丙烯酰胺。
63.一种治疗受治疗者的炎症的方法，包括向炎症部位施用根据权利要求55的方法制造的富含白介素-1受体拮抗剂的溶液。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述炎症与骨质溶解相关。
65.如权利要求63所述的方法，其中所述炎症与骨关节炎相关。
66.如权利要求63所述的方法，还包括向所述炎症部位施用纤维蛋白原、凝血酶、钙、或其组合。
67.如权利要求63所述的方法，其中所述组织或组织级分得自或来源于被治疗的受治疗者。
68.如权利要求63所述的方法，其中所述富含白介素-1受体拮抗剂的溶液还包含以大于所述组织或组织级分中存在的可溶性肿瘤坏死因子受体的浓度的浓度的可溶性肿瘤坏死因子受体。
69.—种产生富含白介素-1受体拮抗剂的溶液的方法，包括: 将包含白细胞的液体与固态提取材料接触； 对所述液体进行电磁场处理；和 从所述固态提取材料分离液体以获得富含白介素-1受体拮抗剂的溶液，其中所述溶液中白介素-1受体拮抗剂的浓度大于将所述液体与所述固态提取材料接触之前所述液体中白介素-1受体拮抗剂的浓度。
70.如权利要求69所述的方法，其中将包含白细胞的液体与固态提取材料接触包括在容器中合并所述包含白细胞的液体与所述固态提取材料。
71.如权利要求69所述的方法，其中所述液体选自全血、富含血小板的血浆、骨髓穿刺液、脂肪组织、和其组合组成的组。
72.如权利要求69所述的方法，其中所述液体包含全血或富含血小板的血浆。
73.如权利要求69所述的方法，其中所述液体还包含抗凝血剂。
74.如权利要求69所述的方法，其中对所述液体进行电磁场处理在将所述液体与所述固态提取材料接触时进行。
75.如权利要求69所述的方法，其中所述溶液中可溶性肿瘤坏死因子受体的浓度是以大于将所述液体与所述固态提取材料接触之前所述包含白细胞的液体中存在的所述可溶性肿瘤坏死因子受体的浓度的浓度。
76.如权利要求69所述的方法，其中所述包含白细胞的液体包括来源于选自全血、骨髓穿刺液、或其 组合组成的组的组织的白细胞级分。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述白细胞级分通过离心所述组织以相对于全血增加白细胞的浓度来制备。
78.如权利要求76所述的方法，其中所述白细胞级分由包括以下的方法制备: 将所述组织上样到试管中，所述试管包括在所述试管中布置的浮标，其中所述浮标具有的密度使得所述浮标可被操作以在所述试管中的所述组织被离心后到达平衡位置，所述平衡位置在第一级分与包含白细胞的第二级分之间，所述第二级分具有大于所述第一级分中白细胞浓度的白细胞浓度； 离心所述试管，从而所述浮标界定所述第一级分与所述第二级分之间的界面；和 取出所述第二级分。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述组织包括全血或包含白细胞的富含血小板的血浆。
80.如权利要求78所述的方法，其中所述试管还包括分离器和聚丙烯酰胺珠，所述分离器可被操作以界定所述第二级分与包含贫血小板血浆的级分之间的界面；所述聚丙烯酰胺珠作为在所述浮标与所述分离器之间布置的固态提取材料； 其中在所述离心后将所述第二级分接触所述聚丙烯酰胺珠。
81.如权利要求80所述的方法，其中对所述液体进行电磁场处理在将所述第二级分与所述聚丙烯酰胺珠接触时进行。
82.如权利要求76所述的方法，其中所述白细胞级分由包括以下的方法制备: 将所述组织上样到包含两个浮标的分离器中，所述浮标可被操作以将所述组织分离为包括包含白细胞的级分的三种或更多种级分； 离心所述分离器以产生所述包含白细胞的级分；和 从所述分离器提取所述包含白细胞的级分。
83.如权利要求69所述的方法，其中所述固态提取材料是选自刚玉、石英、钛、葡聚糖、琼脂糖、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、和其混合物组成的组的成员。
84.如权利要求69所述的方法，其中所述固态提取材料包括聚丙烯酰胺。
85.如权利要求69所述的方法,其中所述电磁场包括脉冲电磁场或电容稱合电磁场。
86.如权利要求69所述的方法，其中将所述包含白细胞的液体与所述固态提取材料接触和对所述液体进行电磁场处理在少于约I小时中进行。
87.一种治疗受治疗者的炎症的方法，包括向炎症部位施用根据权利要求69的方法制造的富含白介素-1受体拮抗剂的溶液。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述炎症与骨质溶解相关。
89.如权利要求87所述的方法，其中所述炎症与骨关节炎相关。
90.如权利要求87所述的方法，还包括向所述炎症部位施用纤维蛋白原、凝血酶、钙、或其组合。
91.如权利要求87所述的方法，其中所述包含白细胞的液体得自或来源于被治疗的受治疗者。
全文摘要
提供了有关产生和使用富含白介素-1受体拮抗剂的溶液的方法、系统和组合物。方法包括将包含白细胞的液体与固态提取材料接触并以电磁场刺激来活化白介素-1受体拮抗剂的产生。可从固态提取材料分离白介素-1受体拮抗剂。治疗患者的炎症部位的方法包括向该炎症部位施用富含白介素-1受体拮抗剂的溶液。
文档编号C07K1/14GK103249425SQ201180045732
公开日2013年8月14日 申请日期2011年8月24日 优先权日2010年9月3日
发明者乔尔·希金斯, 洁西·霍布纳尔, 詹妮弗·伍德尔-梅 申请人:巴奥米特生物公司