专利名称：玻连蛋白:角质化细胞生长因子嵌合体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及具有能够结合并激活角质化细胞生长因子(KGF)受体和玻连蛋白(VN)的整联蛋白受体的不同结构域的蛋白复合体。在特定的实施方案中，本发明涉及包含角质化细胞生长因子受体结合结构域和玻连蛋白的整联蛋白受体结合结构域的嵌合蛋白。更具体地，本发明涉及刺激细胞迁移的蛋白复合物和嵌合蛋白以及促进或诱导细胞迁移和/或增殖的组合物和方法。这些组合物和方法具有在伤口愈合、组织工程、美容和治疗处理例如皮肤置换以及需要上皮细胞迁移和/或增殖时烧伤的皮肤补充和治疗中的用途。在其他的实施方案中，本发明提供由本发明提供的涉及癌细胞转移(尤其是与乳腺癌有关的)的防止或抑制的治疗。
背景技术：
角质化细胞生长因子是参与广泛细胞过程包括增生、DNA合成、分化、细胞周期进行和凋亡抑制的促有丝分裂生长因子(Marchese等人，1990, J. Cell Physiol. 144 326-32)。这些作用是通过与其酪氨酸激酶连接的细胞表面受体，KFG受体，结合来介导的。玻连蛋白是血液和外细胞基质(ECM)中高丰度的糖蛋白。主要在肝脏中合成但由许多其他细胞类型表达。VN在血液中以闭合构象循环而以打开的或者延伸的构象在ECM中沉积(Schvartz 等人，1999, Int. J. Biochem. Cell Biol. 31 :531-44)。两种构象据信结合IGF-1I (Upton 等人，199 9, Endocrinologyl40 :2928-31 ；International Publication WO02/24219 ;McMurty 等人，1996,Endocrinology 150 149-60)并且同样结合多种其他配体，包括胶原蛋白(Morris 等人，1994, J. Bio. Chem. 269 :23845-52)、糖胺聚糖(Francois 等人，1999，J. Bio. Chem. 274 :37611-19)、多种其他ECM蛋白以及各种整联蛋白尤其是α ν整联蛋白的。事实上，玻连蛋白的主要作用是作为经由RGD结合基序与这些细胞表面整联蛋白受体粘性连接的ECM组织分子。VN受体(αν·联蛋白)已经显示调节生长和侵入所需的肌动蛋白细胞骨架重排，因此，VN结合整合细胞粘附和移动(DePasquale，1998,Histochemistryand Cell Biology 110 :485-94 ;Huang,2000, Oncogene 19:1915-23)。然而，就刺激生物学响应例如细胞迁移和/或增殖而言，以蛋白复合物存在的KGF和VN的相对贡献和它们各自的结构域依然不清楚。发明概述发明人发现包含KGF和VN的蛋白复合物通过结合并且协同共活化角质化蛋白生长因子和结合VN的整联蛋白受体来刺激细胞迁移和/或增殖。因此，本发明广泛涉及分离包含角质化细胞生长因子的受体结合结构域和能够结合整联蛋白受体的玻连蛋白的结构域的蛋白复合物，其中所述分离的蛋白复合物可共活化角质化细胞生长因子受体和整联蛋白受体并且由此引出生物学响应。在第一方面，本发明提供包含下列氨基酸序列的合成嵌合蛋白形式的分离的蛋白复合物(i)角质化细胞生长因子或能够结合角质化细胞生长因子受体的角质化细胞生长因子的至少一个分离的结构域；和
(ii)包含玻连蛋白(VN)的至少一个整联蛋白结合结构域的VN的一个或多个结构域。优选地，所述整联蛋白受体是Civ整联蛋白。更优选地，所述整联蛋白受体是ανβ3整联蛋白或ανβ5整联蛋白。本发明的这一方面在其范围内还包括相应于上文(i)和(ii)的氨基酸序列的氨基酸缺失、加入、取代和/或突变。在第二方面，本发明提供了编码所述第一方面的分离的蛋白复合物的分离的核酸。在第三方面，本发明提供包含在表达载体中与一个或多个调控序列可操作地连接的所述第二方面的分离的核酸的基因构建体。优选地，所述基因构建体是表达构建体。在第四方面，本发明提供包含所述第三方面的基因构建体的宿主细胞。在第五方面，本发明提供包含所述第一方面的分离的蛋白复合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。本发明的这一方面还预期包含所述第四方面的宿主细胞的药物组合物，其细胞表达所述合成蛋白。在第六方面，本发明提供所述第一方面的合成蛋白的特异性抗体。在第七方面，本发明提供促进细胞迁移的方法，其包括使用合成蛋白结合角质化细胞生长因子受体和整联蛋白受体的步骤。优选地，所述整联蛋白受体是αν整联蛋白。更优选地，所述整联蛋白受体是ανβ3整联蛋白或ανβ5整联蛋白。在优选的实施方案中，本发明的这一方面涉及促进或诱导上皮细胞/角质化细胞/成纤维细胞迁移和/或增殖以有利于动物尤其是人类中的伤口愈合。优选地，所述合成蛋白根据本发明的第一方面。在第八方面，本发明提供阻止细胞迁移和/或增殖的方法，包括阻止、抑制或另外的减少经由包含角质化细胞蛋白生长因子和玻连蛋白的复合物结合角质化细胞生长因子受体和整联蛋白受体的步骤。优选地，所述整联蛋白受体是Civ整联蛋白。更优选地，所述整联蛋白受体是ανβ3整联蛋白或ανβ5整联蛋白。在优选的实施方案中，本发明的这一方面涉及在哺乳动物尤其是人类中阻止或抑制癌细胞的迁移和/或增殖。本发明的这一方面预期的特定实例是癌细胞迁移的阻止和抑制。同样应当理解的是所述第七方面和第八方面的方法可包括治疗的预防性和治疗性方法。在第九方面，本发明提供使用所述第一方面的分离的蛋白复合物生产下列分子(i)包含角质化细胞生长因子和玻连蛋白的蛋白复合物的激动剂 或(ii)包含角质化细胞生长因子和玻连蛋白的蛋白复合物的拮抗剂。在一个实施方案中，本发明提供使用所述第一方面的分离的蛋白复合物生产下列分子
(i) KGF: VN蛋白复合物的激动剂；或(ii)KGF: VN蛋白复合物的拮抗剂。根据本发明的这一方面产生的激动剂和/或拮抗剂可在促进伤口愈合、组织工程、皮肤再生和/或防止癌细胞转移或皮肤的过度增生例如瘢痕化和银屑病上具有特殊功效。 在第十方面，本发明提供包含所述第一方面的分离的蛋白复合物的生物材料。在特定的实施方案中，所述生物材料可以是适合地浸透、包被或以其他形式包含本发明的分离的蛋白复合物的外科植入物、假体、支架、伤口或烧伤敷料或者类似物。附图简述
图1.玻连蛋白(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列，包括玻连蛋白中不同结构域的残基参照，以及残基修饰位点、配体结合位点和蛋白酶识别位点。图2. (a)全长VN(75kDa)和(b)卵黄VN(54kDa)的结构关系显不配体结合位点。哺乳动物和鸟类血清VN具有相同的结构域结构，然而，在氨基酸序列上有差别。卵黄VN(54kDa)是这些蛋白的截短的形式。所用的缩写是Som B，促生长因子B ;连接，连接结构域；血红素蛋白，血红素蛋白样重复；HBD，肝素结合结构域；PA1-1，纤溶酶原活化因子抑制剂-1 ;uPAR，尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体；TAT，凝血酶-抗凝血酶III复合物；uPA，尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂；一一，聚阴离子区(碱性区)；+++，聚阳离子区(酸性区)。图3. (A)成熟玻连蛋白(SEQ ID NO :2)、(B)成熟 KGF (SEQ ID NO :3)、(C)优选的连接子序列(SEQ ID NO :4-9)和⑶至⑶含KGF和VN的嵌合蛋白的实施方案(SEQ IDNO 10-14)的氨基酸序列。图4. (A)VNiKGF嵌合蛋白刺激初级角质化细胞迁移。响应于用VN = KGF嵌合体和对照包被的培养孔，被移去以允许向外迁移的接种插入物的内室中接种的分离的角质化细胞的迁移。每个条表示24小时孵育之后的细胞覆盖的平均面积(+/-SEM)并且从至少三个重复实验获得，其中在一式三份的孔中分析处理。(B) VN:KGF嵌合蛋白刺激初级成纤维细胞迁移。响应于用VN:KGF嵌合体和对照包被的培养孔，被移去以允许向外迁移的接种插入物的内室中接种的分离的皮肤成纤维细胞的迁移。每个条表示24小时孵育之后的细胞覆盖的平均面积(+/-SEM)并且从至少三个重复实验获得，其中在一式三份的孔中分析处理。(C) VNiKGF嵌合蛋白刺激初级角质化细胞增殖。响应于用VN:KGF嵌合体和对照包被的培养孔的分离的皮肤角质化细胞的增殖。每个条表示72小时孵育之后DNA结合GR染色的平均吸光度(代表细胞数目)(+/-SEM)并且从至少三个重复实验获得，其中在一式三份的孔中分析处理。(D) VNiKGF嵌合蛋白刺激初级成纤维细胞增殖。响应于用VN: KGF嵌合体和对照包被的培养孔的分离的皮肤成纤维细胞的增殖。每个条表示24小时孵育之后DNA结合GR染色的平均吸光度(代表细胞数目)(+/-SEM)并且从至少三个重复实验获得，其中在一式三份的孔中分析处理。图5.对VN = KGF嵌合蛋白和对照的初级角质化细胞和成纤维细胞信号响应。VNiKGF嵌合蛋白促进相对各自对照的相似水平的ERK1/2和AKT信号通路的活化(A)角质化细胞ERK1/2 ；⑶角质化细胞AKT ； (C)成纤维细胞ERK1/2 ；⑶成纤维细胞AKT。发明详述 本发明来自于包含KGF和VN的蛋白复合物通过由各自细胞表达的KGF受体和VN结合整联蛋白受体结合并表现它们对细胞迁移的生物学作用的发现。更具体地，这一双重结合事件协同刺激细胞迁移和/或增殖。尽管不希望限制于任何特定理论，但是认为与KGF相互作用或结合的VN的结构域是相应于成熟VN的氨基酸53-64的VN的聚阴离子区(SEQ ID NO 2)。这一发现使得本发明发明人提供包含与VN的整联蛋白结合结构域组合的能够与KGF受体结合的KGF的至少最小结构域或区。甚至更具体地,可生产包含这些结构域的单个的连续的蛋白。单个合成蛋白形式的这些蛋白复合物协同结合或共连接KGF受体和VN结合整联蛋白受体并且因此是对于促进细胞迁移和/或增殖和伤口愈合来说有用的剂。类似地，防止KGF受体和VN结合整联蛋白受体共连接可被用于预防癌细胞转移。整个说明书中，除了另外表明之外，“包含(comprise) ”、“包含(comprises) ”和“包含(comprising) ”是包括性而不是排他性使用的，因此所表示的整体或整体的集合可包括一个或多个另外的未表示的整体或整体的集合。在角质化细胞生长因子受体结合结构域和整联蛋白结合结构域的特定的上下文中，这样的结构域将包含所述结构域的氨基酸序列以及所期望的其他的额外的氨基酸。
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还应当理解的是这样的结构域可“基本上由所述结构域的氨基酸序列与不超过十个优选地不超过五个或甚至更优选地不超过四个、三个、两个或一个额外的氨基酸一起组成”。还应当理解的是这样的结构域可在不存在任何另外的氨基酸的情况下“由所述结构域的氨基酸序列组成”。为了本发明的目的，“分离”意指材料已经离开其天然状态或者由人进行了操作。分离的材料可以是实质上或基本上不含在天然状态下通常与其相伴的组分，或者可以进行操作以便使其与在天然状态下通常与其相伴的组分一起处于人工状态中。分离的材料包括天然和重组形式的材料。如本文中所用的，“合成”是指不是天然存在的而是通过人为技术干涉制备的。在合成蛋白和核酸的上下文中，其涵盖由重组、化学合成或本领域已知的技术组合所产生的分子。“蛋白质”是指氨基酸聚合物。氨基酸可以是天然或者非天然氨基酸，本领域中已知的D-或L-氨基酸。如本领域中所常用的，术语“蛋白质”还包括和涵盖术语例如“糖蛋白”、“脂蛋白”以及类似物。“肽”指的是具有少于50个氨基酸的蛋白质。“多肽“是指具有50个或更多氨基酸的蛋白质。如上文所述，在一个特定方面，本发明提供了合成嵌合蛋白形式的分离的蛋白质复合物，其包含如下的氨基酸序列(i)角质化细胞生长因子或能够结合角质化细胞生长因子受体的角质化细胞生长因子的至少一个结构域；和(ii)玻连蛋白或玻连蛋白的至少一个整联蛋白结合结构域。如本文中所用的，“嵌合蛋白”包括连续的氨基酸序列，所述氨基酸来源于玻连蛋白的整联蛋白受体结合结构域以及角质化细胞生长因子或角质化细胞生长因子的至少一个受体结合结构域。如本文所用的，“角质化细胞生长因子”是能够体外和/或体内调节细胞生长、分化、存活和/或迁移的生物学上有活性的蛋白(Marchese等人，1990，J. Cell Physiol. 144 326-32 ；UniProtKB/Swiss-Prot :#P21781，成熟蛋白包含完整序列的氨基酸残基32-194)mature protein comprises 氨基酸残基 32-194 of the complete sequenc)。本发明的合成嵌合蛋白形式的分离的蛋白复合物包含角质化细胞生长因子或能够结合角质化细胞生长因子受体的角质化细胞生长因子的至少一个结构域。在本文中，“结构域”意指至少能够结合角质化细胞生长因子受体的角质化细胞生长因子的部分或区域。通常，尽管不排他的，所述角质化细胞生长因子受体由细胞表达，并且所述角质化细胞生长因子的至少一个结构域与所述角质化细胞生长因子受体的结合和连接会引起细胞响应例如细胞生长、分化、存活和/或迁移。还应当理解的是本发明的合成嵌合蛋白形式的分离的蛋白复合物的另一个组分是玻连蛋白的至少一个整联蛋白结合结构域。优选地，所述整联蛋白受体是Civ整联蛋白。更优选地，所述整联蛋白受体是ανβ3整联蛋白或ανβ5整联蛋白。尽管不希望限制于任何特定理论，但是假定合成嵌合蛋白能够共连接并共活化角质化细胞生长因子的受体和VN的受体以由此刺激、诱导、增加或另外的促进细胞生长、分化、存活和/或细胞迁移。根据本发明的嵌合蛋白的优点是它们通过化学合成或重组方式容易地生产并且预期在体内更稳定，因为它们不依赖于维持在非共价寡聚蛋白复合物中所需的蛋白-蛋白相互作用。本发明预期不包括VN的C-末端肝素结合结构域(HBD)和/或聚阴离子区的合成嵌合蛋白的实施方案。“C-末端HBD”意指成熟VN序列的残基347-459 (SEQ ID NO :2)。Xu等人(2001，Proteins 44:312-20)已经证明VN在其中央区包含第二个HBD。本发明没有预期这一类似的HBD。就不包含C-末端HBD和/或聚阴离子区的VN蛋白及其氨基酸序列而言,可能有天然存在的蛋白例如54kD鸡卵黄VN(缺少C末端HBD)或者可以通过VN蛋白或氨基酸序列的缺失、突变或截短来工程化以使C末端HBD和/或聚阴离子区不存在或至少基本上无功能。如本领域内熟知的，技术例如蛋白水解降解和定位突变可被用于这一目的。在特定的实施方案中，所述VN的至少一个整联蛋白结合结构域具有选自由下列组成的组的氨基酸序列 ⑴VN的氨基酸残基I至459 ;(ii)VN的氨基酸残基I至379 ;(iii)VN的氨基酸残基I至346 ;(iv) VN的氨基酸残基I至311 ;(V)VN的氨基酸残基I至130 ;(vi)VN的氨基酸残基I至125 ;(vii)VN的氨基酸残基I至64 ;和
(viii)VN的氨基酸残基I至52 (所有均以成熟VN序列(SEQ ID NO 2)为参照)。可包括的另外的氨基酸序列选自由下列组成的组(ix) VN的氨基酸残基65至459 ； (X) VN的氨基酸残基343至376 ；(xi) VN的氨基酸残基347至459 ;和(xii) VN的氨基酸残基347至379 (所有均以成熟VN序列(SEQ ID NO :2)为参照)。上文所述的序列可组合使用，例如VN的氨基酸残基I至130和VN的氨基酸残基347至459或VN的氨基酸残基I至52和VN的氨基酸残基65至459。特别的，包含KGF和VN的嵌合蛋白的非限制性实例示于图3中并且包括(i)l_459 VN: (Gly4 Ser)4: 1-163 KGFiGly4 Ser Gly4:6 His ； (ii) 1-311VN: (Gly4Ser)4:1-163 KGFiGly4 Ser Gly4:6 His ； (iii) 1-125 VN: (Gly4 Ser)4:1-163KGFiGly4Ser Gly4:6 His ； (iv) 1-64 VN: (Gly4 Ser)4:1-163 KGFiGly4 Ser Gly4:6 His 和(v) 1-64VN: (Gly4 Ser)4:343-376 VN: (Gly4 Ser)4:1-163 KGFiGly4 Ser Gly4:6 His。在其他实施方案中，本发明提供了分离的蛋白质复合物，例如合成嵌合蛋白质形式，包含KGF和VN或包含VN的至少一个整联蛋白结合结构域的VN片段。在本文中，“片段”指的是VN的结构域、亚序列或部分。片段优选由成熟VN序列的少于500、少于400、少于300或更优选大约80-280个连续氨基酸构成。VN的整联蛋白结合结构域合适地包含RGD序列(成熟VN序列的45_47位氨基酸)。因此，在一个特定的实施方案中，所述合成嵌合体包含包含RGD序列的VN片段。优选地，如上文描述的合成嵌合蛋白还包含位于角质化细胞生长因子序列和VN氨基酸序列之间并且与角质化细胞生长因子序列和VN氨基酸序列顺序相连的“连接体序列”。在一个实施方案中，所述连接体序列包含一个或多个甘氨酸残基和一个或多个丝
氨酸残基。尽管没有限制于此，但连接体序列的特定的实例可选自Gly4 Ser(SEQ IDNO :4)；Gly4 Ser3 (SEQ ID NO :5) ； (Gly4 Ser) 3 (SEQ ID NO :6)和(Gly4 Ser)4(SEQID NO :7)。在另一个实施方案中，连接体序列包括纤维蛋白溶酶剪切识别位点(Sakiyama-Elbert 等人,2001, FASEB 15 1300-02)，例如根据序列Leu He Lys Met Lys Pro (SEQ ID NO :8)。在还有一个实施方案中，连接体序列包括胶原酶-3剪切识别位点(Kim &Healy,2003, Biomacromolecules 4 1214-23)，例如根据序列Gln Pro Gln Gly Leu Ala Lys(SEQ ID NO 9)本发明还延伸至使用本发明的合成嵌合蛋白的生物学上有活性的片段和/或使用本文所示例的角质化细胞生长因子受体结合结构域和整联蛋白受体结构域的生物学上有活性的片段。在一个实施方案中，所述“生物学上有活性的片段”具有其衍生自的蛋白质的不少于10%、优选不少于25%、更优选不少于50%以及甚至更优选不少于75%、80%、85%、90 %或95 %的生物学活性。
在另一个实施方案中，所述“生物学上有活性的片段”具有其衍生自的蛋白质的不少于10%、优选不少于25%、更优选不少于50%以及甚至更优选不少于75%、80%、85%、90 %或95 %的连续氨基酸序列。还预期本发明的变体蛋白复合物。典型地，涉及蛋白质时，“变体”蛋白质具有一或多个被不同氨基酸替换的氨基酸。本领域已知一些氨基酸能够被变为具有大致相似性质的其他氨基酸而不会改变蛋白质的活性特性(保守取代)。应当理解的是参照序列例如角质化细胞生长因子、角质化细胞生长因子的受体结合结构域、VN的整联蛋白结合结构域的一个或多个氨基酸残基或合成嵌合蛋白中存在一个或多个相应的残基可被修饰或缺失或加入额外的序列而基本上不改变本发明的分离的蛋白复合物的生物学活性。本发明预期的成熟VN(SEQ ID NO :2)中的特定突变包括⑴T50A ; (ii)T57A ;(iii) T50E ； (iv) T57E ； (v) S378E ； (vi) S378A 和(v) S362E。在一个实施方案中，蛋白质变体与参照氨基酸序列共享至少70%，优选地至少80 %和更优选地至少90 %、95 %、98 %或99 %的序列同一性。优选地，测量序列同一性超过参考序列的至少60 %，更优选超过至少75 %，更优选超过至少90%或更优选超过至少95%、98%或者基本上是全长。
为了确定序列同一性百分比，可以计算机执行算法(Intelligenetics的Geneworks程序；Wisconsin Genetics Software Package Release 7. 0 中的GAP、BESTFIT、FAST A和TFASTA,Genetics Computer Group, WI,USA)或检验以及由选择的不同方法中任一种产生的最佳比对(即在对比窗口中产生最高百分比同源性)进行氨基酸和/或核苷酸序列的最佳比对。关于BLAST程序家族的参考文献可见例如Altschul等人所公开的实例(1997，Nucl. Acids Res. 253389)。在另一例子中，“序列同一性”可以理解为意指由DNASIS计算机程序计算得到的“匹配百分比，，(windows 版本2. 5,来自自 Hitachi Software engineering Co. , Ltd. , SouthSan Francisco, California, USA)。有关序列分析的详细讨论可见于CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY的19. 3 单兀，Ausubel 等人编辑(John ffiley&Sons Inc NY, 1995-1999)。本发明还预期角质化细胞生长因子的受体结合结构域、VN的整联蛋白结合结构域或包含其的分离的蛋白复合物的衍生物。如本文所用，本发明的“衍生物”蛋白是已经例如通过用其他化学部分的添加、轭合或复合或者通过本领域中已知的翻译后修饰技术改变的蛋白。氨基酸的“添加”可以包括将多肽或其变体与其他多肽或蛋白融合。所述其他蛋白例如可以协助纯化蛋白。例如，这包括聚组氨酸标签、麦芽糖结合蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)、蛋白质A，或谷胱甘肽S-转移酶(GST)。本发明所预期的其他衍生物包括但不限于侧链修饰，在肽、多肽或蛋白质合成过程中掺入非天然氨基酸和/或其衍生物以及使用交联剂和对本发明的多肽、片段和变体施加构象约束的其他方法。本发明所预期的侧链修饰的实例包括氨基修饰，例如使用乙酸酐的酰化、使用丁二酸酐和四氢邻苯二甲酸酐的氨基的酰化、使用甲基乙酰亚胺酯的酰胺化、使用氰酸酯的氨基的氨甲酰化、使用吡哆醛-5-磷酸酯的赖氨酸的吡哆醛化以及之后的使用NaBH4的还原、通过与醛反应之后用NaBH4还原的还原烷基化以及用2，4，6_三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基进行三硝基苯基化。羧基基团可以通过经由O-酰基异脲形成以及随后的衍生(derivitization)对例如相应的酰胺进行的碳二亚胺活化而修饰。精氨酸残基的胍基可以通过与试剂如2，3_ 丁二酮、苯甲酰甲醛与乙二醛形成杂环缩合产物而修饰。巯基可以通过例如过甲酸氧化成磺基丙氨酸，使用4-氯汞基苯磺酸、4-氯汞苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基酚、氯化苯汞以及其他汞制剂形成汞制剂衍生物，与其他巯基化合物形成混合二硫化物，与马来酰亚胺、马来酸酐或其他取代的马来酰亚胺反应，用碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化和在碱性PH下用氰酸酯氨甲酰化的方法而修饰。色氨酸残基可以例如通过使用2-羟基-5-硝基苄基溴或磺酰齒化物的吲哚环烷基化或通过使用N-溴代丁二酰亚胺氧化进行修饰。酪氨酸残基可以通过与四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物来修饰。组氨酸残基的咪唑环可以通过使用焦碳酸二乙酯的N-乙氧羰基化或使用碘乙酸衍生物的烷基化而修饰。在多肽合成过程中掺入非天然氨基酸和衍生物的实例包括但不限于使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羟基-6-庚酸、叔丁基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D异构体。适合蛋白化学衍生化的方法的实例见CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE的第 15 章，Coligan 等人编辑，John ffiley&Sons NY(1995-2001)。分离的蛋白复合物及其各个蛋白组分(包括片段、变体、衍生物及同源物)可以通过本领域技术人员已知的任何合适方法制备。在一个实施方案中，本发明的蛋白质可通过化学合成生产。化学合成技术在本领域中是熟知的，但本领域技术人员可以参考CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCEColigan等人编辑，John ffiley&Sons NY(1995-2001)第18章中合适的方法学。在另一个实施方案中，蛋白质可以制备为重组蛋白。重组蛋白的生产在本领域中是已知的，但本领域技术人员可以参考标准步骤，例如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press,1989)，尤其是第 16 和 17 节；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Ausubel 等人编辑，(John ffiley&Sons, Inc. 1995-1999)，尤其是第 10 和 16 章以及 CURRENT PROTOCOLS INPROTEIN SCIENCE Coligan 等人编辑，(John ffiley&Sons, Inc. 1995-1999)，尤其是第 1、5和6章中描述的。在一个实施方案中，通过如下方法产生重组蛋白，所述方法包括步骤(i)制备表达构建体，其包含在表达载体中与一或多个调控核苷酸序列可操作地连接的编码所述蛋白质的核酸；(ii)用所述表达构建体转 染或转化宿主细胞；和(iii)在所述宿主细胞中表达所述重组蛋白。
“表达载体”可以是自我复制的染色体外载体如质粒，或者是整合至宿主基因组中的载体。“可操作地连接”或“可操作地连结”是指所述调控核苷酸序列位于相对于本发明的重组核酸以起始、调节或以其他方式控制核酸转录或所述核酸编码的蛋白的翻译的位置。通常调控核苷酸序列是适合于用于表达的宿主细胞的。对于许多宿主细胞，本领域已知很多类型的适合的表达载体和适合的调控序列。典型地，所述一或多个调控核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、剪接供体/受体序列以及增强子或激活子序列。组成型启动子(例如CMV、RSV、腺病毒、SV40以及人类延长因子启动子)和诱导型/抑制型启动子(例如tet-抑制型启动子和IPTG-、金属硫蛋白-或蜕皮激素-诱导型启动子)在本领域中是已知的并且预期在本发明中。应当理解的是启动子也可以是一种以上的启动子元件的杂合启动子。表达构建体还可以包括融合配偶体(典型地是由表达载体所提供)以使本发明的重组蛋白表达为与所述融合配偶体一起的融合蛋白。融合配偶体的主要优点是它们有助于所述融合蛋白的鉴定和/或纯化。融合蛋白的已知实例包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、人IgG的Fe部分、麦芽糖结合蛋白(MBP)以及六组氨酸(HIS6),其特别用于通过亲和层析分离融合蛋白。为了通过亲和层析纯化融合蛋白，用于亲和层析的相关基质分别为谷胱甘肽_、直链淀粉-和镍-或钴-轭合树脂。许多这样的基质是以“试剂盒”形式提供，如QIAexpress 系统(Qiagen),可与HIS6 融合配偶体和Pharmacia GST纯化系统一起使用。在一些情况下，融合配偶体还可具有蛋白酶切割位点，例如Xa因子或凝血酶，其使得相关蛋白酶能够部分地消化本发明的融合蛋白并由此释放本发明的重组多肽。释放的蛋白质可以通过后续的层析分离方法将其从融合配偶体中分离。本发明的融合配偶体还包括“表位标签”，其通常是可获得特异性抗体的短肽序列。可以容易地获得特异性单克隆抗体的表位标签的已知实例包括c-myc、血凝素和FLAG标签。尽管不限于此，但适于表达的宿主细胞可以是原核或真核的，例如大肠杆菌(Escherichia coli)(诸如DH5 α )、酵母细胞、使用杆状病毒表达系统的Sf9细胞、CHO细胞、C0S、CV-1、NIH3T3 和 293 细胞。表达构建体还可以包括一或多个选择标记核苷酸序列，其使转化的宿主细胞对于选择剂具有抗性。尽管不限于此，但可用于选择转化细菌的选择标记包括bla、kanR和tetR,而转化的真核细胞可以通过例如潮霉素、G418和嘌呤霉素等标记来选择。就将遗传材料引入到宿主细胞而言，术语“转化”和“转染” 一般是用于描述将遗传材料引入到宿主细胞。有很多已知方法可以将外源遗传材料引入到宿主细胞中，包括但不限于磷酸I丐沉淀，电穿孔，lipofectamine、Iipofectin和其他亲脂剂传送,磷酸I丐沉淀，DEAE-Dextran转染,微粒轰击,显微注射和原生质体融合。本发明提供了编码本发明的合成的嵌合蛋白的分离的核酸，包括其变体及同源物。如本文所用的，术语“核酸”是指单链或双链mRNA、RNA、cRNA、RNAi和DNA，包括cDNA和基因组DNA以及DNA-RNA杂种。“多核苷酸”是具有80或更多个连续核苷酸的核酸，而“寡核苷酸”含有少于80个连续核苷酸。“探针”可以是单链或双链寡核苷酸或多核苷酸，为了例如在RNA印迹或DNA印迹中检测互补序列而被适当地标记。“引物”通常是单链寡核苷酸，优选具有15-50个连续核苷酸，其能够退火至互补的核酸“模板”并在DNA聚合酶例如Taq聚合酶、RNA依赖性DNA聚合酶或Sequenase 作用下以模板依赖性方式延伸。如本领域中已熟知的，本发明的合成核酸可以通过化学合成方法产生或者通过利用核酸序列扩增技术的重组方法或通过其组合产生。根据本发明的化学合成引物和寡核苷酸、合成物以及相关技术通常可在大多数实验室获得或者可以购自商业来源。尽管不限于此，适合的核酸扩增技术是本领域技术人员熟知的，包括例如CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 的第 15 章 Ausubel 等人编辑，(John ffiley&Sons,Inc. 1995-1999)所描述的聚合酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR);例如美国专利5，422，252 描述的链置换扩增(SDA);例如 Liu 等人(1996，J. Am. Chem. Soc. 118 :1587)、国际申请W092/01813和W097/19193所描述的滚环复制(RCR);例如Sooknanan等人(1994，Biotechniques 171077)所描述的基于核酸序列的扩增(NASBA)以及例如Tyagi等人(1996，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA93 :5395-4000)所描述的 Q-β 复制酶扩增。优选的核酸序列扩增技术是PCR。如本文所用的，“扩增产物”是指由核酸扩增技术产生的核酸产物。在本发明核酸的产生和表达中，可利用密码子序列冗余方面的优势，以使本文所举例的核酸可以在不改变编码的氨基酸序列的情况下进行修饰。在特定实施方案中，如本领域所熟知的，可根据宿主细胞的偏好“密码子使用”来优化核酸，以用于重组表达。这可以在偏好密码子使用影响蛋白表达时有效地为特定生物体或其细胞中的最优表达“定制”核酸。因此，本发明包括与本文举例的核酸同源的合成核酸。在一个实施方案中，核酸同源物与编码本文所描述的合成嵌合蛋白构建体中任一个的核酸具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、甚至更优选至少95%的序列同一性。 优选地，序列同一性测量超过本发明的编码核酸的至少70 %、更优选至少80 %、甚至优选至少90%、95%或有益地基本上是全长。在另一个实施方案中，在高严格性条件下，核酸同系物能与编码本文所描述的合成嵌合蛋白质构建体中的任一个的核酸杂交。本文使用的“杂交(Hybridize)和杂交(hybridization) ”用于表明产生DNA-DNA、RNA-RNA或DNA-RNA双链体的至少部分互补的核苷酸序列的配对。如本领域中熟知的，杂交的序列通过互补的嘌呤和嘧啶之间的碱基配对发生。
在这方面，应当理解的是修饰的嘌呤(例如肌苷、甲基肌苷和甲基腺嘌呤)和修饰的嘧啶(硫基尿嘧啶和甲基胞嘧啶)同样可以参与碱基配对。如本文所用的，“严格性”是指在杂交时的温度和离子强度条件以及是否存在某些有机溶剂和/或去污剂。严格性越高，杂交核苷酸序列之间也就需要越高的互补性水平。“严格性条件”是指只有具有高互补碱基频率的核酸杂交的那些条件。本文的高严格性条件包括和涵盖(i)至少约31% v/v至至少约50% v/v的甲酰胺和至少约O. OlM至至少约O. 15M的盐用于在42°C杂交以及至少约O. OlM至至少约O. 15M的盐用于在42°C洗脱；(ii) I % BSAUmM EDTA、0. 5M NaHP04 (pH 7· 2)、7 % SDS 用于在 65°C 杂交，以及(a) O.1x SSC、0. 1% SDS 或(b)0. 5% BSA、lmM EDTA、40mM NaHPO4 (ρΗ7· 2)、1% SDS 用于在高于65°C的温度洗脱大约I个小时，以及(iii)0. 2x SSC、0. 1% SDS 用于在 68°C或高于 68°C下洗脱约 20 分钟。通常，洗脱在1 = 69. 3+0. 41(G+C)%-12°C进行。通常，双链DNA的Tm随错配碱基数每增加I %而降低约rc。尽管如此，严格性条件是本领域熟知的，例如在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY的第2. 9和2. 10章尤其是2. 9.1页至2. 9. 20页中描述的，Ausubel等人编辑(JohnWiley & Sons Inc NY,1995-1999)。本发明还预期针对本发明的合成嵌合蛋白包括嵌合蛋白或其片段、变体和/或衍生物的抗体。本发明的抗体可以 是多克隆或单克隆的。可以找到可用于抗体生产、纯化和使用的已知方案，例如在Co I i gan等人，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (Johnffiley&Sons NY, 1991-1994)第 2 章以及 Harlow, E. &Lane, D. Antibodies A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory,1988。通常，本发明的抗体与本发明的多肽、片段、变体或衍生物结合或轭合。例如，抗体可以包括多克隆抗体。这些抗体可以通过例如将本发明的多肽、片段、变体或衍生物注射到生产物种中以获得多克隆抗血清来制备，所述物种可以包括小鼠或兔。生产多克隆抗体的方法是为本领域技术人员熟知的。能够使用的示例性方法例如描述于Coligan等人，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons NY，1991-1994)以及Harlow，E.&Lane, D. Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring HarborLaboratory, 1988 中。作为在生产物种中获得的多克隆抗血清的替代，单克隆抗体也可以使用标准方法来生产，例如KShler&Milstein (1975, Nature 256 :495-97)所描述的，或通过其更多近期的修改的方法来生产，例如在Coligan等人，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (JohnWiley & Sons NY, 1991-1994)中所描述的)通过使来源于已经接种一或多种本发明的多肽、片段、变体或衍生物的生产物种的脾细胞或其他抗体生产细胞永生化。本发明在其范围内包括如上文所述的多克隆或单克隆抗体的Fe或Fab片段。可选择地，抗体可包括针对本发明的蛋白的单链Fv抗体(scFv)。这些scFv可以例如根据分别描述于美国专利 5，091，513、欧洲专利 239，400 或 Winter&Milstein (1991，Nature 349 293-99)的文章描述的方法制备。可以将标记与抗体或抗体片段连接。
标记可以选自如下的组，包括发色团、催化剂、酶、荧光团、化学发光分子、镧系离子例如铕(Eu34)、放射性同位素和直接可见的标记。在直接可见的标记的实例中，可使用胶体金属或非金属粒子、染料颗粒、酶或底物、有机聚合物、乳胶颗粒、脂质体或其他含有产生信号的物质的小泡以及类似物。有很多可以用作标记的酶在美国专利4，366，241、美国专利4，843，000和美国专利4，849，338中公开。本发明可以使用的酶标记包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶、b-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶以及类似物。这些酶标记可以单独使用或与第二种酶在溶液中组合使用。例如，虽然不限于此，荧光团可以是异硫氰酸荧光素(FITC)、俄勒冈绿、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITL)、别藻蓝蛋白(APC)和R-藻红蛋白(RPE)。本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的分离的蛋白质复合物，包括其变体和衍生物。虽然不限于此，这些分离的蛋白复合物可以是任何形式，包括本发明的合成嵌合蛋白。本发明的药物组合物可以用于促进或以其他方式有利于细胞迁移、组织再生和伤口愈合。可选择地，可以施用药物组合物以通过防止或抑制肿瘤细胞迁移到第二部位来预防肿瘤转移。该组合物根据需要可用于治疗性或预防性治疗。例如，药物组合物可以以治疗制品或化妆品制品的形式应用于皮肤修复、伤口愈合、烧伤愈合和其他皮肤病学治疗。在这方面，药物组合物可以与生物材料、生物聚合物、无机材料例如羟基磷灰石或其衍生物、外科植入物、假体、伤口或烧伤敷料、压缩物、绷带以及类似物共同施用或作为其成分(其适当地浸透、包被 或以其他方式包含所述药物组合物)。适合地，所述药物组合物包括适合的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。优选所述药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂适合于施用于哺乳动物、更优选人类。“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”是指能够安全地用于系统施用的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。根据施用的特定途径，本领域熟知的很多载体都可以使用。这些载体可以选自以下列的组，包括糖，淀粉，纤维素及其衍生物，麦芽，明胶，滑石粉，硫酸钙，植物油，合成油，多元醇，褐藻酸，磷酸盐缓冲溶液，乳化剂，等渗盐水和盐例如无机酸盐包括氢氯化物、溴化物和硫酸盐，有机酸例如乙酸、丙酸和丙二酸以及无热原水。一篇描述药学上可接受载体、稀释剂和赋形剂的有用参考文献是Remington' sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co. N. J. USA,1991)。可以使用任一种安全施用途径给患者提供本发明的组合物。例如，可使用口服、直肠、胃肠外、舌下、口腔、静脉、关节内、肌肉、皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内、透皮以及类似途经。剂型包括片剂、分散剂、悬浮液、注射剂、溶液、糖浆、锭剂、胶囊、栓剂、气溶胶、经皮贴片以及类似剂型。这些剂型也包括专门为该目的而设计的注射或移植控制释放装置或者以这种方式作用的改进的其他形式的移植物。治疗剂的控制释放可能通过例如用疏水聚合物包被而实现，所述疏水聚合物包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚羟基酸和某些纤维素衍生物例如羟丙基甲基纤维素。此外，还可以使用其他聚合物基质、脂质体和/或微球实现控制释放。上述组合物可以以与所述剂型相容的方式并且以药学有效量施用。在本发明的背景下，施用给患者的剂量应当足以在一段合适的时间内在患者中实现有益的响应。药物的施用量可以取决于待治疗的个体，包括其年龄、性别、体重以及一般健康状况和取决于医生所判断的因素。关于用于伤口愈合的药物组合物，特别的参考文献是美国专利5，936，064和国际公开 W099/62536。本发明的药物组合物还可以包括表达载体例如病毒载体例如牛痘以及基因治疗中使用的病毒载体。后者包括腺病毒和腺病毒相关病毒(AAV)例如Braun-Falco等人(1999, Gone Thor. 6 :432-41)所描述的，逆转录病毒和慢病毒载体例如guchshacher等人(2000，Blood 95 =2499-504)所描述的，来源于单纯疱疹病毒和巨细胞病毒的载体。在Stone等人(2000, J. Endocrinol. 164 :103-18)中全面概述了用于内分泌基因治疗的病毒载体。本发明还可以利用特定的表达载体，该载体能够将基因表达靶向表皮细胞，例如美国专利5，958，764所描述的以及用于体内伤口愈合应用，例如美国专利5，962，427所描述。本发明提供了使用分离的蛋白复合物(包括本发明的合成嵌合蛋白)进行治疗的方法。这些方法特别旨在哺 乳动物更特别地人类的治疗性和/或预防性治疗。然而,本发明的治疗应用也可以用于哺乳动物例如家养动物和伴侣动物,表演动物例如如马、骆驼和灰狗，牲畜，实验动物和用作异种移植的细胞、器官和组织来源的动物。
本发明还涉及美容治疗方法，其中分离的蛋白复合物，包括本发明的合成的嵌合蛋白，被施用以改善或提高皮肤质量或皮肤外观。这种治疗可能包括由于皮肤细胞异常增殖所造成的皮肤疾病例如牛皮癣和增生性疤痕的预防或补救。可选择地，预期治疗方法，其中通过阻断肿瘤细胞向第二部位迁移而预防或抑制肿瘤转移。另外，还预期通过阻断细胞增殖来治疗癌症的方法。在特定实施方案中，治疗性和/或预防性治疗可以将分离的蛋白复合物，包括本发明的合成嵌合蛋白与下列联合使用或作为下列的成分适当地用所述分离的蛋白质复合物浸溃、包被或以其他方式包含所述分离的蛋白质复合物的生物材料、生物聚合物、无机材料如氟羟基磷灰石、外科植入物、假体、伤口或烧伤敷料、压缩物、绷带和类似物。这些方法包括施用如前文所定义的药物组合物，可以通过例如美国专利6，090，790所描述的对特定组织位点的微针注射，例如美国专利6，054，122所描述的应用于伤口、烧伤或溃疡的局部药膏、洗剂或密封敷料或例如国际公开W099/47070所描述的释放组合物的移植物进行。在这方面基因治疗同样可适用，例如根据美国专利5，929，040和美国专利5，962，427中的方法。也还存在为了产生皮肤替代品而对皮肤细胞进行遗传修饰的方法，例如遗传工程化所需生长因子表达(Supp等人,2000, J.1nvest. Dermatol. 114 :5-13)。对于这个领域的综述的实例由 Bevan 等人(1999, Biotechnol. Gent. Eng. Rev. 16 :231-56)提供。同样预期的是用转染或转化细胞“种植”受体，例如国际公开W099/11789所描述的。这些方法可用于刺激细胞迁移并由此促进或进行伤口和烧伤愈合，修复皮肤病变例如溃疡，组织置换和移植例如通过体外培养自体皮肤，内部器官例如肾脏和肺的重新上皮化以及修复损伤的神经组织。皮肤置换治疗在本领域中已经变得熟知，其可以使用共培养的上皮细胞/角质细胞的细胞系，例如Kehe等人(1999，Arch. Dermatol. Res. 291 :600-05)所描述或者体外培养原代(通常是自体)表皮细胞、真皮细胞和/或角质化细胞。这些技术还可利用工程化的生物材料和合成的聚合物“支架”。该领域综述的实例通常在Terskikh & Vasiliev (1999, Int. Rev. Cytol. 188 41-72)和 Eaglestein & Falanga(1998, Cutis 62 1-8)中提供。更特别地，用于颅面手术中口腔粘膜替代物的生产描述于Izumi等人(2000，J. Dent. Res. 79 =798-805)中。胎儿角质形成细胞和真皮肤成纤维细胞可以在体外扩增以产生用于移植的皮肤以治疗皮肤病变，例如Fauza等人(1998，J. Pediatr. Surg. 33:357-61)中所描述的，而来源于在透明质酸衍生的生物材料上体外培养的真皮和表皮皮肤元件的皮肤替代物已经显示出在治疗烧伤中可能是有用的(Zacchi等人，1998，J. Biomed.Mater. Res. 40 :187-94)。同样预期聚合物支架，其目的在于促进置换皮肤工程化，例如Sheridan等人(2000, J. Control Release `64:91-102)和 Fauza 等人(998，J. Pediatr. Surg. 33 :357-61)所描述的，以及作为用于将皮肤细胞递送至伤口和烧伤部位的药剂的微球(LaFrance &Armstrong,1999, Tissue Eng. 5 :153-70)。本发明预期使用分离的蛋白复合物(包括本发明的合成嵌合蛋白)鉴定、筛选、设计或以其他方式生产包含角质化细胞生长因子和玻连蛋白的复合物的拮抗剂或激动剂。这些剂可以是“模拟物”。如本领域中所熟知的，本文使用的术语“模拟物”是指被设计用于模拟蛋白质或多肽的特定功能区的分子，并且在其范围内包括术语“激动剂”、“类似物”和“拮抗剂”。在一个实施方案中，生产了通过KGF = VN复合物模拟角质化细胞生长因子受体和VN受体结合的激动剂。这些分子可以用作例如伤口愈合、皮肤再生等所需的细胞迁移的刺激物。在另一个实施方案中，生产了通过KGF = VN复合物防止或抑制与角质化细胞生长因子受体和整联蛋白受体结合的拮抗剂。这些分子具有作为细胞迁移和/或细胞增殖的抑制剂并由此可构成有用的抗肿瘤剂的使用以及在由异常细胞增殖导致的皮肤疾病例如牛皮癣和增生性疤痕的治疗中的使用。上述模拟物、激动剂、拮抗剂和类似物可能是具有所需生物学活性和半衰期的肽、多肽或其他有机分子，优选有机小分子。计算机辅助结构数据库搜索越来越多地被用于鉴定模拟物的程序。从原理上说，数据库搜索方法可适于鉴定模拟物，这些方法可参见国际公开WO 94/18232(旨在生产HIV抗原模拟物)、美国专利5，752，019以及国际公开WO 97/41526(旨在鉴定EPO模拟物)。
其他方法包括多种鉴定分子相互作用的生物物理学技术。这些方法使得可以根据例如候选分子是否影响KGF:VN复合物的成来筛选候选分子。⑶RRENT PROTOCOLS INPROTEIN SCIENCE Coligan 等人编辑(John Wiley&Sons，1997)第 20 章提供了适用这些潜在有用技术的方法，例如竞争性放射配体结合测定(相关方法参见Upton等人，1999，Endocrinology 140 :2928-31),分析性超离心,微量热法,表面等离子体共振和基于光学生物传感器的方法。因此，为了本发明可以更容易理解和实施，本领域技术人员可参考下列非限制性实施例。
实施例实施例1KGF: VN嵌合物刺激细胞迁移和增殖KGF:VN chimer as stimulate cell migration 和 proliferation将分离的人类角质化细胞和成纤维细胞(分别是Pl和P3)应用于用不同剂量的VNiKGF嵌合物和对照预处理的培养孔中接种环的内室。接触4小时后，移开接种环并且允许细胞响应于对角质化细胞超过24小时和对成纤维细胞超过48小时的预结合处理而向外迁移。从至少3个独立实验收集细胞测定数据，每个实验具有一式三份独立的测试并且结果表示为大于SG/SFM(阴性对照)的百分比并且示于图4A和4B。误差条表示SEM。SG =处理的绿色培养基，SFM=无血清培养基(两者均为阴性对照)。就使用分离的人类皮肤角质化细胞的实验而言，VN:KGF嵌合物证明功能上与各个组分(VN+KGF)的等摩尔组合相当，表明正确的蛋白表达、纯化和加工。检测分离的皮肤成纤维细胞的实验表明VN = KGF嵌合物诱导显著(P =< 0.05)高于各个组分(VN+KGF)等摩尔混合的细胞迁移。为了评价诱导VN = KGF嵌合物的潜力的增殖，分离的人类角质化细胞和成纤维细胞(分别是Pl和P3)以15，000个细胞/cm2的密度被接种至用不同剂量的VN = KGF嵌合物和对照预处理的孔中。使得角质化细胞和成纤维细胞分别增殖超过72和48小时并且之后移除培养基并将培养板于_80°C迅速冷却。当解冻板时，将细胞溶解物和GR染料(Invitrogen，CYQUANT试剂盒)的混合物加至每个孔并且于室温孵育5分钟。之后将板通过在485nm激发来探测荧光并且在520nm读取吸光率。从至少3个独立实验收集细胞测定数据，每个具有一式三份独立的测试并且结果表示为超过SG/SFM(阴性对照)的百分比并且示于图4C和4D。误差条表示SEM。SG =处理的绿色培养基，SFM =无血清培养基(两者均为阴性对照)。检测分离的人类皮肤角质化细胞中的增殖的实验证明VN:KGF嵌合物功能上等同于各个组分(VN+GF)的等摩尔组合。使用分离的皮肤成纤维细胞的增殖实验表明VN = KGF嵌合物(150nM)诱导的细胞增殖显著(P = 0.05)高于各个组分的等摩尔混合和四聚的 VN:1GFBP-3:1GF-1 :EGF 复合物实施例2VN: KGF 信号为了评估VN = KGF嵌合蛋白对ERK1/2和AKT信号通路的影B向，使用CELISA(Millipore)试剂盒。简单地，20，000个初级角质化细胞或10，000个成纤维细胞被接种于96孔黑底荧光板的孔中并且使其于37°C生长过夜。之后将细胞用无血清培养基(SFM)清洗两次并且在SFM中孵育过夜以使细胞血清饥饿。约16小时后，将血清饥饿培养基用100 μ I如下的蛋白处理替换仅VN(15ηΜ,相当于1125ng/mL)、VN(15nM,相当于1125ng/mL)和 KGF(50nM，相当于 820.4ng/mL)以及￥11 (5011]\1，相当于1318.91^/1^)。将细胞暴露于蛋白处理10分钟、30分钟和60分钟的时间点,之后用溶于TBS的4%甲醒替换处理溶液以固定细胞。之后使用基于抗体的方法(ELISA)按照操作手册将细胞的活化的(磷酸化的)ERK 1/2和AKT水平分别测定为总ERK1/2和AKT的分数。 实施例3合成嵌合玻连蛋白角质化细胞生长因子蛋白本文提供的是VN = KGF嵌合物形式的本发明的合成嵌合蛋白。合成嵌合蛋白包括与角质化细胞生长因子融合的任何全长或截短形式的VN，具有或不具有氨基酸残基修饰。此外，VN和角质化细胞生长因子可与或不与不同的肽连接体融
八
口 ο设计一系列的嵌合表达构建体，其中不同长度的VN蛋白与全长的成熟GF蛋白或KGF蛋白能够与角质化细胞生长因子受体结合的至少一个结构域连接，在每个实例中，VIM片段优选地经由连接体与KGF序列连接，例如Gly4 Ser(SEQID NO :4)连接体、Gly4 Ser3(SEQID NO :5 连接体、(Gly4 Ser) 3 (SEQ ID NO :6 连接体或(Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO 7)连接体。示例性的合成嵌合蛋白包括但不限于A) 1-459VN:[连接体；例如(G4S)4] : 1-163KGF:[连接体；例如 G4SG4] :6HB) 1-311VN:[连接体；例如(G4S)4] : 1-163KGF:[连接体；例如 G4SG4] :6HC) 1-125VN:[连接体；例如(G4S)4] : 1-163KGF:[连接体；例如 G4SG4] :6HD) 1-64VN:[连接体；例如(G4S)4] : 1-163KGF:[连接体；例如 G4SG4] :6HE)1-64VN:[连接体；例如(G4S)4] :343-376VN:[连接体；例如(G4S)4] : 1-163KGF:[连接体；例如 G4SG4] :6H。整个说明书的目的在于描述本发明的优选实施方案而不是将本发明限制为任何一个实施方案或特定特征的集合。因此本领域技术人员应当理解的是根据本公开内容。可以对所举出的特定实施方案进行各种修饰和改变而不背离本发明的范围。本文引用的所有计算机程序、算法、专利和科学文献均通过引用并入本文。
权利要求
1.一种合成嵌合蛋白形式的分离的蛋白复合物，其包含下列氨基酸序列 (i)角质化细胞生长因子(KGF)，或者KGF的至少一个结构域，其能够与角质化细胞生长因子受体结合；和 (ii)玻连蛋白(VN)的一个或多个结构域，其包含VN的至少一个整联蛋白结合结构域。
2.如权利要求1所述的分离的蛋白复合物，其中所述包含VN的至少一个整联蛋白结合结构域的VN的一个或多个结构域不包括C-末端肝素结合结构域(HBD)。
3.如权利要求2所述的分离的蛋白复合物，其包含成熟VN序列(SEQIDNO 2)的氨基酸 1-346。
4.如权利要求1-3所述的分离的蛋白复合物，其中所述整联蛋白结合结构域是av—联蛋白结合结构域。
5.如权利要求4所述的分离的蛋白复合物，其中所述整联蛋白结合结构域是aJ3整联蛋白结合结构域或a 5整联蛋白结合结构域。
6.如权利要求1所述的分离的蛋白复合物，其中所述包含VN的至少一个整联蛋白结合结构域的VN的一个或多个结构域包含成熟VN序列(SEQ ID N02)的氨基酸1_311。
7.如权利要求1所述的分离的蛋白复合物，其中所述包含VN的至少一个整联蛋白结合结构域的VN的一个或多个结构域包含成熟VN序列(SEQ ID N02)的氨基酸1_125。
8.如权利要求1所述的分离的蛋白复合物，其中所述包含VN的至少一个整联蛋白结合结构域的VN的一个或多个结构域包含成熟VN序列(SEQ ID NO 2)的氨基酸1_64。
9.如权利要求1所述的分离的蛋白复合物，其中所述包含VN的至少一个整联蛋白结合结构域的VN的一个或多个结构域包含成熟VN序列(SEQ ID NO 2)的氨基酸1_52。
10.如权利要求9所述的分离的蛋白复合物，其中所述包含VN的至少一个整联蛋白结合结构域的VN的一个或多个结构域不包含相应于成熟VN序列(SEQ ID NO 2)的氨基酸53-64的聚阴离子氨基酸序列。
11.如前述权利要求中任一项所述的分离的蛋白复合物，其还包含VN的另外的片段。
12.如前述权利要求中任一项所述的分离的蛋白复合物，其还包含至少一个连接体序列。
13.如权利要求12所述的分离的蛋白复合物，其中所述连接体序列包含蛋白酶剪切位点。
14.如权利要求12所述的分离的蛋白复合物，其中所述连接体序列选自由下列组成的组(i)Gly4Ser (SEQ ID NO :4)；(ii)Gly4Ser3(SEQ ID NO :5)；(iii)(Gly4Ser)3(SEQ ID NO :6)；(iv)(Gly4 Ser)4(SEQ ID NO :7)；(v)LeuHe Lys Met Lys Pro (SEQ ID NO :8);和(vi)GlnPro Gln Gly Leu Ala Lys(SEQ ID NO :9)。
15.如权利要求12所述的分离的蛋白复合物，其中所述合成嵌合蛋白包含1-459VN:(Gly4 Ser)4:1-163 KGFiGly4 Ser Gly4:6 His(SEQ ID NO 10) ,1-311VN:(Gly4Ser)4:1-163 KGFiGly4 Ser Gly4:6 His (SEQ ID N0:ll)、l_125 VN: (Gly4Ser)4:1-163KGFiGly4 Ser Gly4:6 His(SEQ ID NO 12),1-64 VN:(Gly4 Ser)4:l-163KGF:Gly4 SerGly4:6 His (SEQ ID NO :13)或 1-64 VN: (Gly4 Ser)4:343-376 VN: (Gly4Ser)4:1-163KGFiGly4 Ser Gly4:6 His (SEQ ID NO :14)的氨基酸序列。
16.编码如前述权利要求中任一项所述的分离的蛋白复合物的分离的核酸。
17.—种基因构建体，其包含载体中与一个或多个调控核苷酸序列可操作地连接的如权利要求16所述的分离的核酸。
18.如权利要求17所述的基因构建体，其是表达构建体，其中所述分离的核酸与启动子可操作地连接。
19.一种宿主细胞，其包含如权利要求17所述的基因构建体。
20.一种药物组合物，其包含如权利要求1-15中任一项所述的分离的蛋白复合物和药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂。
21.浸透、包被或以其他方式包含如权利要求1-15中任一项所述的分离的蛋白复合物的外科植入物、支架或假体。
22.包含如权利要求1-15中任一项所述的分离的蛋白复合物的伤口或烧伤敷料
23.一种促进细胞迁移和/或增殖的方法，其包括使用如权利要求1-15中任一项所述的分离的蛋白复合物结合由细胞表达的角质化细胞生长因子受体和整联蛋白受体两者以由此诱导、增加或以其他方式促进所述细胞的迁移和/或增殖的步骤。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述分离的蛋白复合物被施用于动物以原位促进细胞迁移和/或增殖。
25.如权利要求23所述的方法，用于预防性或治疗性地诱导、增加或以其他方式促进上皮细胞迁移和/或增殖以由此原位促进伤口愈合。
26.如权利要求24或25所述的方法，其中所述动物是人类。
27.如权利要求23所述的方法，其中所述分离的蛋白复合物被体外施用于一个或多个细胞或组织。
全文摘要
提供了包含角质化细胞生长因子和玻连蛋白或至少其能够与角质化细胞生长因子受体和玻连蛋白的整联蛋白受体两者结合并活化的结构域的分离的蛋白复合物。这些蛋白复合物包括合成蛋白，其中角质化细胞生长因子和玻连蛋白序列通过连接体序列结合。在特定的形式中，玻连蛋白序列不包括C-末端的肝素结合结构域。还提供了这些蛋白复合物在伤口愈合、组织工程化、美容和治疗处理例如皮肤置换以及需要上皮细胞迁移和/或增殖时烧伤的皮肤补充和治疗中刺激或诱导细胞迁移和/或增殖的用途。在其他的实施方案中，本发明提供由本发明提供的涉及癌细胞转移(尤其是与乳腺癌有关的)的抑制。
文档编号C07K14/50GK103038351SQ201180038436
公开日2013年4月10日 申请日期2011年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者塞·厄普顿 申请人:昆士兰科技大学