专利名称：抗icam-1抗体在治疗患有复发性癌症的患者中的用途的利记博彩app
抗ICAM-1抗体在治疗患有复发性癌症的患者中的用途背景技术
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，也称为丽或骨髓瘤)是一种B细胞的恶性肿瘤，占所有血液恶性肿瘤的10%至20%。目前，它是一种诊断时中位年龄为65-70岁无法治愈的疾病，极少数患者在40岁之前被诊断出该疾病。多发性骨髓瘤在美国是第二大常见血液恶性肿瘤，世界范围内每100，000个体有4人发病。在美国，预计在2008年有19，920起多发性骨髓瘤新发病例和超过10，000起死亡病例与骨髓瘤有关(美国癌症学会，2008)。该病略微偏于男性，且在非裔美国人中多见，在亚裔群体中少见(Kyle & Rajkumar, Blood. 20 08Marl5; 111 (6) :2962-72.综述)。
骨髓瘤的诊断预后较差，当前治疗的中位生存时间为3至4年，但是即使采用最好的治疗，重症个体可能仅有2年的中位生存时间(Kyle &Rajkumar, Blood. 2008Marl5; 111 ( 6) :2962-72.综述)。
骨髓瘤的典型临床现象是患者具有因病理性骨折的严重疼痛，特别是在胸廓或脊柱中(Kyle & Rajkumar, 2004, N Engl J Med. 20040ct28; 351 (18) : 1860-73.综述)。其他常见特征是肾衰竭、高钙血症、具有贫血和血小板减少的骨髓缺乏，以及感染和诸如静脉血栓形成和肺栓塞的栓塞性并发症的风险增加。器官衰竭有时由免疫球蛋白轻链的纤维状聚集体病理性沉积(称为AL-淀粉样变性)引起。一旦出现，它通常涉及心脏和肾脏，分别导致严重的心律失常和/或心脏衰竭，和肾功能障碍与衰竭。
多发性骨髓瘤的特征为其具有很大程度上未得到满足的医学需要-当前可获得的治疗多发性骨髓瘤的药物是非治愈性的，伴有显著的毒性，以及发生抗药性。多发性骨髓瘤浆细胞一般不表达CD20，或显示出低的异源性CD20表达，使得靶向CD20的治疗在该病中不太可能有效(Kapoor et al. Haematol, 2008, 141:135-248)。
已经开发了一系列治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，包括下列药物的应用 美法仑(Melfalan)(和其他烷化物，诸如环磷酰胺)；其他化疗药(诸如阿霉素、长春新碱和顺钼)；高剂量类固醇；干扰素；二膦酸盐(诸如帕米膦酸盐或唑来磷酸盐)。此外，还曾用过自体和同种异体的干细胞移植。
尽管在开发治疗或预防多发性骨髓瘤的新型疗法上有了最新的进展， 但那些药物对于患者生存时间和生活质量的实际益处还相当有限(Kumar et al, Blood, 2008, 111(5) :2516_20)。而且，现有治疗与在相当数量患者中的严重副作用有关。例如，化疗导致感染敏感性增加、恶心、脱发和器官损伤；类固醇治疗可导致体重增加、 糖尿病、感染敏感性增加、骨质疏松症和精神障碍；干扰素治疗可导致疲劳、发烧、肌肉疼痛和抑郁；并且二膦酸盐治疗很少但有时导致肾损伤和骨坏死。利用干细胞移植的手术伴随有显著的复发率和移植相关的发病率和死亡率。包括沙利沙利多胺(thalidomide)、硼替佐米(bortezomib)和来那度胺(lenalidomide)的新型骨髓瘤药也具有副作用，限制了其在许多患者中的使用。
近些年，在理解多发性骨髓瘤的发病机理和分子机制上取得了显著进展。遗传学研究揭示，常带有预后相关性的大量不同染色体的改变与该病关联。简言之，这些染色体转位常涉及免疫球蛋白(Ig)H位点(14q32. 3)，并由Ig增强子促进将各种转化基因并置为片段，导致了表达失调和潜在的恶性转化(Hideshima et al. Nat Rev Cancer. 2007. 7 (8) : 585-598)0在骨髓瘤上用硼替佐米的蛋白酶体抑制的治疗作用首先是在体外的骨髓瘤细胞中得到证实，并且可能是直接的细胞毒性和粘附分子和各种生长因子、存活因子和血管生成因子的表达下降的结果(Kyle & RajkumarN Engl J Med. 20040ct28; 351 (18) : 1860-73.综述)。由于其正常的调节蛋白I κ B的蛋白酶体降解， 转录因子NFk B在骨髓瘤中具有增强的活性，并且硼替佐米通过抑制蛋白酶体活性恢复了 NFk B的动态平衡。
由骨破骨细胞、内皮细胞、骨髓干细胞以及胞外基质蛋白组成的骨髓微环境在多发性骨髓瘤发病机理中具有重要的作用(Hideshima et al. , Nat Rev Cancer. 2007.7(8) :585_598)，而且提供了介导恶性浆细胞的生长、存活和抗药性的因子。 由骨髓瘤细胞表达的各种粘附分子(例如ICAM-1)对于这种相互作用至关重要。
细胞间粘附因子-1 (ICAM-1)高度表达，且参与多种类型的人恶性肿瘤的发病，包括骨髓瘤(Huang, et a1. Hybridoma. 1993. 12(6) :661-675; Huang et al. Cancer Res. 1995. 55(3):610-616;Smallshaw et al.Tmmunotherl997. 2004. 27 (6):419-424;Schmidmaier, In t J Biol Markers. 2006. 21(4) :218-222)、黑素瘤(Wang et al.1nt J Cancer. 2006. 118(4): 932-941; Johnson et al.，Immunobiology. 1988. 178 (3) : 275-284)、肺癌(Grothey et al. Br J Cancer. 1998. 77 (5) :801-807)、胃癌(Maruo et al.1nt J Cancer. 2002. 100 (4) :486-490)、 膀胱;癌(Roche et al. Thromb Haemost. 2003. 89 (6) : 1089-1 097)、乳癌(Rosette C et a1.Carcinogenesis. 2005. 26(5):943-950)> 前列腺癌(Aalinkeel R et al. Cancer Res2004.64(15):5311-21)和淋巴瘤(Horst et al. Leukemia. 1991. 5(10) :848-853)。 ICAM-1表达增加与发生药物诱导的抗性(Schmidmaier et al.1nt J Biol Markers. 2006. 21(4): 218-222)、肿瘤细胞侵袭(Miele et al., Exp Cell Res214 (I)，2311994) 和较差预后(Dowlati et al. ,Clin Cancer Resl4(5)，1407(2008))有关。
年轻患者(即年龄小于65岁)的骨髓瘤的标准治疗由用长春新碱-阿霉素-地塞米松调理然后用自体干细胞支持的高剂量美法仑调理组成。在前十年间，尽管该方案在仅有的少数患者的骨髓中实现了症状的完全缓解，但显示出延长了中位生存时间约I年 (Harousseau JL. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2008; 2008:306-12)。由于高剂量治疗所带来的风险，已经主要为老年患者提供低剂量美法仑联合强的松的治疗。
近些年，已经批准了用于复发性骨髓瘤治疗的其他疗法。这些新药包括蛋白酶体抑制剂硼替佐米(万科(Velcade) *)和“免疫调节性”药，沙利多胺与来那度胺(雷利米得 (Revlimid) 11)，在治疗选择中构成了显著的进步。使用此类药物的复发性骨髓瘤患者总体响应率通常在30%左右，但一般高于该药联合间断的地塞米松的情况。基于这些发现， 与地塞米松和/或化疗联合用药的所述新药现在作为骨髓瘤的一线治疗正在临床试验中 (http://clinicaltrials, gov/ct2/search),初步结果具有前景(American Society of Hematology, December6-9, 2008)。
尽管与传统疗法相比，硼替佐米、来那度胺和沙利多胺在复发性骨髓瘤患者中已显不出生存时间益处(Rajkumar Blood. 2005. 106(13) :4050-4053;Richardson et al. Blo od.2006. 108(10) :3458-3464; Richardson et al. N Engl J Med. 2005. 352(24) :2487-2498;Singhal et al. N Engl J Med. 1999. 341 (21) : 1565-1571 )，增加长期生存时间或治愈的目标还没有达到。而且，所述的新药也有严重的副作用，例如血栓栓塞、神经病和免疫与骨髓抑制的风险的增加，限制了其在相当数量患者中的使用。
尽管在开发新型疗法上有最新的进展，但这些药物对于患者生存时间和生活质量的实际益处还较为有限，多数患者要么没有响应，要么产生了抗药性并随后复发，因而有依据开发新型的、更有效和更高评价的治疗剂以抵抗多发性骨髓瘤。相应地，需要针对骨髓瘤治疗的新的潜在靶点和药物，特别是用于对现有药物不响应或起初响应但随后复发的患者。
过去二十年来，靶向免疫疗法和基于抗体的药物的进展已显著改进了医生解决癌症和血液恶性肿瘤的手段(I)。在血液恶性肿瘤中，CD20特异性的小鼠人嵌合单克隆抗体利妥昔单抗(rituximab)提供了治疗性抗体的最佳示例，该抗体在用作单一疗法(2) (3)或联合传统化疗药物(4-6)时显著改善非霍奇金淋巴瘤患者的生存时间(7，8)。然而，由于肿瘤细胞⑶20表达缺乏或对⑶20具有天然或获得性抗性，患有血液病症的大部分患者仍不适合抗CD20治疗(9)。因而，亟需开发新一代具有针对这些当前无法治愈的癌症的活性的抗体，以改善临床效果。
本发明申请人描述了靶向Bll表位的新型人ICAM-1抗体，所述抗体比当前可获得的针对不同移植的表达CD20和CD20阴性的人B细胞肿瘤的体内治疗具有更广谱高功效和效力的抗肿瘤活性。基于其靶向肿瘤B细胞上调的表面受体和其竞争性的程序性细胞死亡所诱导的性质，所述ICAM-1B11抗体通过差别性生物淘选和程序性细胞死亡(PCD)筛选分离自天然抗体库n-GoDeR (Biolnvent)。据申请人所知，这是功能性筛选方法首次成功一方面用于鉴定先前良好表征的受体(ICAM-1)的新功能，且同时产生抗同一靶点具有如此显著治疗潜能的抗体。这种关于治疗性抗体探索的“功能第一方法 (function-first-approach)”因此构成了重要的与利用针对重组祀蛋白或转染祀细胞的淘选的传统方法(其中所检索的抗体库受限于抗先前定义好的靶受体的特异性)互补的策略。
申请人发现，与针对表达⑶20的肿瘤的利妥昔单抗相比，IgG Bll具有体内竞争性的抗肿瘤活性，而且在不同淋巴瘤类型中，ICAM-1的表达明显频繁，这表明它可应用于表达CD20的淋巴瘤的治疗。当单独或联合化疗使用时(8)，利妥昔单抗总体上显著改善非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者生存时间，然而患有复发性或顽固的⑶20+滤泡淋巴瘤的大部分患者对起初的利妥昔单抗治疗不响应(2)，而且超过一半的先前响应利妥昔单抗的患者获得抗性并不再从治疗中受益(63)。因此，还需IgG Bll针对表达⑶20的肿瘤的抗肿瘤活性的临床前研究，该研究将表明其对于治疗临床相关和不断增长的具有利妥昔单抗抗性或顽固的 NHL患者的适用性。
重要的是，本文显示了 IgG Bll具有广谱有效的体内抗骨髓瘤活性。尽管从早前 B细胞阶段至B细胞接触抗原后的B细胞发育期间CD20广泛表达，分泌抗体的浆细胞和源自此阶段的癌，包括多发性骨髓瘤，一般不表达或显示出低的异源性CD20表达。因此，多发性骨髓瘤不太可能用类似利妥昔单抗的靶向CD20的疗法有效治疗(23)。
相比之下，一些观察表明ICAM-1可为骨髓瘤治疗、特别是用类似IgGBll的抗体的靶向治疗的合适靶点；首先，最近的报道记载了原代多发性骨髓瘤浆细胞强表达ICAM-1，且在对化疗剂治疗响应的患者中，尤其是在对化疗产生抗性一当前多发性骨髓瘤必然发生的末期(64)的患者中(14，22)，ICAM-1进一步上调。
与这些观察一致的是，本文证明了，与患者的非骨髓瘤性淋巴细胞相比，绝大多数骨髓瘤细胞的Bll靶向表位的表达水平增加。
在恶性细胞上的高且同源性的靶点表达(当疾病进展时和当对当前可获得的治疗选择发生抗性时，所述靶点会上调)被认为是适于基于抗体的疗法的靶点的关键标志，特别是赋予针对癌细胞的直接细胞毒性的抗体。
与作为IgG Bll抗肿瘤活性重要机制的直接细胞毒性相一致，本发明证明了 IgG Bll抗肿瘤活性与表达ICAM-1受体的肿瘤细胞的IgG结合和饱和有关。而且，与作为直接肿瘤细胞毒性的主要作用模式相一致，除了其文献记载的诱导程序性细胞死亡的性质(10) 外，IgG Bll还在体内和体外都赋予了 Fc:Fc Y R依赖性的抗肿瘤活性。越来越多的证据表明，至少在不同的患者组中，抗体恒定结构域(Fe)与宿主Fe Y受体(Fe YR)间的相互作用有助于利妥昔单抗和其他癌症抗体的临床活性(52，53，65-67)。
因而，在独立的研究 中，与携带至少一个较低亲和力Fe Y Rllla等位基因的患者相比，对所述抗体恒定Fe结构域具有最高亲和力的Fe Y Rllla等位基因纯和的NHL患者在对用利妥昔单抗的治疗的响应上显示出了改善的生存时间，而且利妥昔单抗的体内抗肿瘤活性关键取决于抗体Fe:宿主Fe Y R相互作用(54)。
尽管当前还没有通过批准的用于治疗多发性骨髓瘤的抗体，涉及Fc:Fc YR的治疗性抗体已经转变了治疗血癌和实体癌的道路(I)。临床前数据证明了当前所用的被开发用于骨髓瘤治疗的免疫调节药(ImiDs)增强了 Fe:FcR依赖性抗肿瘤活性(Wu et al (2008) Clin Cancer Res, 14pp4650_7)。免疫调节药是沙利多胺的结构和功能类似物，所述沙利多胺代表了用于治疗炎性、自身免疫和肿瘤疾病的有前景的一类新型免疫调节剂。
这些观察表明可鉴定本发明提供的合适的骨髓瘤相关受体和靶向这些结构的参与Fe: Fe Y R的抗体，此类靶点特异性抗体可改进骨髓瘤治疗和疾病预后(I)。因此，基于可获得的文献和本文所示的数据，这表明了 ICAM-1:1gG Bll可为骨髓瘤治疗提供一种具有吸引力的主方向(axis)。
在另外的支持骨髓瘤治疗的靶向ICAM-1的干预中，ICA-1参与多发性骨髓瘤发病机理和在多个水平的抗药性的发生(12，14，22)。多发性骨髓瘤的特点是恶性浆细胞在骨髓中的浸润和扩散，且骨髓瘤胞依赖与基质细胞的相互作用增殖和生存。ICAM-1通过结合其配体整合素aLi32、整合素αΜβ2和muc-1参与细胞粘附事件，启动了多种细胞信号通路，促进了多发性骨髓瘤细胞增殖、迁移、对PCD的抗性和细胞粘附分子诱导的抗药性发生的增加(12，68，69)。规划的研究旨在利用scid-hu体内实验模型(70)和骨髓瘤细胞与造骨细胞或破骨细胞体外共培养物(71)研究IgGBll对ICAM-1依赖性的人骨髓瘤-人基质细胞相互作用的影响。
与利妥昔单抗和硼替佐米相比，从机制观点来看，IgG Bll的改进的抗肿瘤活性更吸引人。与利妥昔单抗表位相比，改进的抗肿瘤活性并不来自由肿瘤细胞表达的更多的 ICAM-1表位，表明与利妥昔单抗相比IgG Bll传递更强的死亡信号或者通过不同的信号转导或效应通路诱导细胞死亡。通过不同于利妥昔单抗和硼替佐米的通路启动细胞死亡的能力可在试图治疗已经获得对这些药的抗药性的肿瘤时特别重要。
治疗性癌症抗体除了发挥重要的抗肿瘤活性外，还必须安全且患者可耐受。在正常的生理环境下，ICAM-1显示出了表达和组织分布受限，但在响应组织损伤或炎性压力的几种细胞类型中上调，引发抗ICAM-1抗体治疗的安全性问题。然而，独立研究人员先前所做的研究证明了抗ICAM-1抗体能被不同的患者组良好耐受(75-79)。申请人的Bll的临床前安全性评价表明它是安全的，且被良好耐受，而且没有Bll增强或干扰重要的免疫细胞功能的证据。
从药理学角度上看，由于其全人源性质，与先前开发的小鼠或嵌合ICAM-1抗体相比(80)，预计Bll是低免疫原性或非免疫原性的，并且具有人IgG典型的半衰期(2-3周)。 因而，基于其显著的临床前抗骨髓瘤活性和预期的安全特性，多发性骨髓瘤中的IgG Bll临床试验现在已经在美国着手开始。
总之，本发明已鉴定了一种新型诱导细胞死亡的ICAM-1抗体(IgGBlI)，该抗体在多发性骨髓瘤临床前模型中具有比当前所用的包括硼替佐米(万科)、地塞米松、雷利米得和爱克兰(alkeran)在内的治疗更强的抗骨髓瘤活性。本发明还显示出用此类当前所用药剂体内治疗后收集的多数多发性骨髓瘤细胞维持或增加ICAM-1 (包括Bll表位)的表达， 表明此类ICAM-1抗体特别有益于对先前其他试剂的治疗不响应或复发的患者。
因此，在本发明的第一个方面中，本发明提供了
对ICAM-1具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段、或者对ICAM-1具有结合特异性的所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物或者所述变体或衍生物的融合物在制备治疗患者癌症的药物中的用途，其中所述患者先前已经进行过所述癌症的治疗，但对所述治疗无响应或者对所述治疗先是有响应而之后复发。
复发被定义为在早期实现的治疗性响应(即疾病状态的改善)后，具有症状性疾病的疾病进展。非响应性被定义为治疗期间的疾病进展或缺乏治疗性响应。
有多种标准，临床医生可据此判断患者是否复发或者对具体疗法非响应。这些因素包括(但不限于)；具有 骨骼疼痛的新骨折，因低血红蛋白或肾功能障碍增加导致的疲劳， 感染，血细胞计数，肿瘤大小或肿瘤再生长/回复，发生新癌(转移)。
使用标准临床和实验室技术和仪器对任意这些因素进行实验室检测。
在一种实施方式中，待治疗的癌症与所述患者先前治疗过的癌症相同。
在另一实施方式中，待治疗的所述癌症与所述患者先前治疗过的癌症不同。
在本发明的第二个方面中，本发明提供了
用于治疗患者癌症的对ICAM-1具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段、或者对ICAM-1具有结合特异性的所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物、或者所述变体或衍生物的融合物，其中所述患者先前已经进行过所述癌症的治疗，但对所述治疗无响应或者对所述治疗先是有响应而之后复发。
在一种实施方式中，待治疗的癌症与所述患者先前治疗过的癌症相同。
在另一实施方式中，待治疗的癌症与所述患者先前治疗过的癌症不同。
在本发明的第三个方面中，本发明提供了
一种治疗患者癌症的方法，所述患者先前已经进行过所述癌症的治疗，但对所述治疗无响应或者对所述治疗先是有响应而之后复发，所述方法包括将有效量的对ICAM-1 具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段、或者对ICAM-1具有结合特异性的所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物、或者所述变体或衍生物的融合物给药至所述患者的步骤。
在一种实施方式中，待治疗的所述癌症是所述患者先前治疗过的癌症相同。
在另一实施方式中，待治疗的所述癌症与所述患者先前治疗过的癌症不同。
癌症治疗通过抑制肿瘤细胞增殖、抑制血管生成(对支持肿瘤生长必需的新血管的生长)和/或通过降低肿瘤细胞运动性或侵袭力抑制转移来促进肿瘤消退。
本发明的抗体可在如下成人和儿童肿瘤中有效，包括实体肿瘤/恶性肿瘤；局部晚期肿瘤；人软组织肉瘤；转移癌，包括淋巴转移癌；血细胞恶性肿瘤，包括多发性骨髓瘤、 急性和慢性白血病、和淋巴瘤；头颈癌，包括口腔癌、喉癌和甲状腺癌；肺癌，包括小细胞癌和非小细胞癌；乳癌，包括小细胞癌和导管癌；胃肠癌，包括食管癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌和与结直肠瘤形成相关的息肉，胰腺癌、肝癌；泌尿道癌，包括膀胱癌和前列腺癌；女性生殖道恶性肿瘤，包括卵巢癌、子宫(包括子宫内膜)癌和卵巢囊泡中的实体瘤；肾癌，包括肾细胞癌；脑癌，包括内生性脑肿瘤、神经母细胞瘤、星形细胞脑肿瘤、神经胶质瘤、中枢神经系统中转移性肿瘤细胞侵袭；骨癌，包括骨瘤；皮肤癌，包括恶性黑素瘤，人皮肤角质形成细胞的肿瘤进展、鳞状细胞癌、基底细胞癌、血管外皮细胞瘤和卡波西肉瘤。
治疗性组合物能单独以治疗有效剂量给药或联合诸如手术、化疗、放疗、热疗和激光疗法的辅助癌症疗法给药，并且可提供有益效果，例如减少肿瘤大小、降低肿瘤生长速度、抑制转移或改善总体临床症状，而不必根除所述癌症。
另外，本发明的治疗性组合物可用于癌症的预防性治疗。本领域中已知使个体容易发生癌症的遗传条件和/或环境状况(例如接触致癌原)。在这些条件下，以有效治疗剂量的本发明抗体或抗原结合片段治疗这些个体可以有益于降低发生癌症的风险。
体外模型能用于确定本发明抗体或其抗原结合片段作为潜在癌症治疗的有效剂量。这些体外模型包括对培养的肿瘤细胞进行的增殖试验、在软琼脂中培养的肿瘤细胞的生长(见 Freshney, (1987)Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique, ffily-Liss, New York, NY,第 18 章和第 21 章)，Giovanella et al. , J. Natl. Can.1nst, 52:921-30 (1974)中描述的裸鼠中的肿瘤系统，Pilkington et al. , Anticancer Res. , 17:4107-9 (1997)中描述的Boyden Chamber试验中的肿瘤细胞的运动性和侵袭潜力，和诸如分别于 Ribatta et al. , Intl. J. Dev. Biol. , 40:1189-97 (1999)和 Li et al. ,Clin. Exp. Metastasis, 17:423-9(1999)中描述的鸡尿囊绒膜血管形成的诱导或血管内皮细胞迁移的诱导的血管生成试验。适当的肿瘤细胞系可获得自例如美国典型组织培养物保藏中心目录。
在一种实施方式中，待治疗的癌症是血液肿瘤。
血液肿瘤影响血液、骨髓和淋巴结。因为这三者在整个免疫系统中紧密相连，影响三者之一的疾病常常还影响其他两者，尽管技术上淋巴瘤是淋巴结的疾病，但它常扩散至骨髓，影响血液并偶尔产生副蛋白。
血液恶性肿瘤可源自两种主要的血细胞系(髓样和淋巴样细胞系)之一。正常情况下，髓样细胞系产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞；淋巴样细胞系产生B、 T、NK和浆细胞。淋巴瘤、淋巴细胞性白血病和骨髓瘤来自淋巴样细胞系，而急性和慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征和骨髓增生性疾病是源自髓样。
在一种实施方式中，待治疗的所述癌症是淋巴增生性疾病(Iymphoproliferative disorder, LPD)。
淋巴增生性疾病(LPD)是指一些超量产生淋巴细胞的病症。它们一般发生在患有免疫系统受损的患者。
LPD的实例包括
·滤泡性淋巴瘤
慢性淋巴细胞性白血病
急性淋巴母细胞性白血病
·毛细胞白血病
·淋巴瘤
·多发性骨髓瘤
·瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症
·维斯科特-奥尔德里奇综合征
·移植后淋巴增生性疾病
·自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)
·系统性红斑狼疮(SLE)
在一种实施方式中，待治疗的所述癌症是淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
淋巴瘤是起始于免疫系统的淋巴细胞，并表现为淋巴样细胞实体肿瘤的癌症。这些恶性细胞常源自淋巴结，表现为淋巴结肿大(肿瘤)。淋巴瘤与同样源自淋巴细胞但一般仅涉及循环血液和骨髓(其中血细胞在称为造血作用的过程中生成)的淋巴样白血病密切相关，并且通常不形成静态肿瘤。有多种类型的淋巴瘤，淋巴瘤是称作血液肿瘤的一大组疾病的一部分。
在一种实施方式中，待治疗的所述癌症是浆细胞疾病(也称为浆细胞恶液质)。
癌症可表现为该病(浆细胞恶液质)的形式。浆细胞恶液质是由于可分泌或不分泌可检测水平的单克隆免疫球蛋白或通常称作M蛋白的副蛋白的浆细胞的单克隆群恶性增生而产生的。普通的浆细胞恶液质包括未定性单克隆免疫球蛋白病(MGUS)、多发性骨髓瘤、 孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)、原发性淀粉样变性和重链病。
在另一实施方式中，待治疗的所述癌症是多发性骨髓瘤。
在一种实施方式中，所述治疗癌症的方法还包括另外的常规用于多发性骨髓瘤治疗的抗癌剂。
提及“治疗”，本发明包括受试者/患者的治疗性和预防性治疗两者。术语“预防性”用于涵盖本发明所述防止或者减轻患者或受试者中的癌症(诸如多发性骨髓瘤)发生或发展的可能性的多肽或组合物的使用。
本文使用的“治疗有效量”或“有效量”或“治疗上有效的”是指对给定的病症和给药方案提供治疗作用的量。其为经计算以与所需的添加剂和稀释剂(即载体或给药赋形剂)组合而产生期望的治疗作用的活性物质的预定量。此外，其还指足以降低或预防宿主的活动、功能和反应的临床显著性缺陷的量。或者，治疗有效量足以导致宿主中的临床显著病症的改进。在优选的实施方式中，本发明的第一个和第二个方面的用途和本发明的第三TI[〃oo]。坤/Sui00 -qz ψ iSV3iuOO ·6 ψ ‘坤/Sui00 ·8τ ψ iSV3iuOO 'LI ψ ‘砷/Sui00 ·9τ ψ ‘坤/抛00 'SI ψ ‘砷/Sui00 ·η ψ ‘坤/抛00 'SI ψ ‘坤/抛00 'Cl ψ ‘砷/Sui00 ·π ψ ‘砷/Sui00 ·0τ ψ ‘坤/抛00 ·6 ψ ‘砷/Sui00 ·8 ψ ‘坤/抛00 'L ψ ‘坤/抛00 ·9 ψ ‘砷/Sui00 -g ψ ^^/3^06 'f ψ ‘砷/Sui08-f ψ S^/SuioZ 'f ψ ‘砷/Sui09-f ψ‘砷/ ‘砷/ ‘砷/ ‘砷/ ‘砷/ ‘砷/ ‘砷/ ‘砷/ ‘砷/ ‘砷/^uiOS SUI06SuiOCSuiozSuiot^uiogSUI06伽0歹^uiOT-Sra^oiSifZSuio^‘砷/抛08 iSV3iuOZ ‘坤/抛09 ‘砷/抛00iSifZSuio^‘砷/抛08 'S^/Suigg‘坤/抛60 ‘砷/挪0‘砷/ ‘砷/ ‘砷/ ‘砷 / ‘砷/ ‘砷/ ‘砷/ ‘砷/ ‘砷/SuiocSiUOZSuiOTSuiogSUI06SuiOCSuiozSuiocSragOO ψ ‘坤/3呢0iSV3iuOZ ‘坤/抛09 ‘砷/抛00iSifZSuio^‘砷/抛08 iSV3iuOZ ‘坤/抛09‘坤/吨0笹‘砷/ 笹‘砷/ 笹‘砷/ 笹‘砷/ 笹‘叫/ 笹‘砷/ 笹‘砷/ 笹‘砷/ 笹‘砷/SuiOTSuiog SUI06Suioc^uioz^uiOT^uiog^uiocSrago‘砷/抛00iSifZSuio^‘砷/抛08 iSV3iuOZ ‘坤/抛09 ‘砷/抛00 iS^ZSmqf'S^/Suigo-Cp-Tp -Tp O笹 O笹 O笹￥胗畺降明_雨圾笹_导■、渺系明桓_κ导卷凿垛笹渺垛聚迪笹、桓封导卷凿垛、渺垛明臬帶丟藤琛‘Φ某牟驱笨栗也一罟苯 [W00]。坤/抛00 'OZ 丟 Suioo '61 Wi 砷/抛00 '61 丟 SuiOO '81 Wi 砷/抛00 '81 丟 Suioo 'LI Wi 砷/抛00 'LI 丟 Suioo '91 Wi 砷/抛00 '91 丟 Suioo 'SI Wi 砷/抛00 'SI 丟 Suioo .H Wi 3V3raOO .H 丟抛00 'SI ψ: Sif/Suioo 'SI 丟 Suioo 'Cl 笹砷 /Suioo 'Cl 丟 Suioo 'TI Wi 砷/抛00 ·π 丟抛00 Τ Wi 砷/抛00 Τ 丟抛00 .6 Wi 砷/抛00 .6 丟SuiOO .8笹:砷/抛00 .8丟抛00 'I笹砷/抛00 'I丟抛00 .9笹:砷/抛00 .9丟砷/抛00 .S Wi 3V3iuOO .S 丟抛06 'f Wi 砷/抛06 'f 丟抛08 'f Wi 砷/抛08 'f 丟抛OZ1 'f Wi Sif/Suioz 'f 至 SUI09 'f ψ : 3VSlu09 'f 丢 Suios 'f ψ : S^/Suiog 'f 至 SuiO^ 'f ψ :坤/抛。,'f 丢 3iuOg 'f ψ :SV3iuOS 'f 丟 Suioc 'f ψ :砷/抛02 'f 丟 Suiot 'f ψ : SV3raOT 'f 丟 Suioo 'f ψ :砷/抛00 'f 丟抛06 ·ε ψ:坤/洳06 ·ε 丟抛08 ·ε ψ:坤/洳08 ·ε 丟 ^oz1 ·ε ψ:坤/洳οζ ·ε 丟抛09 ·ε ψ :砷/抛09 ·ε 丟 Suios ·ε ψ :砷/^os ·ε 丟 3uW ·ε ψ:坤/抛0歹·ε 丟抛οε ·ε ψ :砷/抛οε ·ε 丟 suioc ·ε ψ:坤/洳οζ ·ε 丟 ^ot ·ε ψ:砷/抛οτ ·ε 丟 ^oo ·ε ψ:坤/洳οο ·ε 丟抛06 ·ζ ψ :砷/抛06 ·Ζ 丟抛08 ·Ζ ψ :砷/抛08 ·Ζ 丟 Suioz ·Ζ ψ :坤/抛OZ1 ·Ζ 丟抛09 ·Ζ ψ :砷/抛09 ·Ζ 丟 Suios ·Ζ W : SV3raOS ·Ζ 丟 Suio^ ·ζ W :坤/洳0歹·Ζ 丟 Suioc ·Ζ W :坤/洳οε ·Ζ 丟 Suioc ·ζ ψ :坤/洳OZ ·Ζ丟Sui0T ·Ζ笹砷/抛OT ·Ζ丟S/Sui00 ·Ζ笹坤/洳00 ·Ζ丟抛06 ·Τ笹坤/洳06 'I 丟她08 ·Τ ψ :坤/洳08 ·Τ 丟 Suioz ·Τ W : Sif/Suioz ·Τ 丟抛09 ·Τ ψ :坤/洳09 ·Τ 丟抛OS 'I ψ :SV3raOS ·Τ 丟 Suio^ 'I ψ : 3V3uW ·Τ 丟抛OS 'I ψ :坤/洳OS ·Τ 丟抛OZ 'I ψ : 3V洳OZ 'I 丟 SuiOT ·Τ W :砷/抛OT ·Τ 丟 Suioo ·Τ W :砷/抛00 ·Τ 丟抛06 O ψ :砷/抛06 O 丟抛08 O ψ :砷/抛08 O 丟 Suioz O ψ :坤/抛OZ1 O 丟抛09 O ψ :砷/抛09 O 丟抛OS O ψ : SV3raOS O 丟Suio^ ·0 ψ :坤/抛0歹O丟抛OS O ψ :砷/^OS O丟抛OZ O ψ :砷/抛OZ O丟抛0 O ψ :砷/抛01 _0丟砷0呢0 O: _7畺土怕苯胗畺_明_雨圾笹_导_、伞}系明桓封导卷凿[woo]°蕕4 明臬帶明產■西辟县暂丟藤琛_雨圾笹_导■、渺系明桓·Κ导卷凿垛笹V δοεεοοεοτ no组织的同时保持低毒性。利用诸如天然杀伤(NK)细胞介导的细胞死亡或直接诱导肿瘤细胞的凋亡而非坏死的生理机制，该耐受性可反映免疫球蛋白的动态作用。
如本领域技术人员所知，抗体或其抗原结合片段的精确剂量可根据其具体的活性而不同。适当的剂量可包含联合所需的稀释剂以产生所需治疗效果的计算所得的活性组合物的预定剂量。在关于本发明组合物的制备的方法和用途中，提供了有效治疗剂量的活性组分。如本领域公知，有效治疗剂量可由普通医学或兽医工作者基于患者的诸如年龄、体重、性别、症状、并发症、其他疾病等特征而确定。
在另一实施方式中，本发明的用途、抗体或方法包括位于浆细胞表面的ICAM-1。
在另一实施方式中，本发明的用途、抗体或方法包括能特异性地结合位于浆细胞表面的ICAM-1并诱导所述细胞程序性细胞死亡或凋亡的抗体或抗原结合片段或所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物。
在另一实施方式中，本发明的用途、抗体或方法包括有效量约为O.1yg至5g的·抗体、抗原结合片段、或所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物。
在特别优选的实施方式中，所述抗体、抗原结合片段、所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物的有效量约为0. 10 μ g，或O. 15 μ g，或O. 20 μ g，或0.25 μ g 或 O. 30 μ g,或 O. 35 μ g,或 O. 4 μ g,或 O. 45 μ g,或 O. 50 μ g,或 O. 60 μ g,或 O. 70 μ g 或 O. 80 μ g，或 O. 90 μ g，或1. 00 μ g,或1. 10 μ g,或1. 20 μ g,或1. 30 μ g,或1. 40 μ g 或1. 50 μ g，或1. 60 μ g，或1. 70 μ g,或1. 80 μ g,或1. 90 μ g,或 2· 00 μ g,或 2· 10 μ g 或 2· 20 μ g,或 2· 30 μ g,或 2· 40 μ g,或 2· 50 μ g,或 2· 60 μ g,或 2· 70 μ g,或 2· 80 μ g 或 2· 90 μ g，或 3· 00 μ g,或 3· 10 μ g,或 3· 20 μ g,或 3· 30 μ g,或 3· 40 μ g,或 3· 50 μ g 或 3· 60 μ g，或 3· 70 μ g，或 3· 80 μ g，或 3· 90 μ g，或 4· 00 μ g，或 4· 10 μ g，或 4· 20 μ g，或 4· 30 μ g，，或 4· 40 μ g，或 4· 50 μ g，或 4· 60 μ g，或 4· 70 μ g，或 4· 80 μ g，或 4· 90 μ g，或 5· 00 μ g，或 6· 00 μ g 或 7· 00 μ g，或 8· 00 μ g，或 9· 00 μ g，或 10. 00 μ g，或 11. 00 μ g，或 12. 00 μ g，或 13. 00 μ g，或 14. 00 μ g，或 15. 00 μ g，或 16. 00 μ g，或 17. OOg,或 18. 00 μ g，或 19. 00 μ g,或 20. 00 μ g,或 21. 00 μ g,或 22. 00 μ g,或 23. 00 μ g,或 24. 00 μ g,或 25. 00 μ g 或 26. 00 μ g，或 27. 00 μ g，或 28. 00 μ g，或 29. 00 μ g，或 30. 00 μ g，或 31. 00 μ g，或 32. 00 μ g，或 33. 00 μ g，或 34. 00 μ g，或 35. 00 μ g，或 36. 00 μ g，或 37. 00 μ g，或 38. 00 μ g 或 39. 00 μ g，或 40. 00 μ g，或 41. 00 μ g，或 42. 00 μ g，或 43. 00 μ g，或 44. 00 μ g，或 45. 00 μ g,或 46. 00 μ g,或 47. 00 μ g,或 48. 00 μ g,或 49. 00 μ g,或 50. 00 μ g,或 51. 00 μ g 或 52. 00 μ g,或 53. 00 μ g,或 54. 00 μ g,或 55. 00 μ g,或 56. 00 μ g,或 57. 00 μ g,或 58. 00 μ g,或 59. 00 μ g,或 60. 00 μ g,或 61. 00 μ g,或 62. OOpg,或 63. 00 μ g,或 64. 00 μ g 或 65. OOpg,或 66. 00 μ g,或 67. OOpg,或 68. 00 μ g,或 69. 00 μ g,或 70. 00 μ g,或 71. 00 μ g 或 72. 00 μ g，或 73. 00 μ g，或 74. 00 μ g，或 75. 00 μ g，或 76. 00 μ g，或 77. 00 μ g，或 78. 00 μ g，或 79. 00 μ g，或 80. 00 μ g，或 81. 00 μ g，或 82. 00 μ g，或 83. 00 μ g，或 84. 00 μ g 或 85. 00 μ g，或 86. 00 μ g，或 87. 00 μ g，或 88. 00 μ g，或 89. 00 μ g，或 90. 00 μ g，或 91. 00 μ g,或 92. 00 μ g,或 93. 00 μ g,或 94. 00 μ g,或 95. 00 μ g,或 96. 00 μ g,或 97. 00 μ g 或 98. 00 μ g,或 99. 00 μ g,或 100. 00 μ g(0.1Omg),或 0. 15mg,或 0. 20mg,或 0. 25mg,或0.30mg,或 0. 35mg,或 0. 40mg,或 0. 45mg,或 0. 50mg,或 0. 60mg,或 0. 70mg,或 0. 80mg 或 0. 90mg,或1. OOmg,或1.1Omg,或1. 20mg,或1. 30mg,或1. 40mg,或1. 50mg,或1. 60mg或1. 70mg，或1. 80mg，或1. 90mg，或 2. OOmg,或 2.1Omg,或 2. 20mg，或 2. 30mg，或 2. 或 2. 50mg，或 2. 60mg，或 2. 70mg，或 2. 80mg，或 2. 90mg，或 3. OOmg,或 3.1Omg,或 3. 或 3. 30mg，或 3. 40mg，或 3. 50mg，或 3. 60mg，或 3. 70mg，或 3. 80mg，或 3. 90mg，或 4. 或 4.1Omg,或 4. 20mg，或 4. 30mg，或 4. 40mg，或 4. 50mg，或 4. 60mg，或 4. 70mg，或 4.11.或或或或或或或或或或或或96或或或或12.19.26.33.40.47.54.61.68.75.82.89.OOmg, OOmg， OOmg， OOmg， OOmg， OOmg， OOmg， OOmg， OOmg， OOmg， OOmg， OOmg,或13.或或或或或或或或或或20.27.34.41.48.55.62.69.76.83.或 90. OOmg, OOmg,或 97. OOmg,或 O. 25g，或 O. 30g，或 O. O. 90g，或 l.OOg，或1. 1.80g，或 1.90g，或 2. 2. 70g，或 2. 80g，或 2.OOmg,OOmg,OOmg,OOmg,OOmg,OOmg,OOmg,OOmg,OOmg,OOmg,OOmg,OOmg，或 7. OOmg,或 8. OOmg,或 9. OOmg，或 10 OOmg，或或14.OOmg,或15.OOmg,或16.OOmg,或17.OOmg,或或21.OOmg,或22.OOmg,或23.OOmg,或24.OOmg,或或28.OOmg,或29.OOmg,或30.OOmg,或31.OOmg,或或35.OOmg,或36.OOmg,或37.OOmg,或38.OOmg,或或42.OOmg,或43.OOmg,或44.OOmg,或45.OOmg,或或49.OOmg,或50.OOmg,或51.OOmg,或52.OOmg,或或56.OOmg,或57.OOmg,或58.OOmg,或59.OOmg,或或63.OOmg,或64.OOmg,或65.OOmg,或66.OOmg,或或70.OOmg,或71.OOmg,或72.OOmg,或73.OOmg,或或77.OOmg,或78.OOmg,或79.OOmg,或80.OOmg,或或84.OOmg,或85.OOmg,或86.OOmg,或87.OOmg,或18.25.32.39.46.53.60.67.74.81.88.40mg，20mg，OOmg，80mg，OOmg,OOmg,OOmg,OOmg,OOmg,OOmg,OOmg,OOmg,OOmg,OOmg,OOmg,OOmg,或 91. OOmg,或 92. OOmg,或 93. OOmg,或 94. OOmg,或 95. OOmg,或 98. OOmg,或 99. OOmg,或 100. OOmg (O.1Og)，或 O. 15g，或 O. 20g， 35g，或 O. 40g，或 O. 45g，或 O. 50g，或 O. 60g，或 O. 70g，或 O. 80g， 10g，或1. 20g，或1. 30g，或1. 40g，或1. 50g，或1. 60g，或1. 70g， OOg，或 2. 10g，或 2. 20g，或 2. 30g，或 2. 40g，或 2. 50g，或 2. 60g， 90g，或 3. OOg,或 3. 10g，或 3. 20g，或 3. 30g，或 3. 40g，或 3. 50g， 或 3. 60g，或 3. 70g，或 3. 80g，或 3. 90g，或 4. OOg,或 4. 10g，或 4. 20g，或 4. 30g，或 4. 40g，或 4. 50g，或 4. 60g，或 4. 70g，或 4. 80g，或 4. 90g，或 5. OOg0
在特别优选的实施方式中，所述抗体、抗原结合片段、所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物的有效量约在以下量之间0.1Oug至O. 20ug;或O. 20 Ug至O. 或O. 至1. 或1. 至1. 或2. 至2. 或2. 至3. 或3.30600030700040701040；或 O. 30 μ g 至 O. 70 μ g ; ；或1. 00 Ug 至1. 40 μ g ; ；或1. 70 Ug 至 2. 10 μ g ; ;或 2. 40 μ g 至 2. 80 μ g ； ；或 3.1Oug至 O. 40 μ g ;或 O. 40 μ g 或 O. 70 μ g 至 O. 80 μ g ; 至1. 10 μ g ;或1. 10 μ g 或1. 40 μ g 至1. 50 μ g ； 至1. 80 μ g ；或1. 80 μ g 或 2. 10 μ g 至 2. 20 μ g ; 至 2. 50 μ g ;或 2. 50 μ g 或 2. 80 μ g 至 2. 90 μ g ; 至至 O. 50 μ g ;或 O. 50 μ g 至 O. 60 μ g ; 或 O. 80 μ g 至 O. 90 μ g ;或 O. 90 μ g 至1. 20 μ g ；或1. 20 μ g 至1. 30 μ g ； 或1. 50 μ g 至1. 60 μ g ;或1. 60 μ g 至1. 90 μ g ;或1. 90 μ g 至 2. 00 μ g ; 或 2. 20 μ g 至 2. 30 μ g ;或 2. 30 μ g 至 2. 60 μ g ;或 2. 60 μ g 至 2. 70 μ g ; 或 2. 90 μ g 至 3. 00 μ g ;或 3. 00 μ g 至 3. 30 μ g ;或 3. 30 μ g 至 3. 40 μ g ;3. 20 μ g ；或 3· 20 μ g 至 3. 50 μ g ;或 3. 50 μ g 至 3. 60 μ g ;或 3. 60 μ g 至 3. 70 μ g ;或 3. 70 μ g 至 3. 80 μ g ;或 3. 80 μ g 至 3. 90 μ g ;或 3. 90 μ g 至 4. 00 μ g ;或 4. 00 μ g 至 4. 10μ g ;或.10 μ g 至 4. 20 μ g ;或 4. 20 μ g 至 4. 30 μ g ;或 4. 30 μ g 至 4. 40 μ g ;或 4. 40 μ g 至 4. 50 μ g ; 或 4. 50 μ g 至 4. 60 μ g ;或 4. 60 μ g 至 4. 70 μ g ;或 4. 70 μ g 至 4. 80 μ g ;或 4. 80 μ g 至11. 00 μ 14. 00 μ 18. 00 μ 21. 00 μ 25. 00 μ 28. 00 μ 32. 00 μ 35. 00 μ 39. 00 μ 42. 00 μ 46. 00 μ 49. 00 μg 至 15. 00 μ g ;或 15. 00 μ g ' g ;或 18. 00 μ g 至 19. 00 μ g g 至 22. 00 μ g ;或 22. 00 μ g . g ;或 25. 00 μ g 至 26. 00 μ g g 至 29. 00 μ g ;或 29. 00 μ g g ;或 32. 00 μ g 至 33. 00 μ g00 μ g ;或 17. 00 μ g 至 ,00 μ g 至 21. 00 μ g ;或 00 μ g ;或 24. 00 μ g 至 ,00 μ g 至 28. 00 μ g ;或 00 μ g ;或 31. 00 μ g 至 00 μ g 至 35. 00 μ g ;或 00 μ g ;或 38. 00 μ g 至4. 90 μ g ；或 4. 90 μ g 至 5. 00 μ g ;或 5. 00 μ g 至 6. 00 μ g ;或 6. 00 μ g 至 7. 00 μ g ;或 7· 00 μ g 至 8· 00 μ g ;或 8· 00 μ g 至 9· 00 μ g ;或 9· 00 μ g 至 10. 00 μ g ;或 10. 00 μ g 至 g ;或 11. 00 μ g 至 12. 00 μ g ;或 12. 00 μ g 至 13. 00 μ g ;或 13. 00 μ g 至 14. 00 μ g ;或至 16. 00 μ g ;或 16. 00 μ g 至 17.;或19· 00 μ g 至 20. 00 μ g ;或20.至 23. 00 μ g ;或 23. 00 μ g 至 24.;或26. 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OOug;或34 g 至 36. 00 μ g ;或 36. 00 μ g 至 37. 00 μ g ;或 37. 00 μ g 至 38. g ;或 39. 00 μ g 至 40. 00 μ g ;或 40. 00 μ g 至 41. 00 μ g ;或 41. 00 μ g 至 42. 00 μ g ;或 g 至 43. 00 μ g ;或 43. 00 μ g 至 44. 00 μ g ;或 44. 00 μ g 至 45. 00 μ g ;或 45. 00 μ g 至 g ;或 46. 00 μ g 至 47. 00 μ g ;或 47. 00 μ g 至 48. 00 μ g ;或 48. 00 μ g 至 49. 00 μ g ;或 g 至 50. 00 μ g ;或 50. 00 μ g 至 51. 00 μ g ;或 51. 00 μ g 至 52. 00 μ g ;或 52. 00 μ g 至 53. 00 μ g ;或 53. 00 μ g 至 54. 00 μ g ;或 54. 00 μ g 至 55. 00 μ g ;或 55. 00 μ g 至 56. 00 μ g ;或 56. 00 μ g 至 57. 00 μ g ;或 57. 00 μ g 至 58. 00 μ g ;或 58. 00 μ g 至 59. 00 μ g ;或 59. 00 μ g 至 60. 00 μ g ;或 60. 00 μ g 至 61. 00 μ g ;或 61. 00 μ g 至 62. 00 μ g ;或 62. 00 μ g 至 63. 00 μ g ;或 63. 00 μ g 至 64. 00 μ g ;或 64. 00 μ g 至 65. 00 μ g ;或 65. 00 μ g 至 66. 00 μ g ;或 66. 00 μ g 至 67. 00 μ g ;或 67. 00 μ g 至 68. 00 μ g ;或 68. 00 μ g 至 69. 00 μ g ;或 69. 00 μ g 至 70. 00 μ g ;或 70. 00 μ g 至 71. 00 μ g ;或 71. 00 μ g 至 72. 00 μ g ;或 72. 00 μ g 至 73. 00 μ g ;或 73. 00 μ g 至 μ g ;或 74. 00 μ g 至 75. 00 μ g ;或 75. 00 μ g 至 76. 00 μ g ;或 76. 00 μ g 至 77. 00 μ g ;或 U g 至 78. 00 μ g ;或 78. 00 μ g 至 79. 00 μ g ;或 79. 00 μ g 至 80. 00 μ g ;或 80. 00 μ g 至 μ g ;或 81. 00 μ g 至 82. 00 μ g ;或 82. 00 μ g 至 83. 00 μ g ;或 83. 00 μ g 至 84. 00 μ g ;或 U g 至 85. 00 μ g ;或 85. 00 μ g 至 86. 00 μ g ;或 86. 00 μ g 至 87. 00 μ g ;或 87. 00 μ g 至 μ g ;或 88. 00 μ g 至 89. 00 μ g ;或 89. 00 μ g 至 90. 00 μ g ;或 90. 00 μ g 至 91. 00 μ g ;或 μ g 至 92. 00 μ g ;或 92. 00 μ g 至 93. 00 μ g ;或 93. 00 μ g 至 94. 00 μ g ;或 94. 00 μ g 至 μ g ;或 95. 00 μ g 至 96. 00 μ g ;或 96. 00 μ g 至 97. 00 μ g ;或 97. 00 μ g 至 98. 00 μ g 或 98. 00 μ g 至 99. 00 μ g ;或 99. 00 μ g 至 100. 00 μ g ;或 100. 00 μ g (O.1Omg)至 O. 20mg74. 00 77. 00 81. 00 84. 00 88. 00 91. 00 95. 00或 O. 20mg 至 O. 30mg 或 O. 60mg 至 O. 70mg 或1. 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在另一实施方式中，本发明的用途、抗体或方法的抗体或抗原结合片段、或所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物包括完整抗体或由完整抗体组成。
“抗体”包括基本完整的抗体分子，以及嵌合抗体、人源化抗体、人抗体(其中相对于天然存在的人抗体至少一个氨基酸发生突变)、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同源二聚体和异源二聚体，及其抗原结合片段和衍生物。
术语“抗体”还包括所有类别的抗体，包括IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。因而，所述抗体可以是IgG分子，诸如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4分子。优选地，本发明的抗体是IgG分子或抗原结合片段，或IgG分子或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物。
在本发明用途、抗体或方法的一种实施方式中，所述抗体包括完整抗体或由完整抗体组成。可选地，所述抗体或抗原结合片段，或所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物，可基本上由完整抗体组成。“基本上由……组成”是指所述抗体或抗原结合片段， 或所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物由足以显示对ICAM-1结合特异性的完整抗体的一部分组成。
在本发明用途、抗体或方法的一种实施方式中，所述抗体是非天然存在的抗体。当然，当所述抗体是天然存在的抗体时，以分离的形式(即不同于其天然存在的形式)提供。
抗体的重链可变区(Vh)和轻链可变区参与抗原识别，这是首先通过早期蛋白酶消化实验而认识到的事实。通过啮齿类抗体的“人源化”发现了进一步的证据。源于啮齿类的可变区可与源于人的恒定区融合，从而使所得的抗体保留啮齿源抗体的抗原特异性 (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sc1. USA81, 6851-6855)。
根据涉及均包含一种或多种可变区的抗体片段的细菌表达的实验，已知抗原特异性由可变区赋予，并且与恒定 区无关。这些分子包括Fab样分子(Better et al (1988) Science240, 1041) ;Fv 分子(Skerra et al (1988) Science 240, 1038);通过柔性寡妝连接 Vh 和 Vl 配偶区的单链 Fv (ScFv)分子(Bird et al (1988) Science242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sc1. USA85, 5879)和包含分离的 V 区的单域抗体(dAb) (Ward et al (1989)Nature341, 544)。涉及合成保留其特异结合位点的抗体片段的技术的综述可见于 Winter & Milstein(1991)Nature349, 293-299。
因而，“抗原结合片段”是指能结合ICAM-1的抗体功能性片段。
示例性的抗原结合片段可选至Fv片段(例如单链Fv和具有二硫键的Fv)和Fab 样片段(例如Fab片段、Fab’片段和F(ab)2片段)组成的组。
在本发明用途、抗体或方法的一种实施方式中，抗原结合片段是单链Fv (scFv)或具有二硫键的Fv。
方便地，抗原结合片段是Fab’片段或F(ab)2。
使用抗体片段而非完整抗体具有数倍的优势。所述片段较小的尺寸可产生改进的药理学性质，例如更好的实体组织穿透性。此外，抗原结合片段，例如Fab、Fv、ScFv和dAb 抗体片段能够在大肠杆菌(E.coli)中表达并分泌，由此可容易地生产大量的所述片段。
本发明的范围还包括抗体及其抗原结合片段的修饰形式，例如通过共价连接聚乙二醇或其他合适聚合物的修饰。
用于产生抗体和抗体片段的方法是本领域熟知的。例如，抗体的产生可通过采用诱导抗体分子的体内产生、筛选免疫球蛋白库的多种方法中的任一种(Orland1. et al, 1989. Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 86:3833-3 837 ;ffinter et al.，1991，Nature349:293-299)，或通过培养的细胞系产生单克隆抗体分子。这些包括但不限于杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术和EB病毒(EBV)-杂交瘤技术(Kohler et al. , 1975. Nature256:4950497;Kozbor et al. , 1985. J. Tmmunol. Methods81:31-42;Cote et al. , 1983. Proc. Natl. Acad. Sc1. USA80 : 2026-2030 ; Cole et al. , 1984. Mol. Cell. Biol.62:109-120)。
方便地，本发明提供抗体或抗原结合片段，或所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物，其中所述抗体是重组抗体(即其中所述抗体由重组方式产生)。
在本发明的用途、抗体或方法的优选实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。
可通过已知的技术制备针对所选抗原的适合的单克隆抗体，例如在“Monoclonal Antibodies : A manual of techniques，，，H Zola (CRC Press, 1988)和 “Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications，，, J G RHurrell (CRC Press, 1982) 中公开的那些，以上文献通过引用并入本文。
抗体片段还可通过使用本领域熟知的方法获得(参见，例如Harlow &Lane, 1988, “Antibodies:A Laboratory Manual，，，Cold Spring HarborLaboratory, New York，该文献通过引用并入本文)。例如，用于本发明方法和用途的抗体片段可通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞培养物或其他蛋白表达系统)中表达编码所述片段的DNA来制备。或者，可通过常规方法由完整抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶降解获得抗体片段。
优选地，本发明提供了用途、方法、组合物或系统，其中所述抗体或其抗原结合片段是人抗体或人源化抗体。
本领域技术人员可以理解，人源化抗体可用于人的治疗或诊断。人源化形式的非人(例如鼠)抗体是基因工程化的嵌合抗体或具有源自非人抗体的极小部分的抗体片段。 人源化抗体包括这样的抗体即，其中人抗体(受者抗体)的互补决定区被来自具有期望功能性的非人物种，例如小鼠、大鼠或兔(供体抗体)的互补决定区的残基取代的抗体。在一些情况下，人抗体的Fv框架残基被相应的非人残基取代。人源化抗体还可包含既没有见于受者抗体中，也没有见于引入的互补决定区(CDR)或框架序列中的残基。通常，人源化抗体可包含基本全部的至少一个且通常两个可变域，其中全部或基本全部的互补决定区对应于非人抗体的那些，且全部或基本全部的框架区对应于相关的人共有序列的那些。最佳地， 人源化抗体还包括至少一部分的抗体恒定区，例如Fe区，其通常源自人抗体(参见，例如 Jones et al. , 1986. Nature321:522-525 ；Riechmann et al.,1988, Nature332:323-329 ； Presta, 1992，Curr· Op. Struct. Biol. 2:593-596，该两篇文献通过引用并入本文)。
用于将非人抗体人源化的方法是本领域熟知的。通常，所述人源化抗体具有引入其中的来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些常被称作引入残基的非人氨基酸残基通常来自引入的可变域。人源化可基本按照文献描述(参见，例如Jones et al.,1986, Nature321:522-525 ；Reichmann et al. , 1988. Nature332:323-327 ；Verhoeyen et al. , 1988，Science239:1534-15361 ;US4，816，567，这些文献通过引用并入本文)，通过使用对应的啮齿类互补决定区取代人的互补决定区而进行。因此，此类人源化抗体为嵌合抗体，其中，基本小于完整的人可变域的序列已经被来自非人物种的对应序列取代。实际上，人源化抗体通常可以是其中一些互补决定区残基、且可能地一些框架残基被来自啮齿类抗体中类似位点的残基取代的人抗体。
也可以使用本领域中已知的多种技术鉴定人抗体，包括噬菌体展示文库(参见，例如 Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381 ；Marks et al. , 1991, J. Mol. Biol.222:581 ；Cole et al. , 1985, Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss,第 77 页；Boerner et al., 1991.J.1mmunol. 147:86-95 ；Soderlind et al.，2000，Nat Biotechnol 18:852-6 和 W098/32845，这些文献通过引用并入本文)。
一旦获得适合的抗体，可检测其活性，例如所述抗体的结合特异性或生物活性，例如，通过ELISA、免疫组织化学法、流式细胞术、免疫沉淀法、Western印迹等。所述生物活性可在读出该具体特征的不同试验中检测。
方便地，本发明的抗体或其抗原结合片段包括一个或多个以下的氨基酸序列(CDR 区)
FSNAWMSffVRQAPG 和 / 或
AFIffYDGSNKYYADSVKGR和 / 或
ARYSGWYFDY 和 / 或
CTGSSSNIGAGYDVH和 / 或
DNNNRPS 和 / 或
CQSYDSSLSAWL。
可选地，本发明的抗体或其抗原结合片段包括一个或多个
图15中显示的可变区。
本文使用的术语“氨基酸”包括20种遗传编码的氨基酸及其相应的’ D’型(与天然的’L’型相比)立体异构体，ω-氨基酸，其他非天然存在的氨基酸，非常规氨基酸(例如，α，α -双取代的氨基酸，N-烷基氨基酸等)和化学衍生化的氨基酸(见下文)。
除非另有明确指明，氨基酸在专门列出时，例如“丙氨酸”或“Ala”或“Α”，此术语是指L-丙氨酸和D-丙氨酸二者。其他非常规氨基酸也可以是本发明多肽的合适组分，只要所述多肽保留了所需的功能性质。对于本文显示的多肽，在适合的情况下，每个编码的氨基酸残基由对应于常规氨基酸的俗名的单个字母名称表示。
在一种实施方式中，本文定义的多肽包括L氨基酸或由L氨基酸组成。
本领域技术人员知道，本发明的方法和用途包含所定义的多肽的变体、融合物和衍生物，以及所述变体或衍生物的融合物，只要此类变体、融合物以及衍生物对ICAM-1具有结合特异性。
变体可以用本领域熟知的使用重组多核苷酸的蛋白工程化和定点诱变的方法制得(例如，参见 Molecular Cloning:a Laboratory Manual,第 3 版，Sambrook & Russell, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press,该文献通过引用并入本文)。
所述多肽的“融合物”包括与任何其他多肽融合的多肽。例如，所述多肽可以与诸如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或蛋白A的多肽融合，以有利于该多肽的纯化。此类融合物的实例是本领域技术人员公知的。类似地，所述多肽可以与诸如His6的寡聚组氨酸标签或诸如公知的Myc标签表位的由抗体识别的表位融合。所述多肽的任意变体或衍生物的融合物也包括在本发明范围内。应知道，优选保留所需性质的融合物(或其变体或衍生物)，所述性质例如对ICAM-1具有结合特异性。
所述融合物可包含赋予本发明所述多肽所需特征的其他部分，例如所述部分可用于检测或分离所述多肽，或促进所述多肽的细胞摄取。如本领域技术人员所公知，所述部分可以是，例如生物素部分、放射性部分、荧光部分，例如小荧光团或绿色荧光蛋白(GFP)荧光团。所述部分可以是免疫原性标签，例如，本领域技术人员已知的Myc标签，或者可以是本领域技术人员已知的能够促进所述多肽细胞摄取的亲脂性分子或多肽域。
所述多肽的“变体”包括保守或非保守性的插入、删除和取代。特别地，其包括所述多肽的变体，其中此类改变基本不改变所述多肽的活性。特别地，其包括所述多肽的变体， 其中此类改变基本不改变对ICAM-1的结合特异性。
多肽变体可具有与一个或多个以上给定的氨基酸序列具有至少75%同·一性的氨基酸序列，例如，与一个或多个以上特定的氨基酸序列具有至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性。
可使用适合的计算机程序确定两条多肽之间的序列同一性百分比，例如 University of Wisconsin Genetic Computing Group 的 GAP 程序，并且应理解，所述同一性百分比是相对于其序列经最佳比对的多肽而计算的。
或者，也可以使用Clustal W 程序(如 Thompson et al. , 1994, Nucl. Acid Res. 22:4673-4680中所述，该文献通过引用并入本文)进行比对。
所用的参数可如下
-快速成对比对参数K元组(字)大小，I;窗口大小，5 ;空位罚分，3 ;上对角线 (top diagonals)的数量，5 ;计分方法，x百分比。
-多比对参数空位开放罚分，10;空位延伸罚分，0.05。
-计分矩阵BL0SUM。
或者，可使用BESTFIT程序测定局部序列的比对。
本发明方法或用途中所用的多肽、变体、融合物或衍生物可包括一个或多个已经修饰过或衍生的氨基酸。
可通过与官能侧基的反应实现一个或多个氨基酸的化学衍生。此类衍生化的分子包括，例如其中的游离氨基经衍生形成胺的盐酸盐，P-甲苯磺酰基、羧基苯酰氧基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基或甲酰基。游离羧基可经衍生形成盐，甲基酯和乙基酯或其他类型的酯和肼类。游离羟基可经衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。化学衍生物还包括包含20种标准氨基酸的天然存在氨基酸衍生物的那些肽。例如可由4-羟基脯氨酸取代脯氨酸；由 5_羟基赖氨酸取代赖氨酸；由3-甲基组氨酸取代组氨酸；由高丝氨酸取代丝氨酸，以及由鸟氨酸取代赖氨酸。衍生物还包括包含一个或多个添加或删除的肽，只要必需的活性得到保留。所包括的其他修饰为酰胺化、氨基末端酰化(例如，乙酰化或巯基乙酸酰胺化)、末端羧基酰胺化(例如，使用氨或甲胺)，以及类似的末端修饰。
本领域技术人员还可以理解拟肽化合物也是有用的。因此，“多肽”包括能够结合 ICAM-1的拟肽化合物。术语“拟肽”是指模拟作为治疗剂的具体肽的构象和期望特征的化合物。
例如，本发明的多肽不仅包含其中的氨基酸残基通过肽键(-C0-NH-)连接的分子，还包括其中的肽键被反转(reversed)的分子。此类反转型(retro_inverso)拟肽可使用本领域已知的方法制备，例如Meziere et al. (1997) J.1mmunol. 159，3230-3237中描述的那些，该文献通过引用并入本文。此方法包括制备包含涉及骨架变化但侧链定位不变的拟肽。包含替代CO-NH肽键的NH-CO键的反转肽对蛋白水解的抗性高很多。或者，本发明的多肽可以是拟肽化合物，其中一个或多个氨基酸残基通过-1 (CH2NH)-键而不是常规酰胺键连接。
或者，可无需所述肽键，只要使用保留了氨基酸残基的碳原子之间的间隙的适合的连接子部分；连接子部分具有与肽键基本相同的电荷分布和基本相同极性是有利的。
应理解，可方便地封闭所述多肽的N末端或C末端，从而有助于降低对外切蛋白酶降解的易感性。
现已使用多种非编码的或修饰的氨基酸，例如D-氨基酸和N-甲基氨基酸，来修饰哺乳动物肽。此外，可通过共价修饰来稳定推测的生物活性构象，例如环化，或通过引入内酰胺或其他类型的桥键，例如参见 Veber et al.，1978，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA75:2636 和 Thursell et al. , 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111:166,该两篇文献通过引用并入本文。
很多合成策略中的常见主题是向基于肽的骨架中引入一些环状部分。所述环状部分限制肽结构的构象空间，这常常导致肽对特定生物受体的特异性提高。这种策略的额外优点是将环状部分引入到肽中还可产生对细胞肽酶的敏感性降低的肽。
因而，本发明方法和用途中的有用的示例性多肽可包含末端的半胱氨酸。此类多肽可通过末端半胱氨酸的巯基形成的二硫键以杂环形式(heterodetic cyclic form)存在，或通过末端氨基酸之间形成酰胺肽键以均环形式(homodetic form)存在。如上所述, 通过N末端和C末端半胱氨酸之间的二硫键或酰胺键使小肽环化可以通过减少蛋白水解且还提高结构刚性以产生特异性更高的化合物，而克服了有时见于线性肽中特异性和半衰期的问题。通过二硫键环化的多肽具有游离的氨基和羧基末端，其仍可能对蛋白降解敏感，而通过在N-末端氨基和C-末端羧基之间形成酰胺键环化的肽由此不再包含游离的氨基或羧基末端。因此，本发明所述的肽可通过C-N键或二硫键连接。
本发明不以任何方式受限于用于对肽进行环化的方法，而是包括其环状结构可通过任何适合的合成方法获得的肽。因此，杂键(heterodetic linkage)可包括但不限于通过二硫键桥、亚烷基桥或硫键桥形成的杂键。合成包含二硫键桥、硫键桥和亚烷基桥的均环肽和杂环肽的方法公开在US5，643，872，该文献通过引用并入本文。US6，008, 058中讨论并公开了环化方法的其他实例，该文献通过引用并入本文。
用于合成环状的稳定拟肽化合物的其他方法是闭环复分解反应(RCM)。此方法包括合成肽前体和使其与RCM催化剂接触以产生构象限制性肽的步骤。适合的肽前体可包含两个或更多的不饱和C-C键。此方法可使用固相肽合成技术进行。在此实施方式中，使锚定在固体支持物上的前体接触RCM催化剂，随后从所述固体支持物切出产物以获得构象限制性肽。
由 D. H. Rich 在 Protease Inhibitors, Barrett and Selveson 编辑，Elsevier (1986)(通过引用并入本文)中公开的另一种方法通过将过渡态类似物的概念应用于酶抑制剂设计而设计出了肽模拟物。例如，已知staline的仲醇模拟了胃蛋白酶底物的易切割酰胺键的四面体过渡态。
总之，已知末端修饰有助于降低对蛋白酶降解的易感性，并由此延长肽在溶液中的半衰期，特别是在其中具有蛋白酶的生物流体中的半衰期。因为通过环化形成的稳定结构，以及对于见于环状肽的生物活性的考虑，多肽环化也是有用的修饰。
因而，在一种实施方式中，本发明用途、方法、组合物和系统中所用的多肽是环状的。然而，在一种可选实施方式中，多肽是线性的。
在本发明用途、抗体或方法的优选实施方式中，抗体或抗原结合片段，或所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物能特异性地结合位于细胞表面的ICAM-1，并抑制和/或阻止该细胞的增生。
在一种可选实施方式中，抗体或抗原结合片段，或所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物能特异性地结合位于细胞表面的ICAM-1，并诱导该细胞的凋亡。
在一种可选实施方式中，抗体或抗原结合片段，或所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物能特异性地结合位于细胞表面的ICAM-1，并诱导抗该细胞的抗体依赖性细胞毒性。
可使用可注射的缓释给药系统递送本发明的抗体、抗原结合片段，和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体，以及药物，可以用可注射的持续释放的药物递送系统递送。这些经过专门设 计以降低注射的频率。此类系统的实例是Nutropin Depot, 其将重组人生长激素(rhGH)包封在可生物降解的微球中，其一经注射，即在较长的时期中缓慢地释放rhGH。优选地，通过肌肉内(1.m.)和/或皮下(s. c.)和/或静脉内(1. V.)进行递送。
可通过将药物直接释放到所需位点的手术植入装置施用本发明的抗体、抗原结合片段，和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体，和药物。例如，Vitrasert 将更昔洛韦直接释放到眼中以治疗巨细胞病毒(CMV)视网膜炎。将此毒性剂直接应用到患病位点实现了有效的治疗，而没有药物的显著的全身副作用。
也可应用电穿孔治疗(EPT)系统来施用本发明的抗体、抗原结合片段，和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体，药物和药物组合物。向细胞施加脉冲电场的装置提高了所述细胞膜对药物的可透性，导致细胞内药物递送显著增强。
还可通过电引入(electro-1ncorporation, EI)递送本发明的抗体、抗原结合片段，和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体，以及药物。EI发生在皮肤表面上直径达30微米的小颗粒受到与用于电穿孔相同或类似的电脉冲的情况下。在EI中， 这些颗粒被驱动穿过角质层，并进入皮肤的较深层。所述颗粒可负载或包被药物或基因，或能够仅充当在皮肤中产生使药物能够由此进入的孔的“子弹”。
用于递送本发明的抗体、抗原结合片段，和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体，以及药物的可选方法是热敏的ReGei 注射系统。低于体温时，ReGel是可注射的液体，而在体温下，其立即形成缓慢消蚀并溶解成已知安全的可生物降解聚合物的凝胶库。活性物质随着生物聚合物的溶解而随时间递送。
本发明的抗体、抗原结合片段、和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体以及药物也能口服递送。此方法利用了口服摄取维生素B12和/或维生素D以在体内共递送蛋白和肽的天然过程。借助维生素B12和/或维生素D摄取系统，本发明的抗体、 抗原结合片段、和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体以及药物能够移动通过肠壁。在维生素B12类似物和/或维生素D类似物与药物之间合成复合物，所述药物既保留了复合物的维生素B12部分和/或维生素D部分中对内因素(IF)的显著亲和力，还保留了所述复合物的活性物质的显著生物活性。
本发明的抗体、抗原结合片段、和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体以及药物可通过“特洛伊肽(Trojan peptide) ”引入到细胞。这是被称作“穿透素 (penetratin) ”的一类多肽，其具有转位性质，并且能够携带亲水化合物跨过质膜。此系统可以引导寡肽靶向细胞质和细胞核，并且具有非细胞类型特异性和高效性。参见DeiOssi et al. (1998), Trends Cell Biol8, 84-87。
优选地，本发明的药物是含有日剂量或单位、日亚剂量或其适合的小部分的活性组分的单位剂型。
本发明的抗体、抗原结合片段、和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体以及药物通常通过口服或任何胃肠外途径施用，其可以是药学可接受的剂型的包含活性组分的药物组合物的形式，其中任选地，所述活性组分是无毒的有机酸或无机酸，或有机碱或无机碱，加成盐的形式。根据待治疗的病变和患者，以及给药途径，所述组合物可以以不同剂量施用。
在对人的治疗中，本发明的抗体、抗原结合片段、和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体以及药物可以单独施用，但通常与根据给药途径和标准制药实践而选择的合适药物赋形剂、稀释剂或载体混合施用。
例如，本发明的抗体、抗原结合片段、和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、 衍生物或变体以及药物可以以片剂、胶囊剂、栓剂(ovule)、酏剂、溶液或悬浮液的形式经口服、颊部或舌下施用，其可包含调味剂或着色剂，以用于速释、缓释或控释应用。本发明的抗体、抗原结合片段、和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体以及药物还可以通过海绵体内注射施用。
此类片剂可包含赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素纳和某些复合硅酸盐；以及粒化粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素 (HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。此外，还可包含润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油山嵛酸酯和滑石。
近似类型的固体组合物也可以用作明胶胶囊中的填充物。在此方面，优选的赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milk sugar)或高分子量聚乙二醇。对于水悬浮液和/或酏剂，本发明的抗体、抗原结合片段、和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、 衍生物或变体、药物和药物组合物可以组合多种甜味剂或调味剂、着色剂或染料，以及乳化剂和/或悬浮剂，以及稀释剂，例如水、乙醇、丙二醇和甘油，及其组合。
本发明的抗体、抗原结合片段、和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体以及药物还可以经胃肠外施用，例如经静脉内、动脉内、腹腔内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌肉内或皮下施用，或者通过输注技术施用。其最好以无菌水溶液的形式使用，所述无菌水溶液包含其他物质，例如，足以使所述溶液与血液等渗的盐或葡萄糖。如果必要， 所述水溶液应经过适当的缓冲(优选缓冲至PH3-9)。可通过本领域技术人员熟知的标准制药技术容易地在无菌条件下制备适合的胃肠外制剂。
适合胃肠外施用的药物和药物组合物包括含水和无水的无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使所述制剂与目标受者血液等渗的溶质；还包括含水和无水的无菌悬浮液，其可包含悬浮剂和增稠剂。所述药物和药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量的容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可在冷冻干燥(冻干)的条件下贮存，仅需要在临用前添加无菌液体载体，例如注射用水。即用型注射溶液和悬浮液可以由此前描述的各种无菌粉末、颗粒和片剂制备。
本发明的抗体、抗原结合片段、和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体以及药物还可以经鼻内或通过吸入施用，并以使用适合的推进剂由加压容器、泵、喷器或喷雾器喷送提供的干粉吸入剂或气雾剂形式方便地递送，所述适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷，氢氟烷，例如1，I, 1,2-四氟乙烷(HFA134A3)或 1，I, I, 2，3，3，3-七氟丙烷(HFA227EA3)，二氧化碳或其他适合的气体。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门以递送经计量的量来确定剂量单位。所述加压容器、泵、喷器或喷雾器可包含所述活性剂的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和所述推进剂的混合物作为溶剂，其还可包含润滑剂，例如脱水山梨醇三油酸酯。用于吸入器或吹入器中的胶囊和药筒(例如由明胶制成)可经配制而包含本发明的抗体、抗原结合片段、和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体和适合的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
优选地，气雾剂或干粉制剂的配置使得每个计量的剂量或每“喷”包含有效量的本发明制剂或多核苷酸以递送给患者。应理解，使用气雾剂的总日剂量对各个患者各不相同， 并且可在全天中以单个剂量，或更常见地，以分开的剂量施用。
可选地，本发明的抗体、抗原结合片段、和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体以及药物可以以栓剂或阴道栓剂的形式施用，或以洗剂、溶液、乳剂、凝胶、软膏或粉剂的形式局部施用。本发明的抗体、抗原结合片段、和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体以及药物还可以透皮施用，例如，通过使用皮肤贴剂施用。 其还可以通过经眼途径施用，特别是用于治疗眼睛的疾病。
对于眼科应用，本发明的抗体、抗原结合片段、和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体以及药物可配制成于等渗的、PH经调节的无菌盐水中的微粉化悬浮液，或优选地，配制成于等渗的、pH经调节的无菌盐水中的溶液，并任选地，与诸如苯扎氯铵的防腐剂组合。或者，可将其配制在诸如矿脂的软膏中。
对于皮肤的局部使用，可将本发明的抗体、抗原结合片段、和/或所述抗体、抗原结合片段的融合物、衍生物或变体以及药物配制成包含所述活性剂的适合软膏，所述活性剂悬浮或溶于，例如包含以下一种或多种物质的混合物中矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯剂，乳化蜡和水。或者，可将其配制成适合的洗剂或乳剂，悬浮或溶于，例如以下一种或多种物质的混合物中矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
适合在口中局部施用的制剂包括包含在调味基(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)中的活性组分的糖锭(lozenge);包含在惰性基(例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)中的活性组分的锭剂(pastille),以及包含在适合的液体载体中的活性组分的漱口液。
通常，对于人，口服或胃肠外施用本发明的抗体、抗原结合片段、和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体、药物和药物组合物是优选的途径，其最为便利。
对于兽医使用，本发明的抗体、抗原结合片段、和/或所述抗体或抗原结合片段的融合物、衍生物或变体以及药物作为作为适合的可接受剂型，根据通常的兽医实践来施用， 兽医可确定对具体动物最适合的给药方案和施用途径。
本文定义的抗体或抗原结合片段、或所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物可如附属实施例中所述来制剂。
如上文所述，当根据本发明方法和用途给药时，本文定义的抗体和/或抗原结合片段、和/或变体、融合物或衍生物能诱导癌和/或肿瘤细胞(诸如CD20-阳性和CD20-阴性多发性骨髓瘤癌细胞和肿瘤)的凋亡，和/或指导针对所述癌和/或肿瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。另外，抗体和/或抗原结合片段、和/或变体、融合物或衍生物能结合可溶性细胞间粘附分子(sICAM-1)，从而抑制血管生成、细胞粘附介导的抗药性和肿瘤细胞逃逸免疫监视。
附属的实施例证明了，本文定义的示例性抗体(称为抗体“B11”，也称作B1-505) 当根据本发明方法和用法给药时，具有显著性的体内和体外抗肿瘤(抗癌症)活性。除了其显著性的直接抗骨髓瘤活性外，Bll还可起抑制血管生成驱动的肿瘤生长的作用，并抵抗肿瘤逃逸免疫监视。
除非另有明确说明，本文使用的单数形式(“a”、“and”和“the”)包括复数的受试者。因此，例如“抗体”包括多个此类抗体，且所述“剂量”包括一个或多个剂量，以及本领域技术人员已知的等同物，等等。实施例
下列实施例体现了本发明的各种方面。应知道，实施例中所用的特异性抗体用于说明本发明的原理，而非旨在限制 其范围。
参考附图描述下列实施例
图1显示了如何通过联合差异性生物淘选和程序性细胞死亡筛选来分离针对表达CD20的肿瘤具有显著体内抗肿瘤活性的新型ICAM-1抗体。(I)肿瘤相关受体特异性抗体的差异性生物淘选。(II)程序性细胞死亡(P⑶)筛选。(III)靶鉴定。(IV)体内抗肿瘤活性。
图1 (I)显示了如何通过使用竞争性连续差异生物淘选方法得到对B淋巴瘤靶细胞具有选择性的抗体，其中全细胞形式的靶细胞抗原与膜囊泡形式的过量减数 (subtractor )细胞抗原一起经受天然的n-Ck)DeR 抗体曬菌体文库。
图1 (II)显示了如何将高通量程序性细胞死亡筛选用于分离多种B细胞淋巴瘤 PCD诱导的抗体。B细胞淋巴瘤细胞在有滴定浓度的候选抗体的条件下培养且过夜高度交联，并且在膜联蛋白V-AF488和碘化丙啶联合染色后用流式细胞仪监视凋亡。图1(IIXi) 说明了膜起泡和细胞膜分别对功能上分离的B1-505抗体诱导的早期凋亡和晚期凋亡细胞的典型大分子的渗透性。图1 (II) (ii)的图表示检测为膜联蛋白V-488阳性的死亡细胞百分数。
图1 (III)显示了如何在细胞裂解和全人源IgG免疫共沉淀接着用蛋白A琼脂糖凝胶交联的Raji或Ramos B淋巴瘤细胞上进行祀鉴定。切去抗体特异性条带并经受胰蛋白酶消化，并通过MALD1-T0F分析。被B1-505沉淀的单一条带被鉴定为ICAM-1。所建立的ICAM-1的身份通过超出可溶性重组ICAM-1或VCAM的高达50倍摩尔数的阻断研究确认。通过流式细胞仪确定B1-505对PC-3细胞的MFI。虚线代表阴性对照抗体，灰色实心直立图代表没有预先阻断的B1-505的MFI。B1-505被重组VCAM或ICAM-1预先阻断。图1(III)(iii)显示了如何用重组人ICAM-1、ICAM-2或ICAM-3包被ELISA平板，并且如何用化学发光方案检测B1-505与ICAM-1的结合。抗-1CAM-2和抗a -1CAM-3抗体分别用作检测ICAM-2和ICAM-3的阳性对照。图1 (IV)显示了为了进一步研究诱导PCD的ICAM-1抗体的治疗潜能，如何在移植两种良好表征的表达CD20的肿瘤B细胞系ARH-77或Daudi的免疫缺陷scid小鼠肿瘤模型中评价ΒΙ-505的体内抗肿瘤活性。
图2 ΒΙ-505显示了在SCID/ARH-77骨髓瘤和Daudi异种移植模型中的显著体内抗骨髓瘤功效和效力。
将肿瘤细胞皮下注射至SCID小鼠的左胁腹。从肿瘤细胞接种后第I天开始，小鼠每周两次接受剂量为20mg/kg、2mg/kg和/或O. 2mg/kg的B1-505、对照抗体或利妥昔单抗的腹腔内注射。每治疗组有8至10只动物。(A)作为抗体剂量的函数的肿瘤体积。(B)作为抗体剂量的函数的Kaplan-Meier生存曲线图。(C)由流式细胞仪分析的表位表达。分别利用 Graphpad Instat 或 Prism 软件用 Kruskal-Wallis 检验(非参数 AN0VA)与 Dunn 多重比较检验(肿瘤体积)或对数秩检验(小鼠生存曲线图)计算相对于对照抗体治疗的统计学显著性。统计学显著性确定为*ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01,和***ρ〈0· 001。
图3 ΒΙ-505显示了在SCID/AR H-77骨髓瘤异种移植模型中的显著性体内抗骨髓瘤功效和效力。
将肿瘤细胞皮下注射至SCID小鼠的左胁腹。从肿瘤细胞接种后第I天开始，小鼠每周两次接受剂量为O. 02-20mg/kg的B1-505腹腔内注射。每治疗组有8至10只动物。 (A)作为抗体剂量的函数的肿瘤体积。(B)作为抗体剂量的函数的Kaplan-Meier生存曲线图。分别利用Graphpad Instat或Prism软件用Kruskal-Wallis检验(非参数AN0VA)与 Dunn多重比较检验(肿瘤体积)或对数秩检验(小鼠生存曲线图)计算相对于对照抗体治疗的统计学显著性。统计学显著性确定为*Ρ〈0· 05，**ρ〈0· 01，和*#ρ〈0· 001。图中表示的是进行几次实验中的代表性实验。(C)以肿瘤细胞系上的ΒΙ-505的表位饱和度作为ΒΙ-505 浓度的函数作图。(D)在有交联的二级Fab’2山羊抗人Fe抗体的条件下,将Daudi B淋巴瘤细胞与B1-505或对照抗体一起孵育16小时，并且在用膜联蛋白V/碘化丙啶对细胞染色后，确定细胞死亡的诱导。以B1-505诱导的细胞死亡作为浓度的函数作图。该实验一式三份进行，且各实验重复至少5次。该图表示来自各实验(n=5X3)的标准化的合并数据。(E) 体内异种移植实验期间，在不同时间点收集血液样品并通过ELISA分析确定B1-505的波谷水平。以该体内抗肿瘤活性作为波谷B1-505血清浓度的函数作图，并用五参数对数-对数曲线和XLfit软件拟合。(F)体外抗肿瘤活性与B1-505表位饱和度之间的相关性。(G)体内抗肿瘤活性与B1-505表位饱和度之间的相关性。
图4显示了多发性骨髓瘤患者具有显著性的B1-505表位表达。(A)多发性骨髓瘤患者特征和B1-505表位表达。(B)骨髓瘤细胞上与正常B细胞上的B1-505表位。
图5显示了 B1-505具有广谱和ICAM-1依赖性的体内抗骨髓瘤活性。
第O天，将NC1-H929、EJM、RPM1-8226或0PM-2骨髓瘤细胞皮下注射至SCID小鼠的左胁腹。第I天，开始2mg/kg B1-505或对照IgGl的抗体治疗，且该治疗根据每周两次腹腔内给药方案继续进行。当肿瘤大小达到伦理限时处死小鼠。IgG Bll对异种移植有 ICAM-1阴性细胞系0PM-2的动物中的肿瘤生长没有影响，表明抗骨髓瘤活性是ICAM-1依赖性的。(A)显示了来自两个进行的实验中的一个代表性实验的数据(实心圆显示B1-505 治疗，空心圆显示对照IgG1治疗)。(B)显示了来自两个独立实验的合并的且标准化的数据 Cn=每治疗组8至10只动物。实心条显示B1-505治疗，空心条显示对照IgGl治疗)。用 Mann Whitney非参数分析和Graph Pad Instat程序计算相对于对照抗体治疗的统计学显著性。统计学显著性确定为*ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01,和***ρ〈0· 001。
图6 ΒΙ-505赋予了对晚期的实验性多发性骨髓瘤的保护。
将ARH-77细胞或RPM1-8226静脉注射至SCID小鼠中。(A)ARH_77模型。动物在第7、10、13和16天接受2mg/kg抗体或O. 5mg/kg硼替佐米(万科)静脉注射(如图中箭头所指)。(B)RPM1-8226模型。以2mg/kg静脉施用B1-505或对照单抗，每周两次，共8周；以 lmg/kg静脉施用硼替佐米，每周一次，共8周；以2mg/kg 口服来那度胺，共2个疗程，每一疗程包含5天治疗和2天洗出；以3mg/kg静脉施用美法仑,每周一次,共8周；和以6mg/kg/ 次注射地塞米松(DXH)，3次/周，连续2周。每治疗组有6-10只小鼠。用对数秩Graphpad Prism软件计算统计学显著性，并确定在***ρ〈0· 001。(C)为研究人细胞上的ICA-1水平， 对来自不同器官的细胞染色，并对其进行⑶38+/mCD45-/B1-50·5+门控处理。左小图表示 CD38+/mCD45群中的B1-505阳性细胞百分数，而右小图表示阳性细胞的平均荧光强度。
图7显示了 B1-505Fc Y R结合能力与体外和体内抗肿瘤活性相关。
(A)将ARH-77细胞皮下注射至SCID小鼠的左胁腹(η=每组8只)。用不同的ΒΙ-505 同种型治疗小鼠，每周两次。(B)用Biacore确定ΒΙ-505同种型与不同重组Fe Y R的结合。 B1-505IgGl而非IgG4或N297Q突变体显示了与小鼠Fe Y RIV (—种参与小鼠中Fe介导的活性的主要Fe受体)的强结合。(C)用不同比例的天然杀伤细胞为效应细胞和B淋巴瘤细胞系(CL-Ol)为靶细胞检查ADCC。如预期，仅B1-505介导肿瘤细胞的Fe y RIIIA依赖性 ADCC。(D)因为带有不同亲和力的B1-505同种型结合人Fe YRIIIA (主要的人ADCC介导受体)，观察到ADCC活性和抗肿瘤功效之间的相关性。(E)对来自治疗小鼠的ARH-77异种移植组织染色，并定量F4/80阳性区域，所述阳性区域显示出了在B1-505治疗的小鼠中对肿瘤组织的巨噬细胞浸润显著高于在利妥昔单抗和对照IgG治疗的小鼠中的浸润。误差线 =40 μ mo图中显示了所测量的组织中F4/80阳性区域的百分数。用Kruskal-Wallis检验 (非参数AN0VA)与Dunn多重比较检验计算相对于对照抗体治疗的统计学显著性。统计学显著性确定为 *ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01,和 ***ρ〈0· 001 ο
图8显示了与利妥昔单抗相比，B1-505/IgG Bll在(A) ARH-77和(B) Daudi异种移植模型中的高功效和效力。
图9显示了经由免疫组化分析，ΒΙ-505、利妥昔单抗或者对照治疗的肿瘤都表达类似显著量的⑶20和ICAM-1抗体靶向的表位。
图10显示了(A)丽骨髓细胞的免疫表型染色组。(B)显示了用于选择⑶38、⑶138 和⑶56高表达和⑶45缺失的流式细胞术分析，确认了单克隆表达。之后检测患者#7( + )、 #8 (++)和#10 (+++) Bll表位表达。(C)显不了患者(I)、复发后(2)和复发治疗后(3)的骨髓瘤细胞中的Bll表位表达。
图11显示了所产生的ΒΙ-505同种型交换变体的靶蛋白结合亲和力EC5tl值几乎一
图12显示出B细胞凋亡、T细胞增殖、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(⑶C)和细胞因子释放(特别是TNF- α和IL-8)都未被Bll治疗显著影响。
图13显示出与对照治疗小鼠(ρ〈0. 001)相比和与四种不同的SOC治疗(ρ〈0. 05， 与雷利米得或万科相比；Ρ〈0. 001，与地塞米松或爱克兰相比)相比，B1-505显著增强了播散性MM异种移植模型中的生存时间。N=6-10/组。
图14显示了标准治疗药物对异种移植有播散性MM细胞的小鼠的治疗既未影响表达ICAM-1的MM细胞数量(A)，也未影响ICAM-1表达水平(B)。
图15显示了 Bll抗体可变区重链(Bll-VH)和可变区轻链(Bll-VL)核苷酸和氨基酸序列。
实施例1:本发明所用的材料和方法
试剂、细胞和动物
若干批次的IgG1 Bll要么稳定地表达自CHO细胞，要么在HEK293细胞中瞬时表达。IgG4 Bll和297Q Bll在HEK293细胞中瞬时表达。对照抗体IgG1CTH或IgG1FITC-SGA 在HEK293细胞中瞬时表达。通过LAL-变形细胞检验测定，抗体的内毒素水平为〈O.1IU/ mLo利妥昔单抗(Roche)、硼替佐米(Janssen-Cilag)、来那度胺(celgene)、美法仑 (GlaxoSmithKline)和地塞米松(Mylan)购自当地药店(瑞典隆德和法国第戎)。ARH-77、 RPM1-8226和Daudi细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，瑞典)，NC1-H929、EJM和 0PM-2细胞系购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ，德国)。所有细胞维持在供应商推荐的培养基中。在富集细胞用于异种移植前，确保细胞的对数期生长。CT. 17背景的雌性scid小鼠获自丹麦泰康利，以7-8周龄用于随后的研究。根据动物实验伦理指导原则进行动物实验，并且所有使用动物的操作程序均由当地的隆德/马尔摩伦理委员会审查和批准。
多发性骨髓瘤患者细胞的ICAM-1的表达分析
知情同意后，在当地的伦理委员会批准下，用识别浆细胞的四种抗体组(见实施例 2)通过流式细胞术分析来自隆德的Skanes大学医院血液科的被研究多发性骨髓瘤或关联疾病(浆细胞瘤、浆细胞白血病、淀粉样轻链淀粉样变性)的十八例患者的骨髓抽取物。临床数据获自病例表(图4A)。
程序性细胞死亡(P⑶)试验
在96孔培养板上，以2X IO6个细胞/mL培养基的密度接种靶细胞。在没有或有用于交联的抗人Fab片段(Jackson ImmunoResearch)的条件下，将滴定浓度的IgG1 Bll或不同阴性和阳性对照抗体添加至细胞中。然后于37°C C，5%C02的增湿氛围中孵育细胞16小时。收集细胞并用膜联蛋白V-488/碘化丙唳(Invitrogen, Sweden)染色,并用流式细胞仪 (FACS Calibur, BD生命科学)分析。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
来自人供体的血沉棕黄层(Buffy coat)(通过隆德Blodcentralen订购)用于分离外周血单核细胞(PBMC)和随后的NK细胞。简言之，用Ficoll Paque PLUS (Amersham Biosciences, Sweden)在 LeucoSep 管(Greiner Bio-One)中分离外周血组分。移取 PBMC 部分，并在用阳性或阴性NK细胞分离试剂盒与MACS LS柱(Miltenyi Biotec)进行磁珠标记和NK细胞群分离前，在冰预冷的DPBS (Invitrogen)中充分洗涤。获得的NK细胞级分的纯度在用α-⑶56抗体(BD Biosciences)染色后用流式细胞术分析。收集靶细胞，并在含或不含各抗体(2μ g/mL)的培养基中在冰上孵育60分钟。其后洗涤细胞并重悬在冰预冷的培养基中，之后分入FACS管中。然后，在ADCC培养基中稀释分离的NK细胞，并以不同效应细胞/靶细胞比例(40:1、20:1、5:1和1:1)，将其与各抗体包被的靶细胞分配在一起。所有实验均以一式三份进行。在孵育完全后，加入ToPo-Pro-3染料和计数珠(Invitrogen), 并用流式细胞术分析细胞的膜渗透性。
完全依赖性细胞毒性(⑶C)
收集靶细胞并在含5 μ g/mL或在O. 01-100 μ g/mL的滴定浓度的抗体的RPMI培养基中在冰上孵育60分钟。其后洗涤细胞并重悬在预冷的培养基中，之后分入流式细胞管中。以一式三份进行处理。将正常或热灭活的人血清(Sigma，Sweden)加入管中，并在37°C 孵育样品2小时。在孵育完全后，以O. 3 μ M的终浓度加入ΤοΡο-Ρι -3，并用流式细胞术分析细胞的膜渗透性。
结合Fe YR的ΒΙ-505同种型变体
在贴壁的ΗΕΚ293Ε细胞中瞬时表达带有His标签的人Fe Y RIIIa或小鼠Fe Y RIV， 用N1-NTA色谱法纯化，并用SDS-PAGE和/或Biacore表征。用Biacore3000仪器进行表面等离子体子共振(SPR)测量。用标准氨基偶联操作规程将山羊α人？(&13)’2 (&13)’2片段 (Jackson laboratories)固定在CM-5 芯片上。将 IgG1 BlUIgG4 Bll 或297Q Bll 分别稀释至15和6(^8/11^，并以10 μ L/分钟加至表面，共3分钟。将带有His标签的人Fe YRIIIa 或小鼠FcyRIV与α-His抗体(R&D Systems)以2:1的摩尔比一起预孵育，之后加至芯片表面,30 μ L/分钟,共I分钟。每一轮处理后，用pHl. 7的甘氨酸缓冲液再生表面两次。
肿瘤生长
皮下移植
在骨髓瘤细胞接种前，用七氟烷和氧气的混合物麻醉小鼠，然后以100μ L体积将 1-5 X IO6骨髓瘤细胞皮下注射入左胁腹。在细胞接种后一天(预防性模型)或在肿瘤达到近 IOOmm3的大小时(疾病建立模型)，开始通过腹腔内(1. P.)注射进行抗体治疗。在总体积为 200 μ L的PBS中进行抗体给药。PBS或同种型对照治疗用作对照。用数字卡尺测量肿瘤， 并根据公式宽度2X长度Χ0. 52计算肿瘤体积。当肿瘤大小达到1. 5cm的伦理限时处死动物。在最多5个月后，处死存活的小鼠。从腔静脉中收集的血液样品在2500g离心15分钟，以获得血清，在-20°C下保存样品。移取肿瘤用于免疫组化，快速冷冻并在_85°C下保存。
播散性多发性骨髓瘤模型
在播散性多发性骨髓瘤模型中检查B1-505的抗骨髓瘤效果。在法国第戎的Oncodesign进行早期和晚期播散性多发性骨髓瘤模型的建立。简言之将在 200 μ LRPMI1640中的IXlO6 (早期)或5Χ106 (晚期)ARH-77肿瘤细胞静脉(1. V)注射入雌性scid小鼠的尾静脉(D0)。在小鼠的全身辐射后(1. 8Gy, 60Co, INRA, BRETENNIERES) 24 至48小时，进行肿瘤细胞注射。于D5 (RPM1-8226模型)或D7 (ARG-77模型)开始治疗，美法仑除外(它于DlO给药)。以2mg/kg静脉施用Bll或对照单抗,每周两次,共8周，以Img/ kg静脉施用硼替佐米，每周一次，共8周，以2mg/kg 口服来那度胺，共2个疗程，每个疗程包括5天治疗和2天洗出，以3mg/kg静脉注射美法仑,每周一次,共8周,和以6mg/kg注射地塞米松，连续2周。
统计学分析
如图例所述，用Kruskal-Wal I is检验(非参数AN0VA)与Dunn多重比较检验或Mann Whitney非参数分析计算相对于对照抗体治疗的统计学分析。用对数秩和检验和Graphpad Prism软件计算抗体介导的小鼠生存时间的统计学分析。统计学显著性确定为* = p〈0. 05, ** = ρ〈0· 01, *** = ρ〈0· 001。
实施例2 :通过联合的差异生物淘选和程序性细胞死亡筛选分离的新型ICAM-1抗体在体内对表达CD20的肿瘤具有竞争性抗肿瘤活性
如图1所示,应用连续差异生物淘选和高通量程序性细胞死亡筛选(参见实施例 O从体外的⑶R重排的天然人抗体文库n-CoDeR (Biolvent)中分离靶向不同肿瘤细胞相关表面受体的诱导多发性B细胞淋巴瘤程序性细胞死亡(PCD)的抗体。在所分离的抗体中， 鉴定了对ICAM-1 (—种先前不与抗体诱导的肿瘤PCD相关的受体)具有特异性的那些抗体。 在表达CD20的肿瘤细胞系和CD20阴性肿瘤细胞系中，抗ICAM-1抗体均诱导了 PCD，表明其广谱的治疗应用性。IgG Bll对ICAM-1的高特异性及其在表达ICAM-1的Daudi淋巴瘤细胞中的剂量依赖性PCD诱导示于图1中。
为了进一步研究诱导PCD的ICAM-1抗体的治疗潜能，在移植两种良好表征的表达⑶20的B细胞恶性肿瘤细胞系ARH-77或Daudi的免疫缺陷scid小鼠的肿瘤模型中评价了 IgG Bll的体内抗肿瘤活性(图1组IV)。这些细胞系分别广泛用于研究多发性骨髓瘤(24-48)和非霍奇金淋巴瘤(49，50)不同模型中的药物功效和效力。两种细胞系均表达 CD20抗原，使得与临床有效的CD20特异性抗体利妥昔单抗的抗肿瘤功效和效力 的比较成为可能。
ARH-77细胞的皮下注射导致了肿瘤细胞在scid小鼠中的快速建立和生长，在肿瘤细胞注射后12与14天之间，肿瘤易于触及。开始于肿瘤细胞接种后第I天的20mg/kg 剂量的IgG Bll的每周两次注射显现出完全阻止异种移植小鼠中的肿瘤生长(图2A左小图)。CD20特异性阳性对照单抗利妥昔单抗也赋予了显著的抗肿瘤活性，尽管比IgG Bll疗效差。而且，即使以低至利妥昔单抗十分之一的剂量(2mg/kg)给药时，IgG Bll也赋予了全部的存活(图2A和2B，左小图)。因此，在此侵袭性⑶20阳性B细胞恶性肿瘤模型中，IgG Bll在赋予抗肿瘤活性和存活上比利妥昔单抗更有效，效力更高。
接下来研究IgG Bll对Daudi非霍奇金淋巴瘤异种移植物的体内抗肿瘤活性。同样，在此模型中，IgG Bll显著地且与利妥昔单抗同等有效地阻止肿瘤生长并延长了荷瘤小鼠的生存时间(图2A和2B，右小图)。IgGBll的增强的抗肿瘤活性并不是由表达比利妥昔单抗表位更多数量的Bll的肿瘤细胞所致。相反,流式细胞术分析揭示了 ARH-77和Daudi 细胞两者均表达比利妥昔单抗表位低得多的ICAM-1 (图2C左小图和右小图)。这些结果证明了 IgG Bll对两种不同的良好表征的表达CD20的肿瘤细胞系具有显著的体内抗肿瘤活性。
接着用scid/ARH-77模型系统进行了剂量滴定实验以建立IgG Bll体内效力和实现最大的抗肿瘤活性的最低剂量。IgG Bll显示了可滴定的抗肿瘤活性，该抗肿瘤活性遵循 S曲线且峰值在2mg/kg剂量，并在O. 2mg/kg剂量处仍接近最大值(图3A)。在实验末期，通过ELISA测定小鼠血清抗体波谷浓度。然后针对体内抗肿瘤活性最大值的百分数，并针对 ICAM-1受体占有率和体外在相应抗体浓度处的肿瘤细胞PCD的最大值的百分数对波谷抗体浓度作图(图3C，3D，3E，3F和3G)。惊奇的是，观察到了抗体浓度与体外肿瘤细胞受体占有率、体外肿瘤细胞PCD和体内抗肿瘤活性之间的接近完美的相关性，这与隐含在体内抗肿瘤活性中的ICAM-1依赖性的直接细胞毒性一致。
在类似但更晚期的scid/ARH-77异种移植模型中证实了 IgG Bll的高功较和效力 (图8A)。荷载可触及的ARH-77肿瘤的Scid小鼠以不同剂量的IgG B11、利妥昔单抗或对照抗体治疗。在此模型中，利妥昔单抗未能降低肿瘤生长或提高动物生存时间(P>0. 05)。 相比之下，与利妥昔单抗治疗相比，即使以更低的百分之一的剂量(O. 2mg/kg)给药时，IgG Bll也显著地阻止肿瘤生长并延长了动物生存时间(图8A)。在晚期肿瘤模型中，利妥昔单抗抗肿瘤效果的缺乏不是肿瘤逃逸或抗原表达下调造成的。在实验完成时，从抗体和对照治疗小鼠中收集的肿瘤组织的免疫组化分析揭示了整个实验中肿瘤表达类似、显著数量的 CD20和ICAM-1抗体靶向表位(图9)。
实施例3 :1CAM-1和Bll在包括多发性骨髓瘤在内的淋巴增生性疾病广泛表达
ICAM-1 Bll IgG的高功效和效力的体外和体内抗肿瘤活性激发了申请人全面评估ICAM-1在不同淋巴增生性疾病中的表达。首先，通过组织微阵列免疫组化分析测定了在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、滤泡细胞淋巴瘤(FCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)和播散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中的ICAM-1表达(表I)。
表1.淋巴瘤中的ICAM-1表达
淋巴瘤MTA中的ICAM-1表达
权利要求
1.对ICAM-1具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段、或对ICAM-1具有结合特异性的所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物或所述变体或衍生物的融合物在制备治疗患者癌症的药物中的用途，其中所述患者先前已经进行过所述癌症的治疗，但对所述治疗无响应或者对所述治疗先是有响应而之后复发。
2.用于治疗患者癌症的对ICAM-1具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段、或对ICAM-1具有结合特异性的所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物或所述变体或衍生物的融合物，其中所述患者先前已经进行过所述癌症的治疗，但对所述治疗无响应或者对所述治疗先是有响应而之后复发。
3.治疗患者癌症的方法，其中所述患者先前已经进行过所述癌症的治疗，但对所述治疗无响应或者对所述治疗先是有响应而之后复发，所述方法包括将有效量的对ICAM-1具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段、或对ICAM-1具有结合特异性的所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物或所述变体或衍生物的融合物给药至所述患者的步骤。
4.如权利要求1所述的用途，其中，待治疗的所述癌症与所述患者先前治疗过的癌症相同。
5.如权利要求1所述的用途，其中，待治疗的所述癌症与所述患者先前治疗过的癌症不同。
6.如权利要求2所述的抗体，其中，待治疗的所述癌症与所述患者先前治疗过的癌症相同。
7.如权利要求2所述的抗体，其中，待治疗的所述癌症与所述患者先前治疗过的癌症不同。
8.如权利要求3所述的方法，其中，待治疗的所述癌症与所述患者先前治疗过的癌症相同。
9.如权利要求3所述的方法，其中，待治疗的所述癌症与所述患者先前治疗过的癌症不同。
10.如前述任一权利要求所述的用途、抗体或方法，其中，待治疗的所述癌症是淋巴增生性疾病。
11.如前述任一权利要求所述的用途、抗体或方法，其中，待治疗的所述癌症是多发性骨髓瘤。
12.如前述任一权利要求所述的用途、抗体或方法，其中，ICAM-1位于浆细胞表面。
13.如前述任一权利要求所述的用途、抗体或方法，其中，所述有效量的所述抗体、抗原结合片段、变体、融合物或衍生物为约O.1 μ g至5g的所述抗体、抗原结合片段、变体、融合或衍生物。
14.如前述任一权利要求所述的用途、抗体或方法，其中，所述抗体或抗原结合片段、或所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物包含完整抗体或由完整抗体组成。
15.如前述任一权利要求所述的用途、抗体或方法，其中，所述抗体或抗原结合片段、或所述抗体或抗原结合片段的变体、融合物或衍生物包含选自Fv片段、Fab片段、Fab样片段中的抗原结合片段或由选自Fv片段、Fab片段、Fab样片段中的抗原结合片段组成。
16.如权利要求15所述的用途、抗体或方法，其中，所述Fv片段是单链Fv片段或具有二硫键的Fv片段。
17.如权利要求15所述的用途、抗体或方法，其中，所述Fab样片段是Fab’片段或F(ab)2 片段。
18.如前述任一权利要求所述的用途、抗体或方法，其中，所述抗体是重组抗体。
19.如前述任一权利要求所述的用途、抗体或方法，其中，所述抗体是单克隆抗体。
20.如前述任一权利要求所述的用途、抗体或方法，其中，所述抗体或其抗原结合片段是人抗体或人源化抗体。
21.如前述任一权利要求所述的用途、抗体或方法，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含下列氨基酸序列FSNAWMSffVRQAPG 和 / 或AFIffYDGSNKYYADSVKGR 和 / 或ARYSGffYFDY 和 / 或CTGSSSNIGAGYDVH 和 / 或DNNNRPS 和 / 或CQSYDSSLSAWL。
22.如前述任一权利要求所述的用途、抗体或方法，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含一个或多个图15中所示的氨基酸序列。
23.用于治疗多发性骨髓瘤前疾病状态(pre-multiplemyeloma disorder state)的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段基本上如说明书所述。
24.抗体或其抗原结合片段的用途，所述用途基本上如说明书所述。
25.治疗个体浆细胞疾病的方法，所述方法基本上如说明书所述。
全文摘要
本发明提供了对ICAM-1具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段用于治疗患者的癌症，其中所述患者先前已经进行过所述癌症的治疗，但对所述治疗无响应或者对所述治疗先是有响应而之后复发。
文档编号C07K16/28GK103003308SQ201180034613
公开日2013年3月27日 申请日期2011年7月13日 优先权日2010年7月13日
发明者玛尔库斯·翰松, 比约恩·弗伦多斯 申请人:生物发明国际公司