促进抗原清除的与FcRn的亲和力得到改进的抗体的利记博彩app

专利名称：促进抗原清除的与FcRn的亲和力得到改进的抗体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及 用于促进抗原结合分子介导的细胞对抗原摄入的方法；用于增加单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目的方法；用于通过给予抗原结合分子促进血浆抗原浓度降低的方法；用于改进抗原结合分子的药代动力学的方法；用于降低血浆的总抗原浓度或游离抗原浓度的方法；提高细胞对抗原摄入的抗原结合分子；结合抗原的数目增加的抗原结合分子；通过给予所述分子能够促进血浆抗原浓度降低的抗原结合分子；具有改进的药代动力学的抗原结合分子；包含所述抗原结合分子的药物组合物；用于产生上述这些的方法等。优先权本发明要求2010年3月30日提交的日本专利申请号2010-079667和2010年11月9日提交的日本专利申请号2010-250830的权益，所述申请的整个内容通过引用结合到本文中。
背景技术：
抗体作为药物正引起注意，因为它们在血浆中十分稳定，少有副作用。目前，市场上可获得许多IgG型抗体药物，且许多抗体药物目前正在开发之中(NPL I和2)。同时，已报告了适用于第二代抗体药物的各种技术，包括提高效应子功能、抗原结合能力、药代动力学和稳定性的技术，以及降低免疫原性风险的技术(NPL 3)。总的说来，抗体药物的必需剂量很高。这又产生了问题，例如高生产成本以及生产皮下制剂的困难。理论上，可通过改进抗体药代动力学或改进抗体与抗原之间的亲和力来减少抗体药物的剂量。文献报告了在恒定区采用氨基酸的人工取代来改进抗体药代动力学的方法(NPL4和5)。同样地，报告了亲和力成熟作为提高抗原结合能力或抗原中和活性的技术(NPL
6)。该技术能够通过将氨基酸突变引入可变区的CDR区或这样的区来提高抗原结合活性。抗原结合能力的提高能够使体外生物活性提高或使剂量降低，还能够使体内功效提高(NPL7)。单个抗体分子的抗原中和能力取决于其亲和力。通过提高亲和力，抗原可被较少量的抗体中和。可采用多种方法提高抗体亲和力(NPL 6)。此外，如果可通过使抗体与抗原共价结合以使亲和力无限，则单个抗体分子可中和一个抗原分子(二价抗体可中和两个抗原分子)。然而，一个抗体针对一个抗原(一个二价抗体针对两个抗原)的化学计算量中和是现有方法的极限值，因此不可能用比抗原的量少的抗体的量来完全中和抗原。换句话说，亲和力提高作用具有极限值(NPL9)。为了延长中和抗体的中和作用持续一定时间，必须以比同期机体所产生的抗原的量高的剂量给予抗体。仅凭上述抗体药代动力学或亲和力成熟技术的改进，在降低所需抗体剂量方面仍存在如此限制。因此，为了用比抗原量少的抗体量来保持抗体的抗原中和作用持续目标时间，单个抗体必须中和多个抗原。已报告了以PH依赖性方式与抗原结合的抗体作为实现上述目的的新方法(PTL I)。在血浆中的中性条件下与抗原牢固结合且在内体中的酸性条件下与抗原解离的PH依赖性抗原结合抗体，可在内体中与抗原解离。当与抗原解离的PH依赖性抗原结合抗体通过FcRn再循环至血浆时，它可再次与另一抗原结合。因此，单个PH依赖性抗原结合抗体可与许多抗原重复结合。此外，与通过FcRn结合再循环的抗体相比，抗原的血浆滞留非常短。当具有这种长期血浆滞留的抗体与抗原结合时，抗原-抗体复合体的血浆滞留时间与抗体的血浆滞留时间一样延长。因此，抗原的血浆滞留通过与抗体结合而延长，因此血浆抗原浓度增加。IgG抗体由于FcRn结合而具有较长的血浆滞留时间。只在酸性条件(pH 6. O)下 观察到IgG与FcRn之间的结合。相比之下，在中性条件(pH 7. 4)下，几乎未检出结合。IgG抗体以非特异性方式被摄入细胞中。抗体通过在内体酸性条件下与内体FcRn结合而返回细胞表面，然后在血浆中性条件下与FcRn解离。如果通过将突变引入IgG Fe结构域以使在酸性条件下丧失FcRn结合，则从内体再循环至血浆的抗体不存在，这明显减少血浆中的抗体滞留时间。一种已报告的用于改进IgG抗体血浆滞留的方法是提高酸性条件下的FcRn结合。将氨基酸突变引入IgG抗体的Fe结构域以改进酸性条件下的FcRn结合。这提高了从内体再循环至血浆的效率，导致血浆滞留改进。氨基酸取代的重要需求是不增加在中性条件下的FcRn结合。如果IgG抗体在中性条件下与FcRn结合，则通过在内体酸性条件下与FcRn结合而返回细胞表面的抗体，在血浆中性条件下不与FcRn解离。在这种情况下，在一定程度上丧失血浆滞留，因为IgG抗体不再循环至血浆中。例如如J Immunol.(2002) 169(9) :5171-80所述，据报告，通过引入氨基酸取代使得所得抗体能够在中性条件(pH 7. 4)下与小鼠FcRn结合的修饰IgGl抗体，当给予小鼠时，具有非常差的血浆滞留。此外，如 J Immunol. (2009) 182(12) :7663-71 ;J Biol Chem. 2007 年 I 月 19 日；282(3)1709-17;以及J Immunol. 2002年11月I日；169(9) :5171-80中所述，通过引入氨基酸取代对IgGl抗体进行修饰，使得所得抗体在酸性条件(pH 6.0)下具有改进的人FcRn结合，同时变得能够在中性条件(pH7. 4)下与人FcRn结合。据报告，当给予食蟹猴(cynomolgusmonkey)时，所得抗体在血浆滞留方面既未显示改进，也未显示变化。因此，用于改进抗体功能的抗体工程技术只集中在通过提高在酸性条件下的人FcRn结合而非提高在中性条件(pH 7.4)下的结合而对抗体血浆滞留进行改进。迄今，没有报告描述通过将氨基酸取代引入IgG抗体的Fe结构域而改进中性条件(pH 7. 4)下的人FcRn结合的优势。即使抗体的抗原亲和力得到改进，血浆中的抗原消除也不可提高。据报告，与典型的抗体相比，上述PH依赖性抗原结合抗体作为用于提高抗原从血浆中消除的方法更有效(PTL I)。因此，与典型的抗体相比，单个pH依赖性抗原结合抗体与许多抗原结合，并能够促进从血浆中消除抗原。因此，PH依赖性抗原结合抗体具有通过典型抗体无法实现的作用。然而，迄今，有关用于进一步改进PH依赖性抗原结合抗体与抗原重复结合的能力并提高抗原从血浆中消除的作用的抗体工程改造方法尚无报告。下面给出与本发明有关的现在技术文献引用列表
专利文献[PTL 1]W0 2009/125825， ANTIGEN-BINDING MOLECULECAPABLE OF BINDING TOTWO OR MORE ANTIGENMOLECULES REPEATEDLY(能够与两个或更多个抗原分子重复结合的抗原结合分子)非专利文献[NPL l]Monoclonal antibody successes in the clinic (临床中单克隆抗体的成功应用)，Janice M Reichert，Clark J Rosensweig, Laura BFaden和Matthew C Dewitz,Nature Biotechnology 23，1073-1078 (2005)[NPL 2]Pavlou AK，Belsey MJ.，The therapeutic antibodies marketto2008 (2008 年的治疗性抗体市场)，Eur J Pharm Biopharm. 2005 年 4 月；59(3) :389-96 [NPL 3]Kim SJ,Park Y，Hong HJ. , Antibody engineering for thedevelopmentof therapeutic antibodies (用于治疗性抗体开发的抗体工程改造)，Mol Cells. 2005年8 月 31 日；20(1) :17-29.综述[NPL 4]Hinton PR，Xiong JM,Johlfs MG，Tang MT,Keller S，Tsurushita N. ，Anengineered human IgG lantibody with longer serumhalf-life (具有较长血清半衰期的工程改造的人 IgGl 抗体)，J Immunol. 2006 年 I 月 I 日；176(1) :346-56[NPL 5]Ghetie V，Popov S，Borvak J，Radu C，Matesoi D，MedesanC, OberRJ, Ward ES. ， Increasing the serum persistence of an IgGfragment by randommutagenesis (通过随机诱变增加IgG片段的血清存留)，Nat Biotechnol. 1997年7月；15(7) :637-40[NPL 6]Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 年 6 月 14 日；102(24) :8466-71. Epub2005年6月6 日.A general method for greatly improvingthe affinity of antibodiesby using combinatorial libraries (通过利用组合文库大大改进抗体亲和力的通用方法).Rajpal A, Beyaz N，Haber L，Cappuccilli G，Yee H，Bhatt RR, Takeuchi T，LernerRA，Crea R[NPL 7]Wu H，Pfarr DS, Johnson S，Brewah YA, Woods RM, PatelNK，White WI,Young JF， Kiener PA.Development of Motavizumab, anUltra-potent Antibody forthe Prevention of Respiratory Syncytial VirusInfection in the Upper and LowerRespiratory Tract (预防上下呼吸道的呼吸道合胞体病毒感染的超效抗体莫他珠单抗的开发).J Mol Biol. (2007)368 :652-665[NPL 8]Hanson CV, Nishiyama Y， Paul S.Catalytic antibodies andtheirapplications (催化抗体及其应用)· Curr Opin Biotechnol. 2005 年 12 月；16 (6) :631_6[NPL 9]Rathanaswami P，Roalstad S，Roskos L, Su QJ, Lackie S，BabcookJ. Demonstration of an in vivo generated sub—picomolar affinityfully humanmonoclonal antibody to interleukin-8 (体内产生的对抗白介素_8的亚皮摩尔亲和力完全人单克隆抗体的论证).Biochem BiophysRes Commun. 2005 年 9 月；334 (4) :1004-13发明概述技术问题鉴于上述情况实现了本发明。本发明的目的是提供用于通过使用抗原结合分子促进细胞对抗原摄入的方法、用于增加单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目的方法、用于通过给予抗原结合分子促进血浆抗原浓度降低的方法、用于改进抗原结合分子的药代动力学的方法、促进细胞对抗原摄入的抗原结合分子、结合抗原的数目增加的抗原结合分子、通过给药能够促进血浆抗原浓度降低的抗原结合分子、具有改进的药代动力学的抗原结合分子、包含所述抗原结合分子的药物组合物和用于产生上述这些的方法。问题的解决方案本发明人对以下方法进行了专心致志的研究用于通过抗原结合分子(具有抗原结合能力的分子，例如多肽)促进细胞对抗原摄入的方法、用于让抗原结合分子与抗原重复结合的方法、用于通过给予抗原结合分子促进血浆抗原浓度降低的方法，和用于改进抗原结合分子的血衆滞留的方法。因此，本发明人发现在早期内体pH(early endosomalpH)下具有人FcRn结合能力且在血浆pH下具有高于完整人IgG型免疫球蛋白活性的人FcRn结合活性的抗原结合分子可促进细胞对抗原的摄入。本发明人还发现，通过使用与在血浆PH·下相比，在早期内体PH下具有较弱抗原结合活性的抗原结合分子，可进一步提高抗原结合分子介导的细胞对抗原的摄入，且可增加可与单个抗原结合分子结合的抗原数目；通过给予这类抗原结合分子，可促进血浆抗原浓度的降低；且可改进抗原结合分子的药代动力学。具体地讲，本发明涉及用于促进抗原结合分子介导的细胞对抗原摄入的方法；用于增加单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目的方法；用于通过给予抗原结合分子促进血浆抗原浓度降低的方法；用于改进抗原结合分子的药代动力学的方法；用于降低血浆的总抗原浓度或游离抗原浓度的方法；提高细胞对抗原摄入的抗原结合分子；结合抗原的数目增加的抗原结合分子；通过给予所述分子能够促进血浆抗原浓度降低的抗原结合分子；具有改进的药代动力学的抗原结合分子；包含所述抗原结合分子的药物组合物；用于产生上述这些的方法等。更具体地讲，本发明提供[I]包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其在酸性和中性PH范围内具有人FcRn结合活性，其中在中性pH范围内人FcRn结合活性强于3. 2微摩尔；[2]包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其在中性pH范围内具有人FcRn结合活性，其中在中性pH范围内的人FcRn结合活性是完整人IgG的28倍；[3]包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其在中性pH范围内具有人FcRn结合活性，其中在中性pH范围内的人FcRn结合活性强于2. 3微摩尔；[4]包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其在中性pH范围内具有人FcRn结合活性，其中在中性pH范围内的人FcRn结合活性是完整人IgG的38倍；[5] [1]-[4]中任一个的抗原结合分子，其中中性pH范围为ρΗ7· 0-8.0 ;[6]包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其中将抗原结合分子给予非人动物后的血浆总抗原浓度低于将参比抗原结合分子给予非人动物后的血浆总抗原浓度，所述参比抗原结合分子包含相同的抗原结合结构域和完整人IgG Fe结构域作为人FcRn结合结构域；[7]抗原结合分子，其中将抗原结合分子给予非人动物后的血浆抗原浓度低于自未被给予抗原结合分子的非人动物得到的血浆总抗原浓度；[8]包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其中如下计算的所述抗原结合分子的抗原/抗原结合分子摩尔比率(C)C = A/B,
低于如下计算的抗原结合分子(其包含相同抗原结合结构域和完整人IgG Fe结构域作为人FcRn结合结构域)的抗原/抗原结合分子摩尔比率(C')；C' =A' /B'，其中；A为将抗原结合分子给予非人动物后血浆中的总抗原浓度，B为将抗原结合分子给予非人动物后抗原结合分子的血浆浓度，K'为将参比抗原结合分子给予非人动物后血浆中的总抗原浓度，B'为将参比抗原结合分子给予非人动物后抗原结合分子的血浆浓度；[9] [6]-[8]中任一个的抗原结合分子，其中非人动物是人FcRn转基因小鼠；[10] [6]_[9]中任一个的抗原结合分子，其中血浆抗原浓度是长期血浆总抗原浓度；[11] [6]_[9]中任一个的抗原结合分子，其中血浆抗原浓度是短期血浆总抗原浓度；[12]包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其在酸性和中性PH范围内具有人FcRn结合活性，其中在中性pH范围内的人FcRn结合活性强于完整人IgG的结合活性；[13][1]-[11]中任一个的抗原结合分子，其中在酸性pH范围内抗原结合结构域的抗原结合活性低于在中性PH范围内的抗原结合活性；[14] [12]或[13]的抗原结合分子，其中以KD (在酸性pH范围内)/KD (在中性pH范围内)的值计，酸性PH范围和中性pH范围内的抗原结合活性的比率至少为2 ；[15] [12]-[14]中任一个的抗原结合分子，其包含抗原结合结构域的氨基酸突变，其包含用组氨酸取代抗原结合结构域的至少一个氨基酸或插入至少一个组氨酸；[16][12]-[14]中任一个的抗原结合分子，其中抗原结合结构域获自抗原结合结构域文库；[17] [1]-[16]中任一个的抗原结合分子，其包含因用不同氨基酸取代亲本IgG的Fe结构域中的至少一个氨基酸而产生的Fe结构域作为人FcRn结合结构域；[18][1]-[17]中任一个的抗原结合分子，其中人FcRn结合结构域是这样的人FcRn结合结构域，其包含用不同氨基酸取代选自亲本IgG的Fe结构域中的以下位置氨基酸中的至少一个氨基酸的氨基酸序列237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434 和 436 (EU 编号)；[19] [I]-[18]中任一个的抗原结合分子，其包含在亲本IgG的Fe结构域中包含氨基酸取代的人FcRn结合结构域，其包含选自以下的至少一个氨基酸取代(EU编号)
237位上的Gly被取代为Met的氨基酸取代；238位上的Pro被取代为Ala的氨基酸取代；239位上的Ser被取代为Lys的氨基酸取代；248位上的Lys被取代为Ile的氨基酸取代；250 位上的 Thr 被取代为 Ala、Phe> lie、Met、Gin、Ser、Val、Trp 或 Tyr 的氨基酸取代； 252位上的Met被取代为Phe、Trp或Tyr的氨基酸取代；254位上的Ser被取代为Thr的氨基酸取代；255位上的Arg被取代为Glu的氨基酸取代；256位上的Thr被取代为Asp、Glu或Gln的氨基酸取代；257 位上的 Pro 被取代为 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser、Thr 或 Val 的氨基酸取代；258位上的Glu被取代为His的氨基酸取代；265位上的Asp被取代为Ala的氨基酸取代；270上的Asp被取代为Phe的氨基酸取代；286位上的Asn被取代为Ala或Glu的氨基酸取代；289位上的Thr被取代为His的氨基酸取代；297位上的Asn被取代为Ala的氨基酸取代；298上的Ser被取代为Gly的氨基酸取代；303位上的Val被取代为Ala的氨基酸取代；305位上的Val被取代为Ala的氨基酸取代；307 位上的 Thr 被取代为 Ala、Asp、Phe> Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Val、Trp 或 Tyr 的氨基酸取代；308 位上的 Val 被取代为 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gln 或 Thr 的氨基酸取代；309位上的Leu或Val被取代为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg的氨基酸取代；311位上的Gln被取代为Ala、His或Ile的氨基酸取代；312位上的Asp被取代为Ala或His的氨基酸取代；314位上的Leu被取代为Lys或Arg的氨基酸取代；315位上的Asn被取代为Ala或His的氨基酸取代；317位上的Lys被取代为Ala的氨基酸取代；325位上的Asn被取代为Gly的氨基酸取代；332位上的Ile被取代为Val的氨基酸取代；334位上的Lys被取代为Leu的氨基酸取代；360位上的Lys被取代为His的氨基酸取代；376位上的Asp被取代为Ala的氨基酸取代；380位上的Glu被取代为Ala的氨基酸取代；382位上的Glu被取代为Ala的氨基酸取代；384位上的Asn或Ser被取代为Ala的氨基酸取代；385位上的Gly被取代为Asp或His的氨基酸取代；
386位上的Gln被取代为Pro的氨基酸取代；387位上的Pro被取代为Glu的氨基酸取代；
389位的Asn被取代为Ala或Ser的氨基酸取代；424位上的Ser被取代为Ala的氨基酸取代；428 位上的 Met 被取代为 Ala、Asp、Phe> Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser> Thr、Val、Trp或Tyr的氨基酸取代；433位上的His被取代为Lys的氨基酸取代；434位上的Asn被取代为Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr的氨基酸取代；和436位上的Tyr或Phe被取代为His的氨基酸取代；[20] [I]-[18]中任一个的抗原结合分子,其人FcRn结合结构域包含选自亲本IgG的Fe结构域中的以下至少一个氨基酸(EU编号)氨基酸位置237上的Met ;氨基酸位置238上的Ala ；氨基酸位置239上的Lys ;氨基酸位置248上的Ile ;氨基酸位置250 上的 Ala、Phe、lie、Met、Gin、Ser、Val、Trp 或 Tyr ；氨基酸位置252上的Phe、Trp或Tyr ；氨基酸位置254上的Thr ；氨基酸位置255上的Glu ;氨基酸位置256上的Asp、Glu或Gln ;氨基酸位置257 上的 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser> Thr 或 Val ；氨基酸位置258上的Hi s ;氨基酸位置265上的Ala ；氨基酸位置270上的Phe ；氨基酸位置286上的Ala或Glu ;氨基酸位置289上的Hi s ;氨基酸位置297上的Ala ；氨基酸位置298上的Gly ；氨基酸位置303上的Ala ;氨基酸位置305上的Ala ；氨基酸位置307 上的 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Val、Trp 或 Tyr ；氨基酸位置308 上的 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gln 或 Thr ；氨基酸位置309 上的 Ala、Asp、Glu、Pro 或 Arg ；氨基酸位置311上的Ala、His或lie ;氨基酸位置312上的Ala或His ;氨基酸位置314上的Lys或Arg ；氨基酸位置315上的Ala或His ;氨基酸位置317上的Ala ；
氨基酸位置325上的Gly ;氨基酸位置332上的Val ；氨基酸位置334上的Leu ；氨基酸位置360上的Hi s ;氨基酸位置376上的Ala ；
氨基酸位置380上的Ala ；氨基酸位置382上的Ala ；氨基酸位置384上的Ala ；氨基酸位置385上的Asp或Hi s ;氨基酸位置386上的Pro ；氨基酸位置387上的Glu ;氨基酸位置389上的Ala或Ser ;氨基酸位置424上的Ala ;氛基酸位置428 上的 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser>Thr、Val、Trp 或 Tyr ；氨基酸位置433位置上的Lys ；氨基酸位置434 上的 Ala、Phe、His、Ser、Trp 或 Tyr ；和氨基酸位置436上的His ;[21] [18]-[20]中任一个的抗原结合分子，其中亲本IgG选自获自非人动物的IgG ；[22] [18]-[20]中任一个的抗原结合分子，其中亲本IgG是人IgG ；[23] [1]-[22]中任一个的抗原结合分子，其具有拮抗活性；[24] [1]-[23]的抗原结合分子，其与膜抗原或可溶性抗原结合；[25] [1]-[24]中任一个的抗原结合分子，其中抗原结合结构域包含与受体结合的人工配体；[26] [1]-[24]中任一个的抗原结合分子，其中抗原结合结构域包含与配体结合的人工受体；[27] [1]-[24]中任一个的抗原结合分子，其是抗体；[28] [27]的抗原结合分子，其中抗体选自嵌合抗体、人源化抗体或人抗体；[29]药物组合物，其包含[1]_[28]中任一个的抗原结合分子；[30]用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性而促进抗原结合分子介导的细胞对抗原摄入的方法，其中抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性；[31]用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性和降低其在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性PH范围内的抗原结合活性而促进抗原结合分子介导的细胞对抗原摄入的方法，其中抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性；[32]用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性而增加单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目的方法，其中抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性；[33]用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性且降低其在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性PH范围内的抗原结合活性而增加单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目的方法，其中抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性； [34]用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性而提高抗原结合分子从血浆中消除抗原的能力的方法，其中抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性；[35]用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性并降低其在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性PH范围内的抗原结合活性而提高抗原结合分子从血浆中消除抗原的能力的方法，其中抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性；·
[36]用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性而改进抗原结合分子的药代动力学的方法，其中抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性；[37]用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性并降低其在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性PH范围内的抗原结合活性而改进抗原结合分子的药代动力学的方法，其中抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性；[38]用于促进抗原结合分子与在细胞外与抗原结合分子结合的抗原胞内解离的方法，这通过提高其在中性PH范围内的人FcRn结合活性且降低其在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性PH范围内的抗原结合活性来进行，其中抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性；[39]用于促进以抗原结合的形式摄入细胞的抗原结合分子以无抗原形式胞外释放的方法，这通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性且降低其在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性pH范围内的抗原结合活性来进行，其中抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性；[40]用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性而降低血浆中总血浆抗原浓度或游离血浆抗原浓度的方法，其中抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性；[41]用于降低血浆中总血浆抗原浓度或游离血浆抗原浓度的方法，这通过提高其在中性PH范围内的人FcRn结合活性且降低其在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性PH范围内的抗原结合活性来进行，其中抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性；[42] [30]-[41]中任一个的方法，其中酸性pH范围为pH 5. 5_pH6. 5，中性pH范围为 pH 7. Ο-pH 8. O ；[43] [30]-[41]中任一个的方法，其中在中性pH范围内人FcRn结合活性的提高是通过用不同氨基酸取代人FcRn结合结构域的亲本IgG Fe结构域中的至少一个氨基酸而引起的增加；
[44] [30]-[41]中任一个的方法，其中在中性pH范围内人FcRn结合活性的提高是通过用不同氨基酸取代选自人FcRn结合结构域的亲本IgG Fe结构域中的以下位置氨基酸中的至少一个氨基酸而引起的增加237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434 和 436 (EU 编号)；[45] [31]、[33]、[35]、[37]-[39]和[41]中任一个的方法，其中通过用组氨酸取代抗原结合分子的至少一个氨基酸或插入至少一个组氨酸，将酸性PH范围内抗原结合分子的抗原结合活性降低至低于在中性PH范围内的抗原结合活性；[46] [31]、[33]、[35]、[37]-[39]和[41]中任一个的方法，其中抗原结合结构域获自抗原结合结构域文库；
[47] [31]、[33]、[35]、[37]-[39]和[41]中任一个的方法，其中抗原结合活性的降低通过KD (在酸性pH范围内)/KD (在中性pH范围内)的值的增加来表示，所述值是相对于组氨酸取代或插入之前酸性PH范围和中性pH范围内的抗原结合活性的比率；[48]用于产生抗原结合分子的方法，所述方法包括以下步骤(a)选择通过改变抗原结合分子的人FcRn结合结构域中的至少一个氨基酸获得的具有在中性PH范围内强于3. 2微摩尔的人FcRn结合活性的抗原结合分子；(b)得到编码抗原结合分子的基因，其中在(a)中制备的人FcRn结合结构域与抗原结合结构域连接；和(C)使用(b)中制备的基因产生抗原结合分子；[49]用于产生抗原结合分子的方法，所述方法包括以下步骤(a)选择与在改变在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子的人FcRn结合结构域中的至少一个氨基酸之前相比，在中性pH范围内具有较强的人FcRn结合活性的抗原结合分子；(b)改变抗原结合分子的抗原结合结构域中的至少一个氨基酸，并选择与在酸性PH范围内相比在中性pH范围内具有较强抗原结合活性的抗原结合分子；(c)获得编码抗原结合分子的基因，其中在(a)和(b)中制备的人FcRn结合结构域与抗原结合结构域连接；和(d)使用在(C)中制备的基因产生抗原结合分子；和[50]用于产生抗原结合分子的方法，所述方法包括以下步骤(a)选择与在改变在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子的人FcRn结合结构域中的至少一个氨基酸之前相比，在中性pH范围内具有较强的人FcRn结合活性的抗原结合分子；(b)选择与在酸性pH范围内相比在中性pH范围内具有较强抗原结合活性的抗原结合分子；(c)获得编码抗原结合分子的基因，其中在(a)和(b)中制备的人FcRn结合结构域与抗原结合结构域连接；和(d)使用在(C)中制备的基因产生抗原结合分子；[51]通过[48]_[50]中任一个的生产方法产生的抗原结合分子；[52]用于筛选抗原结合分子的方法，所述方法包括以下步骤
(a)选择通过改变抗原结合分子的人FcRn结合结构域中的至少一个氨基酸获得的具有在中性PH范围内强于3. 2微摩尔的人FcRn结合活性的抗原结合分子；(b)得到编码抗原结合分子的基因，其中在(a)中制备的人FcRn结合结构域与抗原结合结构域连接；和(C)使用(b)中制备的基因产生抗原结合分子；[53]用于筛选抗原结合分子的方法，所述方法包括以下步骤(a)选择与在改变在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子的人FcRn结合结构域中的至少一个氨基酸之前相比，在中性pH范围内具有较强的人FcRn结合活性的抗原结合分子；(b)改变抗原结合分子的抗原结合结构域中的至少一个氨基酸，并选择与在酸性PH范围内相比在中性pH范围内具有较强抗原结合活性的抗原结合分子；·(c)获得编码抗原结合分子的基因，其中在(a)和(b)中制备的人FcRn结合结构域与抗原结合结构域连接；和(d)使用在(C)中制备的基因产生抗原结合分子；[54]用于筛选抗原结合分子的方法，所述方法包括以下步骤(a)选择与在改变在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子的人FcRn结合结构域中的至少一个氨基酸之前相比，在中性pH范围内具有较强的人FcRn结合活性的抗原结合分子；(b)选择与在酸性pH范围内相比在中性pH范围内具有较强抗原结合活性的抗原结合分子；(c)获得编码抗原结合分子的基因，其中在(a)和(b)中制备的人FcRn结合结构域与抗原结合结构域连接；和(d)使用在(C)中制备的基因产生抗原结合分子；[55] [30]-[54]中任一个的方法，其中抗原结合结构域包含与受体结合的人工配体；[56] [30]-[54]中任一个的方法，其中抗原结合结构域包含与配体结合的人工受体；和[57] [30]-[54]中任一个的方法，其中抗原结合分子为抗体。发明的有益效果本发明提供用于促进抗原结合分子介导的细胞对抗原摄入的方法；用于增加单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目的方法；和用于通过给予抗原结合分子促进血浆抗原浓度降低的方法。当抗原结合分子介导的细胞对抗原的摄入受促进时，可通过给予这类抗原结合分子来促进血浆抗原浓度的降低，并且可改进抗原结合分子的药代动力学以增加单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目。因此，抗原结合分子可产生比普通抗原结合分子更优良的体内作用。附图简述图I在图中显示将抗人IL-6受体抗体给予人FcRn转基因小鼠(品系276)后可溶形式的人IL-6受体的血浆浓度的时程，其中可溶形式人IL-6受体的血浆浓度是恒定的(稳态输注模型)。图2是显示IgG抗体分子与内体中可溶性抗原的解离引起抗原消除加强，导致与另一抗原新一轮结合的示意图。图3在图中显示人FcRn转基因小鼠中血浆抗体浓度的时程。图4在图中显示人FcRn转基因小鼠中可溶形式的人IL_6受体的血浆浓度的时程。图5在图中显示正常小鼠中血浆抗体浓度的时程。图6在图中显示正常小鼠中可溶形式的人IL-6受体的血浆浓度的时程。
图7在图中显示正常小鼠中人IL-6受体的未结合可溶形式的血浆浓度的时程。图8在图中显示人FcRn转基因小鼠中可溶形式的人IL_6受体的血浆浓度的时程。图9在图中显示以低剂量(O. 01mg/kg)或lmg/kg给予Fv4_IgGl_F14后可溶形式的人IL-6受体的血浆浓度的时程。

图10在图中显示以低剂量((X01mg/kg)或lmg/kg给予Fv4_IgGl_F14后血衆抗体浓度的时程。图11在图中显示在将抗人IL-6受体抗体给予正常小鼠(其中可溶形式人IL-6受体的血浆浓度是恒定的)后，可溶形式的人IL-6受体的血浆浓度的时程。图12在图中显示将hsIL_6R和抗人IL-6受体抗体共注射给人FcRn转基因小鼠(品系276)后血浆抗体浓度的时程。图13在图中显示将hsIL_6R和抗人IL-6受体抗体共注射给人FcRn转基因小鼠(品系276)后，可溶形式的人IL-6受体的血浆浓度的时程。图14描述了在pH 7. O下Fe变体与人FcRn的结合亲和力之间的关系以及将hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体共注射给人FcRn转基因小鼠(品系276)后第I天的血浆hsIL_6R 浓度。图15描述了在pH 7.0下Fe变体与人FcRn的结合亲和力之间的关系以及将hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体共注射给人FcRn转基因小鼠(品系276)后第I天的血浆抗体浓度。图16描述了将hsIL_6R和抗人IL-6受体抗体共注射给人FcRn转基因小鼠(品系276)后，抗原/抗体摩尔比率(C值)的时程。图17描述了在pH 7. O下Fe变体与人FcRn的结合亲和力之间的关系以及将hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体共注射给人FcRn转基因小鼠(品系276)后第I天的抗原/抗体摩尔比率(C值)的时程。图18在图中显示在以低剂量(O. 01或O. 2mg/kg)或lmg/kg将Fv4_IgGl_F14给予人FcRn转基因小鼠(品系276)(其中hsIL_6R的血浆浓度是恒定的)(稳态输注模型)后hsIL-6R的血浆浓度的时程。图19描述了在将hsIL_6R和抗人IL-6受体抗体共注射给人FcRn转基因小鼠(品系276和32)后，人FcRn转基因小鼠品系276和品系32中血浆hsIL_6R浓度的时程。图20描述了在将hsIL_6R和抗人IL-6受体抗体共注射给人FcRn转基因小鼠(品系276和32)后，人FcRn转基因小鼠品系276和品系32中血浆抗体浓度的时程。
图21在图中显示在将抗人IL-6受体抗体给予人FcRn转基因小鼠(品系32)(其中hsIL-6R的血浆浓度是恒定的)(稳态输注模型)后，hsIL-6R的血浆浓度的时程。图22在图中显示在将抗人IL-6受体抗体给予人FcRn转基因小鼠(品系32)(其中hsIL-6R的血浆浓度是恒定的)(稳态输注模型)后，抗体血浆浓度的时程。图23描述了在将抗人IL-6受体抗体给予人FcRn转基因小鼠(品系32)(其中hsIL-6R的血浆浓度是恒定的)(稳态输注模型)后，抗原/抗体摩尔比率(C值)的时程。图24描述了在pH7. O下Fe变体与人FcRn的结合亲和力之间的关系以及在将抗人IL-6受体抗体给予人FcRn转基因小鼠(品系32)(其中hsIL_6R的血浆浓度是恒定的)(稳态输注模型)后第I天抗原/抗体摩尔比率(C值)。图25在图中显示在将具有FlI、F39、F48和F264的Fe变体的抗人IL-6受体抗体给予人FcRn转基因小鼠(品系32)(其中hsIL_6R的血浆浓度是恒定的)(稳态输注模型)后血浆抗体浓度的时程。图26在图中显示在将具有F11、F39、F48和F264的Fe变体的抗人IL_6受体抗体给予给予人FcRn转基因小鼠(品系32)(其中hsIL_6R的血浆浓度是恒定的)(稳态输注模型)后hsIL-6R的血浆浓度的时程。图27在图中显示在将具有F157、F196和F262的Fe变体的抗人IL_6受体抗体给予人FcRn转基因小鼠(品系32)(其中hsIL_6R的血浆浓度是恒定的)(稳态输注模型)后血浆抗体浓度的时程。图28在图中显示在将具有F157、F196和F262的Fe变体的抗人IL_6受体抗体给予人FcRn转基因小鼠(品系32)(其中hsIL_6R的血浆浓度是恒定的)(稳态输注模型)后hsIL-6R的血浆浓度的时程。图29描述了用于常规抗体和抗原消除性抗体的计算机模拟研究(in silicostudy)的药代动力学模型。图30在图中显示在给正常小鼠共注射人IL-6和抗人IL_6抗体后人IL_6的血浆浓度的时程。图31在图中显示在给正常小鼠共注射人IL-6和抗人IL_6抗体后抗体的血浆浓度的时程。图32示出了采用Biacore在pH 7. 4和pH 6. O下与CD89_Fc融合蛋白结合的人IgA的传感图。图33在图中显示在给正常小鼠共注射人IgA和⑶89_Fc融合蛋白后人IgA的血浆浓度的时程。图34在图中显示在给正常小鼠共注射人IgA和⑶89_Fc融合蛋白后抗体的血浆浓度的时程。图35在图中显示在给正常小鼠共注射可溶性人丛蛋白Al和抗人丛蛋白Al抗体后7小时可溶性人丛蛋白Al的血浆浓度。实施方案的描述本发明提供用于促进抗原结合分子介导的细胞对抗原摄入的方法。更具体地讲，本发明提供通过在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子促进细胞对抗原摄入的方法，所述方法基于增加抗原结合分子在中性pH范围内的人FcRn结合活性。本发明还提供通过在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子提高细胞对抗原摄入的方法，其基于改变抗原结合分子的人FcRn结合结构域中的至少一个氨基酸。本发明还提供通过在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子促进细胞对抗原摄入的方法，所述方法基于使用包含具有取代的氨基酸序列的人FcRn结合结构域，所述取代为用不同氨基酸取代选自包含亲本IgG的Fe结构域的人FcRn结合结构域的亲本IgGFc结构域中的以下 位置氨基酸中的至少一个氨基酸237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434 和436 (EU 编号)。本发明还提供用于促进抗原结合分子介导的细胞对抗原摄入的方法，其通过降低上述抗原结合分子在酸性PH范围内的抗原结合活性(结合能力)至小于其在中性pH范围内的抗原结合活性来进行；并且这促进细胞对抗原的摄入。本发明还提供用于促进抗原结合分子介导的细胞对抗原摄入的方法，所述方法基于改变上述抗原结合分子的抗原结合结构域中的至少一个氨基酸，其促进细胞对抗原的摄入。本发明还提供用于促进抗原结合分子介导的细胞对抗原摄入的方法，所述方法基于用组氨酸取代至少一个氨基酸或将至少一个组氨酸插入上述抗原结合分子的抗原结合结构域，其促进细胞对抗原的摄入。在本文中，由抗原结合分子介导的“细胞对抗原的摄入”意指通过胞吞将抗原摄入细胞。同时，在本文中，“促进摄入细胞”意指提高与血浆中抗原结合的抗原结合分子的胞内摄取速率，和/或降低所摄取的抗原重新循环至血浆的量。这意味着与在提高在中性PH范围内抗原结合分子的人FcRn结合活性之前、或在增加在酸性pH范围内抗原结合分子的人FcRn结合活性和降低在酸性pH范围内抗原结合分子的抗原结合活性(结合能力)至小于其在中性PH范围内的抗原结合活性之前的抗原结合分子相比，摄入细胞的速率得到促进。优选与完整人IgG相比，更优选与完整人IgG相比，该速率得到改进。因此，在本发明中，可根据细胞对抗原摄入的速率的增加，来评价抗原结合分子是否促进细胞对抗原的摄入。可通过例如在将抗原和抗原结合分子加入培养基中后，监测含有表达人FcRn的细胞的培养基中抗原浓度随时间的降低，或监测摄入表达人FcRn的细胞的随时间推移的抗原量，来计算细胞对抗原摄入的速率。例如，可采用促进抗原结合分子介导的细胞对抗原摄入的速率的本发明方法，通过给予抗原结合分子，提高抗原从血浆中消除的速率。因此，可通过例如通过给予抗原结合分子，测试抗原从血浆中消除的速率是否加快或血浆总抗原浓度是否降低，来评价是否促进抗原结合分子介导的细胞对抗原摄入。在本文中，“血浆总抗原浓度”意指抗原结合分子结合的抗原浓度与未结合的抗原浓度即“血浆游离抗原浓度”的总和，所述血浆游离抗原浓度是抗原结合分子未结合的抗原浓度。测量“血浆总抗原浓度”或“血浆游离抗原浓度”的各种方法如下所述是本领域众所周知的。本文所用的“完整人IgG”意指未修饰的人IgG，且不限于IgG的特定类别。这意味着人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4均可用作“完整人IgG”，只要在酸性pH范围内可与人FcRn结合。优选“完整人IgG”可以是人IgGl。本发明还提供用于增加单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目的方法。更具体地讲，本发明提供通过提高在中性pH范围内抗原结合分子的人FcRn结合活性，而提高在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性的单一抗原结合分子可与之结合的抗原的数目的方法。本发明还提供通过改变抗原结合分子的人FcRn结合结构域中的至少一个氨基酸，而提高在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性的单一抗原结合分子可与之结合的抗原的数目的方法。本发明还提供增加在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性的单一抗原结合分子可与之结合的抗原的数目的方法，所述方法通过使用包含这样氨基酸序列的人FcRn结合结构域来进行，在所述氨基酸序列中，选自包含亲本IgG Fe结构域的人FcRn结合结构域的亲本IgG Fe结构域中的以下位置氨基酸中的至少一个氨基酸被不同氨基酸取代237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、 428,433,434和 436 (EU 编号)。本文所用的“亲本IgG”意指未修饰的IgG，其随后被修饰以产生变体，只要亲本IgG的修饰变体可在酸性pH范围内与人FcRn结合(因此，在酸性条件下，亲本IgG不必需要与人FcRn结合活性)。亲本IgG可以是天然存在的IgG，或天然存在的IgG的变体或工程改造形式。亲本IgG可指多肽本身、包含亲本IgG的组合物或编码亲本IgG的氨基酸序列。应注意，亲本IgG”包括下文概述的已知市售的重组产生的IgG。“亲本IgG”的来源不受限制，可获自非人动物或人的任何生物。优选生物选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠(gerbi I)、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼和非人灵长类动物。在另一个实施方案中，“亲本IgG”也可获自食蟹猴(cynomologous)、狨猴、猕猴、黑猩猩或人。优选“亲本IgG”获自人IgGl，但不限于IgG的特定类别。这意味着人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4均可适当地用作“亲本IgG”。类似地，上述任何生物的IgG的任何类别或亚类可优选用作“亲本IgG”。天然存在的IgG的变体或工程改造形式的实例描述于Curr Opin Biotechnol. 2009年12月；20(6) :685_91 ；Curr Opin Immunol. 2008 年 8 月；20(4) 460-70 ；Protein Eng Des Sel. 2010 年 4 月；23(4) 195-202 ；W02009/086320,W0 2008/092117,WO 2007/041635 和 WO 2006/105338，但不限于这些。此外，本发明提供通过降低上述抗原结合分子(其抗原结合事件的数目增加)在酸性PH范围内的抗原结合活性(结合能力)至小于其在中性pH范围内的抗原结合活性，而增加单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目的方法。本发明还提供通过改变上述抗原结合分子(其抗原结合事件的数目增加)的抗原结合结构域的至少一个氨基酸，而增加单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目的方法。本发明还提供通过用组氨酸取代至少一个氨基酸或将至少一个组氨酸插入具有上述抗原结合分子(其抗原结合事件的数目增加)的抗原结合结构域，而增加单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目的方法。在本文中，“单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目”意指单个抗原结合分子可与之结合直到该分子因降解而被消除的抗原的数目。在本文中，“增加单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目”意指直到抗原结合分子因降解而被消除时所实现的循环数目增力口，其中每个循环由以下组成抗原与血浆中的抗原结合分子结合，胞内摄取与抗原结合的抗原结合分子，在内体中与抗原解离，接着抗原结合分子返回到血浆中。这意味着与在提高抗原结合分子在中性PH范围内的人FcRn结合活性之前，或在提高在酸性pH范围内抗原结合分子的人FcRn结合活性且降低在酸性pH范围内抗原结合分子的抗原结合活性(结合能力)至小于其在中性pH范围内的抗原结合活性之前的抗原结合分子相比，循环数增加。因此，可通过测试上述“胞内摄取是否得到促进”或下述“药代动力学是否改进”，来评价循环数是否增加。本发明还提供用于促进自细胞外与抗原结合的抗原结合分子上胞内解离出抗原的方法。更具体地讲，本发明提供促进自细胞外与抗原结合的抗原结合分子上胞内解离出抗原的方法，所述方法如下进行通过提高在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子在中性PH范围内的人FcRn结合活性，并降低其在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性PH范围内的抗原结合活性。本发明还提供用于促进自细胞外与抗原结合的抗原结合分子上胞内解离出抗原的方法，其基于改变抗原结合分子的抗原结合结构域的至少一个氨基酸，且同时改变在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子的人FcRn结合结构域的至少一个氨基酸。本发明还提供用于促进自细胞外与抗原结合的抗原结合分子上胞内解离出抗原的方法，所述方法如下进行通过用组氨酸取代至少一个氨基酸或将至少一个组氨酸插入抗原结合分子的抗原结合结构域，同时用不同氨基酸取代选自人FcRn结合结构域的亲本IgG Fe结构域中的以下位置氨基酸中的至少一个氨基酸237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、·308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434 和 436 (EU 编号)。在本发明中，抗原可自细胞内的任何位置处的抗原结合分子上解离；然而，优选的解离位点是早期内体。在本文中，“自抗原结合分子上胞内解离出在细胞外与抗原结合分子结合的抗原”不一定意味着通过与抗原结合分子结合摄入细胞的全部抗原都在细胞内自抗原结合分子上解离。因此，可以接受的是，与在降低在酸性PH范围内抗原结合分子的抗原结合活性至小于在中性pH范围内的抗原结合活性且同时提高在中性pH范围内的人FcRn结合活性之前相比，在细胞内自抗原结合分子上解离的抗原的比例增加。用于促进自细胞外与抗原结合的抗原结合分子上胞内解离出抗原的这类方法与以下方法同义通过促进与抗原结合的抗原结合分子的摄取而赋予抗原结合分子促进自抗原结合分子上胞内解离出抗原的性质的方法。本发明还提供用于促进以抗原结合的形式摄入细胞中的不含抗原的抗原结合分子在胞外释放的方法。更具体地讲，本发明提供用于促进以抗原结合的形式摄入细胞中的不含抗原的抗原结合分子在胞外释放的方法，所述方法如下进行通过提高在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子在中性pH范围内的人FcRn结合活性并降低其在酸性PH范围内的抗原结合活性至小于在中性pH范围内的抗原结合活性。本发明还提供用于促进以抗原结合的形式摄入细胞中的不含抗原的抗原结合分子在胞外释放的方法，所述方法基于改变抗原结合分子中的至少一个氨基酸，且同时改变人FcRn结合结构域中的至少一个氨基酸。本发明还提供用于促进以抗原结合的形式摄入细胞中的不含抗原的抗原结合分子在胞外释放的方法，所述方法如下进行通过用组氨酸取代至少一个氨基酸或将至少一个组氨酸插入抗原结合分子，同时用不同氨基酸取代选自人FcRn结合结构域的亲本IgG Fe结构域中的以下位置氨基酸中的至少一个氨基酸237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434 和 436 (EU编号)。在本文中，“以抗原结合的形式摄入细胞中的不含抗原的抗原结合分子在胞外释放”不一定意味着摄入细胞中的与抗原结合的全部抗原结合分子以不含抗原的形式在细胞外释放。可以接受的是，与在降低在酸性PH范围内抗原结合分子的抗原结合活性至小于在中性pH范围内的抗原结合活性并提高在中性pH范围内的人FcRn结合活性之前相比，以不含抗原的形式释放到细胞外的抗原结合分子的比例增加。释放到细胞外的抗原结合分子优选保持抗原结合活性。用于促进以抗原结合的形式摄入细胞的不含抗原的抗原结合分子在胞外释放的这类方法与以下方法同义通过促进与抗原结合的抗原结合分子摄入细胞中而赋予抗原结合分子促进以抗原结合的形式摄入细胞中的不含抗原的抗原结合分子在胞外释放的性质的方法。本发明还提供用于通过给予抗原结合分子而提高消除血浆抗原的能力的方法。在本发明中，“用于提高消除血浆抗原的能力的方法”与“用于提高抗原结合分子从血浆中消 除抗原的能力的方法”同义。更具体地讲，本发明提供用于提高由在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子消除血浆抗原的能力的方法，所述方法通过提高在中性pH范围内抗原结合分子的人FcRn结合活性来进行。本发明还提供用于提高由在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子消除血浆抗原的能力的方法，所述方法基于改变抗原结合分子的人FcRn结合结构域中的至少一个氨基酸。本发明还提供用于提高由在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子消除血浆抗原的能力的方法，所述方法通过使用包含具有取代的氨基酸序列的人FcRn结合结构域来进行，所述取代为用不同氨基酸取代选自包含亲本IgG的Fe结构域的人FcRn结合结构域的亲本IgG Fe结构域中的以下位置氨基酸中的至少一个氨基酸237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、
428,433,434和 436 (EU 编号)。本发明还提供用于提高抗原结合分子消除血浆抗原的能力的方法，所述方法如下进行与在中性PH范围内的抗原结合活性相比，降低消除血浆抗原的能力得到改进的上述抗原结合分子在酸性PH范围内的抗原结合活性。本发明还提供用于提高抗原结合分子消除血浆抗原的能力的方法，所述方法如下进行通过改变消除血浆抗原的能力得到改进的上述抗原结合分子的抗原结合结构域中的至少一个氨基酸。本发明还提供用于通过给予抗原结合分子以提高消除血浆抗原的能力的方法，所述方法如下进行通过用组氨酸取代至少一个氨基酸或将至少一个组氨酸插入消除血浆抗原的能力得到改进的上述抗原结合分子的抗原结合结构域。在本文中，“消除血浆抗原的能力”意指当给予或体内分泌抗原结合分子时从血浆中消除抗原的能力。因此，“抗原结合分子消除血浆抗原的能力的提高”在本文中意指与在提高抗原结合分子在中性pH范围内的人FcRn结合活性之前或在增加人FcRn结合活性且同时降低其在酸性PH范围内的抗原结合活性至小于在中性pH范围内的抗原结合活性之前相比，给予抗原结合分子时从血浆中消除抗原的速率加快。可通过例如体内给予可溶性抗原和抗原结合分子，并测量给予后血浆中可溶性抗原的浓度，来评价抗原结合分子从血浆中消除抗原的活性的提高。当通过提高在中性PH范围内抗原结合分子的人FcRn结合活性，或通过提高其人FcRn结合活性且同时降低其在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性PH范围内的抗原结合活性，在给予可溶性抗原和抗原结合分子后血浆中的可溶性抗原浓度降低时，可认定抗原结合分子消除血浆抗原的能力提高。可溶性抗原的形式可为抗原结合分子结合的抗原或抗原结合分子未结合的抗原，其浓度可分别测定为“血浆中抗原结合分子结合的抗原浓度”和“血浆中抗原结合分子未结合的抗原浓度”(后者与“血浆游离抗原浓度”同义)。因为“血浆总抗原浓度”意指抗原结合分子结合的抗原浓度和未结合的抗原浓度或“血浆游离抗原浓度”的总和，后者是抗原结合分子未结合的抗原浓度，可溶性抗原的浓度可测定为“血浆总抗原浓度”。用于测量“血浆总抗原浓度”或“血浆游离抗原浓度”的各种方法如下所述是本领域众所周知的。本发明还提供用于改进抗原结合分子的药代动力学的方法。更具体地讲，本发明提供用于通过提高在中性PH范围内抗原结合分子的人FcRn结合活性，而改进在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子的药代动力学的方法。此外，本发明提供用于通过改变抗原结合分子的人FcRn结合结构域中的至少一个氨基酸，而改进在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子的药代动力学。
本发明还提供用于改进在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子的药代动力学，其通过使用包含具有取代的氨基酸序列的人FcRn结合结构域来进行，所述取代为用不同氨基酸取代选自包含IgG的Fe结构域的人FcRn结合结构域的亲本IgG Fe结构域中的以下位置氨基酸中的至少一个氨基酸237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434 和 436 (EU 编号)。此外，本发明提供用于改进抗原结合分子的药代动力学的方法，所述方法如下进行通过降低药代动力学得到改进的上述抗原结合分子在酸性PH范围内的抗原结合活性至小于其在中性PH范围内的抗原结合活性。本发明还提供用于改进在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子的药代动力学的方法，所述方法如下进行通过改变药代动力学得到改进的上述抗原结合分子的抗原结合结构域中的至少一个氨基酸。本发明还提供用于改进药代动力学的方法，所述方法如下进行通过用组氨酸取代至少一个氨基酸或将至少一个组氨酸插入药代动力学得到改进的上述抗原结合分子的抗原结合结构域。在本文中，“药代动力学的提高”、“药代动力学的改进”和“优良的药代动力学”可以以另一方式描述为“血浆(血液)滞留的提高”、“血浆(血液)滞留的改进”、“优良的血浆(血液)滞留”和“延长的血浆(血液)滞留”。这些术语是同义的。在本文中，“药代动力学的改进”不仅仅是指在将抗原结合分子给予人或非人动物例如小鼠、大鼠、猴、兔和狗后直到从血浆中消除(例如直到抗原结合分子在胞内降解等，且不能返回到血浆中)的时间延长，而且还指在给药期至因降解所致消除期间，以允许抗原结合的形式(例如以抗原结合分子的无抗原形式)的抗原结合分子的血浆滞留延长。完整人IgG可与非人动物的FcRn结合。例如，可优选使用小鼠对其给药，以证实本发明的抗原结合分子的性质，因为与人FcRn相比，完整人IgG可更牢地与小鼠FcRn结合(Int Immunol. 2001年12月；13(12) : 1551-9)。作为另一个实例，还可优选使用小鼠，其中其天然FcRn基因被破坏且带有待表达的人FcRn基因这一转基因(MethodsMolBiol. 2010 ；602 :93_104)，对该小鼠进行给药以证实本文下述本发明的抗原结合分子的性质。具体而言，“药代动力学的改进”还包括时间延长直到由未与抗原结合的抗原结合分子(抗原结合分子的无抗原形式)降解所致消除。如果抗原结合分子已经与抗原结合，则血浆中的抗原结合分子不能与新的抗原结合。因此，抗原结合分子未与抗原结合的时间越长，它可与新抗原结合的时间越长(与另一抗原结合的机会越高)。这在体内能够缩短抗原游离于抗原结合分子的时间，并且延长抗原与抗原结合分子结合的时间。可通过给予抗原结合分子加快抗原从血浆中消除，而增加抗原结合分子的无抗原形式的血浆浓度，且延长抗原与抗原结合分子结合的时间。具体而言，本文中，“抗原结合分子的药代动力学的改进”包括在给予抗原结合分子后，抗原结合分子的无抗原形式的药代动力学参数改进(血浆半衰期延长、血浆平均滞留时间延长和血浆清除削弱中的任一个)、抗原与抗原结合分子结合的时间延长，以及血浆中抗原结合分子介导的抗原消除加快。可通过测定以下参数的任一个，来评价抗原结合分子的药代动力学的改进血浆半衰期、平均血浆滞留时间和抗原结合分子或其无抗原形式的血衆清除(“Pharmacokinetics :Enshu_niyoruRikai (Understanding throughpractice) Vanzando)。例如，在将抗原结合分子给予小鼠、大鼠、猴、兔、狗或人后，测定抗原结合分子或其无抗原形式的血浆浓度。然后，测定各参数。当血浆半衰期或平均血浆滞留时间延长时，可认定抗原结合分子的药代动力学得到改进。可通过本领域技术人员已知方法测定参数。可按照随附说明手册，应用药代动力学分析软 件WinNonlin(Pharsight),通过例如非无房室分析来对参数进行恰当评价。可通过本领域技术人员已知方法，例如米用Clin Pharmacol. 2008年4月；48 (4) 406-17中所描述的测定方法，测定无抗原的抗原结合分子的血浆浓度。在本文中，“药代动力学的改进”还包括在给予抗原结合分子后，抗原与抗原结合分子结合的时间延长。可通过测定游离抗原的血浆浓度，来评价在给予抗原结合分子后抗原与抗原结合分子结合的时间是否延长。可根据所测定的游离抗原的血浆浓度或提高游离抗原浓度与总抗原深度的比率所需时间，来认定延长。可通过本领域技术人员已知方法，例如通过Pharm Res. 2006年I月；23 (I):95-103中描述的方法，来测定未与抗原结合分子结合的游离抗原的血浆浓度或游离抗原浓度与总浓度的比率。或者，当抗原在体内具有特定功能时，可通过测试抗原功能是否被中和，来评价抗原是否与中和抗原功能的抗原结合分子(拮抗性分子)结合。可通过测定反映抗原功能的体内标志物，来评价抗原功能是否被中和。可通过测定反映抗原功能的体内标志物，来评价抗原是否与激活抗原功能的抗原结合分子(激动性分子)结合。游离抗原的血浆浓度和血浆中游离抗原的量与血浆中的抗原总量的比率的测定、体内标志物测定和这类测量不受特别限制；然而，优选在给予抗原结合分子后过一定时间后实施测定。在本发明中，在给予抗原结合分子后的时间不受特别限制；本领域的技术人员可根据所给予的抗原结合分子的性质等，来确定合适的时间。这类时间包括例如给予抗原结合分子后I天、给予抗原结合分子后3天、给予抗原结合分子后7天、给予抗原结合分子后14天和给予抗原结合分子后28天。在本文中，“血浆抗原浓度”意指“血浆总抗原浓度”，其是抗原结合分子结合的抗原和未结合的抗原浓度的总和，或意指“血浆游离抗原浓度”，其是抗原结合分子未结合的抗原浓度。与给予包含完整人IgG Fe结构域作为人FcRn结合结构域的参比抗原结合分子相t匕，或与当不给予本发明的抗原结合结构域分子时相比，通过给予本发明的抗原结合分子，可降低血浆总抗原浓度达2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1，000倍或
甚至更高倍。可如下计算抗原/抗原结合分子的摩尔比率A值各时间点的抗原摩尔浓度B值各时间点的抗原结合分子摩尔浓度 C值各时间点抗原摩尔浓度/抗原结合分子摩尔浓度(抗原/抗原结合分子摩尔比率)C = A/BoC值越小，表明每抗原结合分子的抗原消除效率越高，而C值越高，则表明每抗原结合分子的抗原消除效率越低。抗原/抗原结合分子摩尔比率可如上述计算。与包含完整人IgG Fe结构域作为人FcRn结合结构域的参比抗原结合分子相比，给予本发明的抗原结合分子可降低抗原/抗原结合分子摩尔比率达2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1，000倍或甚至更高倍。在本文中，完整人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4优选用作完整人IgG，目的在于针对其人FcRn结合活性或体内活性对参比完整人IgG与抗原结合分子进行比较。优选可适当使用参比抗原结合分子，其包含与目标抗原结合分子相同的抗原结合结构域和完整人IgG Fe结构域作为人FcRn结合结构域。更优选使用完整人IgGl，目的在于针对其人FcRn结合活性或体内活性对参比完整人IgG与抗原结合分子进行比较。可按实施例6、8和13中所述，评价血浆总抗原浓度或抗原/抗体摩尔比率的降低。更具体地讲，使用人FcRn转基因小鼠品系32或品系276 (Jackson Laboratories,Methods Mol Biol. 2010 ；602 93-104)，当抗原结合分子不与小鼠对应抗原交叉反应时，可通过抗原-抗体共注射模型或稳态抗原输注模型对其进行评价。当抗原结合分子与小鼠对应物交叉反应时，仅仅将抗原结合分子注射给人FcRn转基因小鼠品系32或品系276 (Jackson Laboratories),便可对其进行评价。在共注射模型中，将抗原结合分子和抗原的混合物给予小鼠。在稳态抗原输注模型，将装有抗原溶液的输注泵植入小鼠中以实现恒定的血浆抗原浓度，然后给小鼠注射抗原结合分子。以相同的剂量给予试验抗原结合分子。采用本领域技术人员已知方法，在适当的时间点测量血浆总抗原浓度、血浆游离抗原浓度和血浆抗原结合分子浓度。可在给予后2、4、7、14、28、56或84天测量血浆总抗原浓度或游离抗原浓度及抗原/抗原结合分子摩尔比率以评价本发明的长期作用。换句话说，在给予抗原结合分子后2、
4、7、14、28、56或84天，通过测量血浆总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比率来测定长期血浆抗原浓度，以评价本发明的抗原结合分子的性质。可通过评价任一个或多个上述时间点的降低来确定本发明所述抗原结合分子是否实现血浆抗原浓度或抗原/抗原结合分子摩尔比率的降低。可在给予后15分钟、1、2、4、8、12或24小时测量血浆总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比率，以评价本发明的短期作用。换句话说，通过在给予抗原结合分子后15分钟、1、2、4、8、12或24小时测量血浆总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比率，来测定短期血浆抗原浓度，以评价本发明的抗原结合分子的性质。
本发明的抗原结合分子的给药途径可选自皮内、静脉内、玻璃体内、皮下、腹膜内、胃肠外和肌内注射。在本发明中，优选在人中药代动力学的改进。如果难以确定人中的血浆滞留，则其可根据小鼠(例如正常小鼠、表达人抗原的转基因小鼠、表达人FcRn的转基因小鼠)或猴(例如食蟹猴)中的血浆滞留来预测。在本文中，酸性pH范围通常是指pH 4.0-pH 6.5。酸性pH范围优选为由pH
5.5-pH 6. 5 内的任何 pH 值表示的范围，优选选自 5· 5、5· 6、5· 7、5· 8、5· 9、6· 0、6· 1、6· 2、
6.3、6. 4和6. 5，特别优选pH 5. 8_pH6. O，这接近于体内早期内体的pH。同时，本文的中性pH范围通常是指pH 6. 7-pH 10.0。中性pH范围优选为由pH 7. Ο-pH 8. O内的任何pH值表示的范围，优选选自 pH 7. 0,7. 1,7. 2,7. 3,7. 4,7. 5,7. 6,7. 7,7. 8,7. 9 和 8. 0，特别优选pH 7. 4，这与体内血浆(血液)pH接近。如果由于其在pH 7. 4的低亲和力所致，难以评价 人FcRn结合结构域与人FcRn之间的结合亲和力，则可使用pH 7. O替代pH 7.4。至于用于测定条件的温度，可在10°C -50°C的任何温度下评价人FcRn结合结构域与人FcRn之间的结合亲和力。优选采用15°C-40°C的温度以测定人FcRn结合结构域与人FcRn之间的结合亲和力。更优选还采用200C _35°C的任何温度，比如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35°C中的任一个，以测定人FcRn结合结构域与人FcRn之间的结合亲和力。实施例5中所述的25°C温度是本发明的实施方案的一个实例。因此，本文中“降低酸性pH范围内抗原结合分子的抗原结合活性至小于在中性pH范围内的抗原结合活性”意指与其在pH 6.7-pH 10. O下的抗原结合活性相比，抗原结合分子在pH 4. Ο-pH 6. 5下的抗原结合活性减弱。优选上述表述意指与在pH 7. Ο-pH 8. O下的抗原结合活性相比，抗原结合分子在pH 5.5-pH 6. 5下的抗原结合活性减弱，更优选意指与其在体内血浆PH下的抗原结合活性相比，其在早期内体pH下的抗原结合活性减弱。具体而言，与在pH 7. 4下抗原结合分子的抗原结合活性相比,在pH 5. 8-pH 6. O下抗原结合分子的抗原结合活性减弱。同时，本文的表述“降低酸性pH范围内抗原结合分子的抗原结合活性至小于在中性PH范围内的抗原结合活性”亦可表述为“提高在中性pH范围内抗原结合分子的抗原结合活性至大于在酸性PH范围内的抗原结合活性”。具体而言，在本发明中，可提高抗原结合分子的抗原结合活性在酸性和中性pH范围之间的比率。例如，在下述实施方案中，KD (pH
5.8)/KD(pH 7.4)的值增加。可通过例如降低其在酸性pH范围内的抗原结合活性、增加其在中性PH范围内的抗原结合活性或两者，来提高抗原结合分子的抗原结合活性在酸性和中性pH范围之间的比率。在本文中，表述“与在中性pH范围内的抗原结合活性相比，在酸性pH范围内的抗原结合活性减弱”有时用“降低在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性pH范围内的抗原结合活性”代替。在本文中，在酸性pH范围内的人FcRn结合活性意指在pH 4. 0_pH6. 5下的人FcRn结合活性，优选在pH 5. 5-pH 6. 5下的人FcRn结合活性，特别优选在pH 5. 8-pH 6. O下的人FcRn结合活性，pH 5.8-pH 6. O与体内早期内体pH相当。同时，本文中，在中性pH范围内的人FcRn结合活性意指在pH 6. 7-pH 10. O下的人FcRn结合活性，优选在ρΗ7· Ο-pH 8. O下的人FcRn结合活性,特别优选在pH 7. 4下的人FcRn结合活性,pH 7. 4与体内血衆pH相当。本发明的抗原结合分子具有人FcRn结合结构域。人FcRn结合结构域不受特别限制，只要抗原结合分子在酸性和中性PH范围内具有人FcRn结合活性。或者，结构域可具有直接或间接的人FcRn结合活性。这类结构域包括例如IgG型免疫球蛋白、白蛋白、白蛋白结构域3、抗人FcRn抗体、抗人FcRn肽和抗人FcRn支架分子的Fe结构域,所有这些都具有与人FcRn直接结合的活性；以及与IgG或白蛋白结合的分子，其具有与人FcRn间接结合的活性。本发明的这类优选结 构域在酸性和中性PH范围内具有人FcRn结合活性。可在没有任何改变的情况下使用该结构域，只要它们在酸性和中性PH范围内已具有人FcRn结合活性。如果该结构域在酸性和/或中性pH范围内只有弱的人FcRn结合活性或没有人FcRn结合活性，则可通过改变抗原结合分子中的氨基酸使之具有人FcRn结合活性。然而，优选通过改变人FcRn结合结构域的氨基酸，使之在酸性和/或中性pH范围内具有人FcRn结合活性。或者，可改变在酸性和/或中性pH范围内已具有人FcRn结合活性的结构域中的氨基酸以提高人FcRn结合活性。可通过比较氨基酸改变前后的酸性和/或中性pH范围内的人FcRn结合活性，来选择人FcRn结合结构域中所需的氨基酸改变。优选的人FcRn结合结构域是与人FcRn直接结合的区域。这类优选的人FcRn结合区包括例如抗体Fe结构域。同时，能够与多肽例如白蛋白或IgG(其具有人FcRn结合活性)结合的区域，可通过白蛋白、IgG等与人FcRn间接结合。因此，本发明的这类人FcRn结合区可以是与具有人FcRn结合活性的多肽结合的区域。本发明的抗原结合分子不受特别限制，只要它们包括具有对靶抗原有特异性的结合活性的抗原结合结构域。这类优选的抗原结合结构域包含例如具有抗体的抗原结合区的结构域。抗体的抗原结合区包含例如CDR和可变区。当抗体的抗原结合区是CDR时，它可含有完整抗体的全部6个⑶R，或1、2或更多个⑶R。当含有⑶R作为抗体的结合区时，它们可包含氨基酸缺失、取代、添加和/或插入，或者可以是CDR的部分。另一方面，用于本发明方法的抗原结合分子包含具有拮抗活性的抗原结合分子(拮抗性抗原结合分子)、具有激动活性的抗原结合分子(激动性抗原结合分子)和具有细胞毒性的分子。在优选的实施方案中，抗原结合分子包含拮抗性抗原结合分子，特别是识别抗原(例如受体或细胞因子)的拮抗性抗原结合分子。在本发明中，目标抗原结合分子不受特别限制，可以是任何抗原结合分子。本发明的抗原结合分子优选包括抗原结合活性(抗原结合结构域)和人FcRn结合结构域两者。具体地讲，优选的本发明抗原结合分子包括与人FcRn结合的结构域。包括抗原结合结构域和人FcRn结合结构域两者的抗原结合分子包括例如抗体。在本发明的情况下优选的抗体包括例如IgG抗体。当要使用的抗体为IgG抗体时，IgG的类型不受限制；可以使用属于任何同种型(亚类)的IgG例如IgGU IgG2、IgG3或IgG4。此外，本发明的抗原结合分子可包括抗体恒定区，并可将氨基酸突变引入恒定区。待引入的氨基酸突变包括例如强化或消弱与Fe Y受体结合的氨基酸突变(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006年3月14日；103 (I I)4005-10)，但不限于这些实例。或者，还可通过选择合适的恒定区例如IgG2的恒定区，来改变PH依赖性结合。当本发明的目标抗原结合分子是抗体时，它可以是来源于任何动物的抗体，例如小鼠抗体、人抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体或骆驼抗体。此外，抗体可为经改变的抗体，例如嵌合抗体，并且特别是，在人源化抗体的序列中包括氨基酸取代的经改变抗体等。抗体还包括双特异性抗体、与多种分子连接的抗体修饰产物和包括抗体片段的多肽。“嵌合抗体”是通过将来源于不同动物的序列组合起来而制备的抗体。具体而言，嵌合抗体包括例如具有来自小鼠抗体重链和轻链可变(V)区及来自人抗体的重链和轻链恒定(C)区的抗体。“人源化抗体”，亦称为经改造的人抗体，是其中将来源于非人哺乳动物(例如小鼠)的抗体的互补决定区(CDR)植入人抗体的CDR中的抗体。用于鉴定CDR的方法是已知的(Kabat 等，Sequence of Proteinsof Immunological Interest (1987), NationalInstitute of Health, Bethesda, Md. ;Chothia 等，Nature (1989) 342 :877)。适于该目的的通用遗传重组技术也是已知的(参见欧洲专利申请EP 125023和WO 96/02576)。双特异性抗体是指在同一抗体分子中具有识别不同表位的可变区的抗体。双特异性抗体可以是识别两个或更多个不同抗原的抗体，或识别相同抗原上的两个或更多个不同表位的抗体。·
此外，包括抗体片段的多肽包括例如Fab片段、F (ab ' ) 2片段、scFvs (NatBiotechnol. 2005 年 9 月；23(9) 1126-36),结构域抗体(dAbs) (W02004/05882U WO2003/002609)、scFv_Fc (W0 2005/037989)、dAb_Fc 和 Fe 融合蛋白。当分子包括 Fe 结构域时，Fe结构域可用作人FcRn结合结构域。或者，可将FcRn结合结构域与这些分子融合。此外，适于本发明的抗原结合分子可为抗体样分子。抗体样分子(支架分子、肽分子)是可通过与祀分子结合而显示出功能的分子(Current Opinion inBiotechnology(2006) 17 653-658 ；Current Opinionin Biotechnology(2007) 18 :1-10 ;Current Opinion in Structural Biology(1997) 7 463-469 ；Protein Science(2006) 15 14-27)，包括例如 DARPins (WO 2002/020565)、亲和体(Affibody) (TO 1995/001937)、Avimer(W02004/044011 ；W0 2005/040229)和 Adnectin (W0 2002/032925)。如果这些抗体样分子可以PH依赖性方式与靶分子结合和/或在中性pH范围内具有人FcRn结合活性，则可通过抗原结合分子促进细胞对抗原摄入，通过给予抗原结合分子促进血浆抗原浓度降低，并改进抗原结合分子的药代动力学，提高单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目。此外，抗原结合分子可以是由人FcRn结合结构域和与靶标结合的受体蛋白(包括配体)之间融合而产生的蛋白质，包括例如TNFR-Fc融合蛋白、ILlR-Fc融合蛋白、VEGFR-Fc 融合蛋白和 CTLA4-Fc 融合蛋白(Nat Med. 2003 年 I 月；9(1) :47_52 ；BioDrugs.(2006)20(3) : 151-60)。如果这些受体-人FcRn结合结构域融合蛋白以pH依赖性方式与靶分子(包括配体)结合和/或在中性PH范围内具有人FcRn结合活性，则可通过抗原结合分子促进细胞对抗原摄入，通过给予抗原结合分子促进血浆抗原浓度降低，并改进抗原结合分子的药代动力学，和增加单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目。受体蛋白经适当设计和修饰，使得包括与靶标(包括配体)结合的受体蛋白的结构域。如上文中提及的包括TNFR-Fc融合蛋白、ILlR-Fc融合蛋白、VEGFR-Fc融合蛋白和CTLA4_Fc融合蛋白的实例，本发明中优选使用这样的可溶性受体分子，其包含与所述靶标(包括配体)结合所需要的所述受体蛋白的胞外结构域。这些经设计和修饰的受体分子在本发明中称为人工受体。设计和修饰受体分子以构建人工受体分子所采用的方法是本领域已知的。此外，抗原结合分子可为融合蛋白，其中使与靶标结合并具有中和作用的人工配体蛋白与人FcRn结合结构域融合，且人工配体蛋白包括例如突变型IL-6(EMB0 J. 1994年12月15日；13(24) :5863-70)。如果这类人工配体融合蛋白可以pH依赖性方式与靶分子结合和/或在中性pH范围内具有人FcRn结合活性,则可通过抗原结合分子促进细胞对抗原摄入，通过给予抗原结合分子促进血浆抗原浓度降低，并改进抗原结合分子的药代动力学，和增加单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目。此外，本发明的抗体可包括修饰糖链。具有修饰糖链的抗体包括例如具有修饰的糖基化的抗体(W0 99/54342)、缺乏加至糖链的岩藻糖的抗体(W0 00/61739、WO02/31140、WO 2006/067847、W02006/067913)和具有带二等分 GlcNAc 的糖链的抗体(W002/79255)。本领域技术人员可适当选择除pH以外用于抗原结合或人FcRn结合活性的测定所使用的条件，所述条件不受特别限制。例如，按WO 2009/125825中所述采用MES缓冲 液在37°C下的条件，可用来测定活性。在另一个实施方案中，可采用实施例4或5中所述在25°C下的磷酸钠缓冲液来测定活性。同时，可通过本领域技术人员已知方法，例如采用Biacore (GE Healthcare)等,来测定抗原结合分子的抗原结合活性和人FcRn结合活性。如果抗原是可溶性抗原，可通过将抗原作为分析物加至固定有抗原结合分子的芯片上，来测定抗原结合分子与可溶性抗原结合的活性。或者，如果抗原是膜型抗原，则可通过将抗原结合分子作为分析物加至抗原固定化芯片上，来测定抗原结合分子与膜型抗原结合的活性。可通过分别将人FcRn或抗原结合分子作为分析物加至固定有抗原结合分子或人FcRn的芯片上，来测定抗原结合分子的人FcRn结合活性。在本发明中，在酸性pH范围内抗原结合活性与在中性pH范围内抗原结合活性之间的比率不受特别限制，只要在酸性PH范围内的抗原结合活性低于在中性pH范围内的抗原结合活性。然而，KD(pH5.8)/KD(pH 7. 4)的值，其是抗原在pH 5. 8和pH 7. 4下的解离常数(KD)的比率，优选为2或更大，更优选10或更大，还更优选40或更大。KD(pH 5.8)/KD (pH 7. 4)值的上限不受特别限制，可以是任何值，例如400、1，000或10，000，只要可采用本领域技术人员已知技术生产。如果抗原是可溶性抗原，抗原结合活性的值可用解离常数(KD)表示。另一方面，如果抗原是膜型抗原，则活性可用表观解离常数(表观KD)表示。可通过本领域技术人员已知方法，采用例如Biacore (GEHealthcare)、Scatchard曲线、流式细胞仪等,测定解离常数(KD)和表观解离常数(表观KD)。 在本发明中，表示在酸性和中性pH范围之间的抗原结合活性的比率的其它参数包括例如解离速率常数kd。如果使用解离速率常数(kd)而非解离常数(KD)作为代表结合活性比率的参数，则kd(在酸性pH范围内)/kd(在中性pH范围内)的值(其是抗原在酸性pH范围内和中性pH范围的kd(解离速率常数)的比率)，优选为2或更大、更优选5或更大、甚至更优选10或更大、还更优选30或更大。kd(在酸性pH范围内)/kd(在中性pH范围内)值的上限不受特别限制，可以是任何值，例如50、100或200，只要可采用本领域技术人员已知技术生产。如果抗原是可溶性抗原，则抗原结合活性的值可使用解离速率常数(kd)表示。或者，如果抗原是膜型抗原，则C值可用表观kd(表观解离速率常数)表示。可通过本领域技术人员已知方法，例如采用Biacore (GE Healthcare)、流式细胞仪等,来测定解离速率常数(kd)和表观解离速率常数(表观kd)。在本发明中，当在不同pH下测定抗原结合分子的抗原结合活性时，优选pH以外的测量条件是不变的。用于降低(减弱)抗原结合分子在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性PH范围内的抗原结合活性的方法(用于赋予pH依赖性结合能力的方法)不受特别限制，可通过任何方法实现。具体而言，如WO 2009/125825中所述,该方法包括例如通过用组氨酸取代抗原结合分子中的氨基酸或将组氨酸插入抗原结合分子中，以降低(减弱)在酸性PH范围内抗原结合活性至小于在中性pH范围内的抗原结合活性的方法。已知可通过用组氨酸取代抗体中的氨基酸赋予抗体PH依赖性抗原结合活性(FEBS Letter (1992) 309 (I)85-88)。这类组氨酸突变(取代)或插入位点不受特别限制；可用组氨酸取代任何位点上的氨基酸或插入任何位点。组氨酸突变(取代)或插入的优选位点包括例如其中突变或插入对抗原结合分子的抗原结合活性有影响的区域。这类区域包括这样的位点，其中与突变或插入之前相比，突变或插入降低(减弱)在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性·pH范围内的抗原结合活性(KD (在酸性pH范围内)/KD (在中性pH范围内)值增加)。如果抗原结合分子是抗体，则这类区域包括例如抗体可变区和⑶R。待引入(实现)的组氨酸突变或插入的数目可由本领域技术人员适当地确定。组氨酸取代可在唯一的单一位点或者在两个或更多个位点引入。或者，组氨酸可在唯一的单一位点或者在两个或更多个位点插入。此外，除组氨酸突变以外，可引入组氨酸突变以外的突变(具有非组氨酸的氨基酸的突变(缺失、添加、插入和/或取代))。或者，组氨酸突变可与组氨酸插入联合。可通过随机方法实现这类组氨酸取代或插入，例如组氨酸扫描，其通过使用组氨酸而非本领域技术人员已知的丙氨酸扫描中的丙氨酸来进行。然后，可从用随机组氨酸突变或插入而引入的抗原结合分子文库中，选择具有比引入突变之前大的KD (在酸性pH范围内)/KD (在中性pH范围内)值的抗原结合分子。如果用组氨酸取代抗原结合分子中的氨基酸或将组氨酸插入抗原结合分子中，则在组氨酸取代或插入后在中性PH范围内抗原结合分子的抗原结合活性优选等于在组氨酸取代或插入前在中性PH范围内抗原结合分子的抗原结合活性，但对此没有特别限制。在本文中，“在组氨酸取代或插入后在中性pH范围内抗原结合分子的抗原结合活性等于在组氨酸取代或插入前在中性pH范围内抗原结合分子的抗原结合活性”意指在组氨酸取代或插入后抗原结合分子保持在组氨酸取代或插入前抗原结合分子的抗原结合活性的10%或更大、优选50%或更大、更优选80%或更大、还更优选90%或更大。如果抗原结合分子的抗原结合活性由于组氨酸取代或插入而降低，则可通过使抗原结合分子的一个或更多个氨基酸被取代、缺失、将一个或更多个氨基酸添加和/或插入至抗原结合分子来调整抗原结合活性，使得抗原结合活性变得等于在组氨酸取代或插入前的抗原结合活性。本发明还包含这类抗原结合分子，其结合活性因在组氨酸取代或插入后使抗原结合分子的一个或更多个氨基酸被取代、缺失、将一个或更多个氨基酸添加和/或插入至抗原结合分子而使之相等。用于降低(减弱)抗原结合分子在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性PH范围内的抗原结合活性的其它方法包括用非天然氨基酸取代抗原结合分子中的氨基酸或将非天然氨基酸插入抗原结合分子的方法。已知可通过使用非天然氨基酸，来人工调节pKa(Angew. Chem. Int. Ed. 2005,44,34 ；Chem Soc Rev. 2004 年 9 月 10 日，33 (7) 422-30 ；Amino Acids. (1999) 16(3-4) :345_79)。因此，在本发明中，可使用非天然氨基酸代替上述的组氨酸。引入非天然氨基酸的位点不受特别限制，可在任何位点进行非天然氨基酸的取代或插入。非天然氨基酸取代或插入的优选位点包括例如其中取代或插入对抗原结合分子的抗原结合活性产生影响的区域。例如，如果抗原结合分子是抗体，则这类区域包括抗体可变区和互补决定区(CDR)。同时，待引入的非天然氨基酸的数目不受特别限制；可在唯一的单一位点或者两个或更多个位点上用非天然氨基酸取代。或者，可将非天然氨基酸插入唯一的单一位点或者两个或更多个位点。此外，除了非天然氨基酸的取代或插入以外，可缺失、添加、插入和/或取代其它氨基酸。此外，可与上述组氨酸取代和/或插入组合进行非天然氨基酸的取代和/或插入。在本发明中可使用任何非天然的氨基酸。可使用本领域技术人员已知的非天然氨基酸。在本发明中，如果抗原结合分子是抗体，则组氨酸或非天然氨基酸取代的可能位点包括例如⑶R序列和负责抗体的⑶R结构的序列，包括例如WO 2009/125825中所述位点。按照 Kabat 编号标注氨基酸位置(Kabat EA 等(1991) Sequences of Proteins ofImmunologicalInterest, NIH)。 当提及可变结构域的残基时(大致轻链的残基1-107和重链的残基1-113)，一般使用 Kabat 编号系统(例如 Kabat 等，Sequences of Immunological Interest.第 5版.Public Health Service,National Institutesof Health,Bethesda,Md. (1991))。当提及免疫球蛋白重链恒定区的残基时，一般使用“EU编号系统”或“EU指数”(例如Kabat等人报道的EU指数，同上)。“按照Kabat的EU指数”是指人IgGl EU抗体的残基编号。除非本文中另有说明，否则提及抗体可变结构域的残基编号意指通过Kabat编号系统的残基编号。除非本文中另有说明，否则提及抗体恒定结构域的残基编号意指通过EU编号系统的残基编号(参见例如WO 2006073941)。重链H27、H31、H32、H33、H35、H50、H58、H59、H61、H62、H63、H64、H65、H99、HlOOb和 H102轻链L24、L27、L28、L32、L53、L54、L56、L90、L92和 L94这些改变位点中，H32、H61、L53、L90和L94被假定为是最通用的改变位点。如果抗原是IL-6受体(例如人IL-6受体),优选的改变位点包括下列位点。然而，改变位点在此不受特别限制。重链:H27、H31、H32、H35、H50、H58、H61、H62、H63、H64、H65、HlOOb和 H102轻链L24、L27、L28、L32、L53、L56、L90、L92和 L94具体而言，组氨酸或非天然氨基酸取代位点的优选组合包括例如H27、H31和H35的组合；H27、H31、H32、H35、H58、H62 和 H102 的组合；L32 和 L53 的组合；及 L28、L32 和 L53的组合。此外，重链和轻链中取代位点的优选组合包括例如H27、H3UL32和L53的组合。这些位点中，组氨酸或非天然氨基酸在唯一的单一位点或更多个位点被取代。同时，当抗原结合分子是具有抗体恒定区的物质时，用于降低(减弱)抗原结合分子在酸性PH范围内的抗原结合活性至小于在中性pH范围内的抗原结合活性的方法包括例如用于改变抗体恒定区中的氨基酸的方法。具体而言，这类方法包括例如用于取代WO2009/125825中所述恒定区(SEQ ID NO :11、12、13和14)的方法。同时，用于改变抗体恒定区的方法包括例如用于评价各种恒定区同种型(IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)和选择降低在酸性pH范围内的抗原结合活性(提高在酸性pH范围内的解离速率)的同种型的方法。这类方法还包括用于降低在酸性pH范围内的抗原结合活性(提高在酸性pH范围内的解离速率)的方法，这通过将氨基酸取代引入野生型同种型的氨基酸序列(野生型IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的氨基酸序列)来进行。抗体恒定区中的铰链区序列在同种型(IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)之间颇为不同，并且铰链区氨基酸序列的差异对抗原结合活性有极大影响。因此，可根据抗原或表位的类型，选择合适的同种型以降低在酸性PH范围内的抗原结合活性(提高在酸性PH范围内的解离速率)。此外，由于铰链区氨基酸序列的差异对抗原结合活性有极大影响，因此认为野生型同种型氨基酸序列中优选的氨基酸取代位点在铰链区内。当通过上述方法等降低(减弱)抗原结合分子在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性PH范围内的抗原结合活性(当KD (在酸性pH范围内)/KD (在中性pH范围内)的值增加时)时，通常优选与原始抗体相比，KD (在酸性pH范围内)/KD (在中性pH范围内)值为两倍或更多倍、优选为5倍或更多倍、更优选10倍或更多倍，但在此不受特别限制。可采用上述方法，产生这样的抗原结合分子，其在酸性pH范围内的抗原结合活性通过不具有这类性质的抗原结合分子的氨基酸取代或插入，被降低(减弱)至小于在中性PH范围内的抗原结合活性(以pH依赖性方式结合的抗原结合分子)。其它方法包括用于直接获得具有上述性质的抗原结合分子的方法。例如，可采用PH依赖性抗原结合作为通过用抗原免疫动物(小鼠、大鼠、仓鼠、兔、人免疫球蛋白转基因小鼠、人免疫球蛋白转基因大鼠、人免疫球蛋白转基因兔、美洲驼(llamas)、骆驼等)所获得的抗体的指示物，通过筛选来选出具有所需目标性质的抗体。抗体可通过杂交瘤技术或B细胞克隆技术产生(ProcNatl Acad Sci USA. 1996 年 7 月 23 日；93(15) :7843_8 ；J ImmunolMethods. 2006 年 10月 20 日；316(1-2) 133-43 ；Journal of the Associationfor Laboratory Automation ；WO 2004/106377、WO 2008/045140和W02009/113742)，其是本领域技术人员已知的方法，但不限于这些。或者，可使用PH依赖性抗原结合作为体外提供抗原结合结构域的文库的指示物，通过筛选直接选出具有目标性质的抗体。这类文库包括人幼稚文库、非人动物和人的免疫文库、半合成文库和合成文库，这些是本领域的技术人员已知的文库(MethodsMol Biol. 2002 ；178 87-100 ；J Immunol Methods. 2004 年 6 月；289(1_2) :65_80 ；以及ExpertOpin Biol Ther. 2007年5月；7(5) :763_79)，但不限于这些。然而，方法并非特别限于这些实例。本发明利用pH差异作为在血浆和内体间的环境差异，以实现在血浆和内体中抗原结合分子对抗原的差异结合亲和力(在血浆中强结合而在内体中弱结合)。因为血浆和内体间的环境差异不限于PH的差异，因此可利用其浓度在血浆和内体内不同的其它因素，替代对抗原结合分子与抗原结合的PH依赖性结合性质。这类因素也可用于产生在血浆与抗原结合但在内体解离出抗原的抗体。因此，本发明还包括包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其在酸性和中性pH范围内具有人FcRn结合活性，且在内体中的抗原结合活性比在血浆中的低，其中在血浆中人FcRn结合活性强于完整人IgG的FcRn结合活性。用于提高在中性pH范围内本发明的抗原结合分子的人FcRn结合结构域的人FcRn结合活性的方法不受特别限制，可通过任何方法提高。具体而言，当IgG型免疫球蛋白的Fe结构域用作人FcRn结合结构域时，可通过改变其氨基酸来提高在中性pH范围内的人FcRn结合活性。这类待改变的优选IgG型免疫球蛋白的Fe结构域包括例如亲本人IgG(IgGl、IgG2、IgG3或IgG4及其经工程改造的变体)的Fe结构域。可将任何位点的氨基酸变成其它氨基酸，只要赋予或提高在中性PH范围内的人FcRn结合活性。当抗原结合分子具有人IgGl Fe结构域作为人FcRn结合结构域时,优选与亲本人IgGl的相比,所述分子具有加强在中性pH范围内与人FcRn结合的改变。可实现这类改变的氨基酸包括例如以下位置的氨基酸221-225、227、228、230、232、233-241、243-252、254-260、262-272、274、276、278-289、291-312、315-320、324、325、327-339、341、343、345、360、362、370、375-378、380、382、385-387、389、396、414、416、423、424、426-438、440 和 442 (EU 编号)。更具体地讲，这类氨基酸改变包括例如列于表I的那些。可通过使用上述改变，提高在中性PH范围内IgG型免疫球蛋白的Fe结构域的人FcRn结合。此外，与亲本人IgG相比，可加强在酸性pH范围内与人FcRn结合的改变如表2中的实例所示。当从上述改变中选出还可加强在中性PH范围内与人FcRn结合的适当改变时， 它们可适用于本发明。同时，可加强在酸性条件下Fv4-IgGl与人FcRn结合的改变的组合见表6-1和表6-2。亲本人IgG Fe结构域中待改变的特别优选的氨基酸包括例如以下位置的氨基酸237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434和436 (EU编号)。可通过用不同氨基酸取代选自上述氨基酸的至少一个氨基酸，来提高中性pH范围内抗原结合分子的人FcRn结合活性。特别优选的改变包括例如亲本IgG Fe结构域中237位上的Gly被取代为Met的氨基酸取代；238位上的Pro被取代为Ala的氨基酸取代；239位上的Ser被取代为Lys的氨基酸取代；248位上的Lys被取代为Ile的氨基酸取代；250 位上的 Thr 被取代为 Ala、Phe> lie、Met、Gin、Ser> Val、Trp 或 Tyr 的氨基酸取代；252位上的Met被取代为Phe、Trp或Tyr的氨基酸取代；254位上的Ser被取代为Thr的氨基酸取代；255位上的Arg被取代为Glu的氨基酸取代；256位上的Thr被取代为Asp、Glu或Gln的氨基酸取代；257 位上的 Pro 被取代为 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser> Thr 或 Val 的氨基酸取代；258位上的Glu被取代为His的氨基酸取代；265位上的Asp被取代为Ala的氨基酸取代；270上的Asp被取代为Phe的氨基酸取代；286位上的Asn被取代为Ala或Glu的氨基酸取代；289位上的Thr被取代为His的氨基酸取代；297位上的Asn被取代为Ala的氨基酸取代；298上的Ser被取代为Gly的氨基酸取代；
303位上的Val被取代为Ala的氨基酸取代；305位上的Val被取代为Ala的氨基酸取代；307 位上的 Thr 被取代为 Ala、Asp、Phe> Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Val、Trp 或 Tyr 的氨基酸取代；
308 位上的 Val 被取代为 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gln 或 Thr 的氨基酸取代；309位上的Leu或Val被取代为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg的氨基酸取代；311位上的Gln被取代为Ala、His或Ile的氨基酸取代；312位上的Asp被取代为Ala或His的氨基酸取代；314位上的Leu被取代为Lys或Arg的氨基酸取代；315位上的Asn被取代为Ala或His的氨基酸取代；317位上的Lys被取代为Ala的氨基酸取代；325位上的Asn被取代为Gly的氨基酸取代；332位上的Ile被取代为Val的氨基酸取代；334位上的Lys被取代为Leu的氨基酸取代；360位上的Lys被取代为His的氨基酸取代；376位上的Asp被取代为Ala的氨基酸取代；380位上的Glu被取代为Ala的氨基酸取代；382位上的Glu被取代为Ala的氨基酸取代；384位上的Asn或Ser被取代为Ala的氨基酸取代；385位上的Gly被取代为Asp或His的氨基酸取代；386位上的Gln被取代为Pro的氨基酸取代；387位上的Pro被取代为Glu的氨基酸取代；389位的Asn被取代为Ala或Ser的氨基酸取代；424位上的Ser被取代为Ala的氨基酸取代；428 位上的 Met 被取代为 Ala、Asp、Phe> Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr的氨基酸取代；433位上的His被取代为Lys的氨基酸取代；434位上的Asn被取代为Ala、Phe、His、Ser, Trp或Tyr的氨基酸取代；和436位上的Tyr或Phe被取代为His的氨基酸取代(EU编号)。同时，待改变的氨基酸的数目不受特别限制；可在唯一的单一位点上或者在两个或更多个位点上改变氨基酸。两个或更多个氨基酸改变的组合包括例如表3所列的那些。同时，与亲本人IgG相比，可加强在酸性pH范围内与人FcRn结合的改变的组合见表4-1至4_5。当也可加强在中性PH范围内与人FcRn结合的改变的合适组合选自上述改变时，它们可适用于本发明。此外，可加强在中性条件下Fv4-IgGl与人FcRn结合的改变的组合见表6_1和6_2。表中的符号表不在按EU编号所不的编号之后插入氨基酸。例如，'281S意指将S插入按EU编号的281位与282位之间。[表 I]位置I氨基酸改变
256P
280K
339T
385H
428L
434W，Y，F，A，H[表 2]·
权利要求
1.包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其在中性pH范围内具有人FcRn结合活性，其中在中性pH范围内的人FcRn结合活性强于KD 3. 2微摩尔。
2.包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其在中性pH范围内具有人FcRn结合活性，其中在中性pH范围内的人FcRn结合活性是完整人IgG的人FcRn结合活性的28倍。
3.包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其在中性pH范围内具有人FcRn结合活性，其中在中性pH范围内的人FcRn结合活性强于KD 2. 3微摩尔。
4.包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其在中性pH范围内具有人FcRn结合活性，其中在中性pH范围内的人FcRn结合活性是完整人IgG的人FcRn结合活性的38倍。
5.权利要求1-4中任一项的抗原结合分子，其中所述中性pH范围为pH7. 0-8. O。
6.包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其中将抗原结合分子给予非人动物后的血浆总抗原浓度低于将参比抗原结合分子给予非人动物后的血浆总抗原浓度，所述参比抗原结合分子包含相同的抗原结合结构域和完整人IgG Fe结构域作为人FcRn结合结构域。
7.抗原结合分子，其中将所述抗原结合分子给予非人动物后的血浆抗原浓度低于自未被给予抗原结合分子的非人动物所得到的血浆总抗原浓度。
8.包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其中如下计算的所述抗原结合分子的抗原/抗原结合分子摩尔比率(C)C=A/B， 低于如下计算的包含相同抗原结合结构域和完整人IgG Fe结构域作为人FcRn结合结构域的参比抗原结合分子的抗原/抗原结合分子摩尔比率(C’)；C，=A' /B，， 其中； A为将抗原结合分子给予非人动物后血浆中的总抗原浓度， B为将抗原结合分子给予非人动物后抗原结合分子的血浆浓度， A’为将参比抗原结合分子给予非人动物后血浆中的总抗原浓度， B’为将参比抗原结合分子给予非人动物后抗原结合分子的血浆浓度。
9.权利要求6-8中任一项的抗原结合分子，其中所述非人动物是人FcRn转基因小鼠。
10.权利要求6-9中任一项的抗原结合分子，其中所述血浆抗原浓度是长期血浆总抗原浓度。
11.权利要求6-9中任一项的抗原结合分子，其中所述血浆抗原浓度是短期血浆总抗原浓度。
12.包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域的抗原结合分子，其在酸性和中性pH范围内具有人FcRn结合活性，且具有在酸性pH范围内比在中性pH范围内低的抗原结合活性，其中在中性PH范围内的人FcRn结合活性强于完整人IgG的人FcRn结合活性。
13.权利要求1-11中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域在酸性pH范围内的抗原结合活性低于在中性PH范围内的抗原结合活性。
14.权利要求12或13的抗原结合分子，其中在酸性pH范围内与在中性pH范围内的抗原结合活性的比率以KD (在酸性pH范围内)/KD (在中性pH范围内)值计至少为2。
15.权利要求12-14中任一项的抗原结合分子，其包含抗原结合结构域的氨基酸突变，所述突变包含用组氨酸取代抗原结合结构域的至少一个氨基酸或插入至少一个组氨酸。
16.权利要求12-14中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域获自抗原结合结构域文库。
17.权利要求1-16中任一项的抗原结合分子，其包含因用不同氨基酸取代亲本IgG的Fe结构域中的至少一个氨基酸而产生的Fe结构域作为人FcRn结合结构域。
18.权利要求1-17中任一项的抗原结合分子，其中所述人FcRn结合结构域是这样的人FcRn结合结构域，其包含用不同氨基酸取代选自亲本IgG的Fe结构域中的以下位置氨基酸中的至少一个氨基酸的氨基酸序列237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434 和 436 (EU 编号)。
19.权利要求1-18中任一项的抗原结合分子，其包含在亲本IgG的Fe结构域中包含氨基酸取代的人FcRn结合结构域，其包含选自以下按EU编号的至少一个氨基酸取代 · 237位上的Gly被取代为Met的氨基酸取代； · 238位上的Pro被取代为Ala的氨基酸取代； · 239位上的Ser被取代为Lys的氨基酸取代； · 248位上的Lys被取代为Ile的氨基酸取代； · 250位上的Thr被取代为Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp或Tyr的氨基酸取代； · 252位上的Met被取代为Phe、Trp或Tyr的氨基酸取代； · 254位上的Ser被取代为Thr的氨基酸取代； · 255位上的Arg被取代为Glu的氨基酸取代； · 256位上的Thr被取代为Asp、Glu或Gln的氨基酸取代； · 257位上的Pro被取代为Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser、Thr或Val的氨基酸取代； · 258位上的Glu被取代为His的氨基酸取代； ·265位上的Asp被取代为Ala的氨基酸取代； · 270上的Asp被取代为Phe的氨基酸取代； ·286位上的Asn被取代为Ala或Glu的氨基酸取代； ·289位上的Thr被取代为His的氨基酸取代； ·297位上的Asn被取代为Ala的氨基酸取代； · 298上的Ser被取代为Gly的氨基酸取代； ·303位上的Val被取代为Ala的氨基酸取代； · 305位上的Val被取代为Ala的氨基酸取代； · 307 位上的 Thr 被取代为 Ala、Asp、Phe> Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、A·rg、Ser、Val、Trp或Tyr的氨基酸取代； · 308位上的Val被取代为Ala、Phe> lie、Leu、Met、Pro、Gln或Thr的氨基酸取代； ·309位上的Leu或Val被取代为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg的氨基酸取代； · 311位上的Gln被取代为Ala、His或Ile的氨基酸取代； · 312位上的Asp被取代为Ala或His的氨基酸取代；.314位上的Leu被取代为Lys或Arg的氨基酸取代； .315位上的Asn被取代为Ala或His的氨基酸取代； .317位上的Lys被取代为Ala的氨基酸取代； .325位上的Asn被取代为Gly的氨基酸取代； .332位上的Ile被取代为Val的氨基酸取代； .334位上的Lys被取代为Leu的氨基酸取代； .360位上的Lys被取代为His的氨基酸取代； .376位上的Asp被取代为Ala的氨基酸取代； .380位上的Glu被取代为Ala的氨基酸取代； .382位上的Glu被取代为Ala的氨基酸取代； .384位上的Asn或Ser被取代为Ala的氨基酸取代； .385位上的Gly被取代为Asp或His的氨基酸取代； .386位上的Gln被取代为Pro的氨基酸取代； .387位上的Ρι·ο被取代为Glu的氨基酸取代； .389位的Asn被取代为Ala或Ser的氨基酸取代； .424位上的Ser被取代为Ala的氨基酸取代； .428 位上的 Met 被取代为 Ala、Asp、Phe> Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser>Thr、Val、Trp或Tyr的氨基酸取代； .433位上的His被取代为Lys的氨基酸取代； .434位上的Asn被取代为Ala、Phe> His、Ser、Trp或Tyr的氨基酸取代； 和436位上的Tyr或Phe被取代为His的氨基酸取代。
20.权利要求1-18中任一项的抗原结合分子,其人FcRn结合结构域包含选自亲本IgG的Fe结构域中的以下至少一个氨基酸 氨基酸位置237上的Met ； 氨基酸位置238上的Ala ； 氨基酸位置239上的Lys ； 氨基酸位置248上的Ile ; 氨基酸位置 250 上的 Ala、Phe> lie、Met、Gin、Ser、Val> Trp 或 Tyr ； 氨基酸位置252上的Phe、Trp或Tyr ； 氨基酸位置254上的Thr ； 氨基酸位置255上的Glu ； 氨基酸位置256上的Asp、Glu或Gln ； 氨基酸位置 257 上的 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser> Thr 或 Val ； 氨基酸位置258上的His ; 氨基酸位置265上的Ala; 氨基酸位置270上的Phe ； 氨基酸位置286上的Ala或Glu ； 氨基酸位置289上的His ; 氨基酸位置297上的Ala;氨基酸位置298上的Gly ； 氨基酸位置303上的Ala; 氨基酸位置305上的Ala; 氨基酸位置 307 上的 Ala、Asp、Phe> Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Val、Trp 或 Tyr ； 氨基酸位置 308 上的 Ala、Phe> lie、Leu、Met、Pro、Gln 或 Thr ； 氨基酸位置309上的Ala、Asp、Glu、Pro或Arg ； 氨基酸位置311上的Ala、His或lie ； 氨基酸位置312上的Ala或His ； 氨基酸位置314上的Lys或Arg ； 氨基酸位置315上的Ala或His ； 氨基酸位置317上的Ala ； 氨基酸位置325上的Gly ； 氨基酸位置332上的Val ； 氨基酸位置334上的Leu ； 氨基酸位置360上的His ； 氨基酸位置376上的Ala ； 氨基酸位置380上的Ala ； 氨基酸位置382上的Ala ； 氨基酸位置384上的Ala ； 氨基酸位置385上的Asp或His ; 氨基酸位置386上的Pro ； 氨基酸位置387上的Glu ； 氨基酸位置389上的Ala或Ser ； 氨基酸位置424上的Ala; 氨基酸位置 428 上的 Ala、Asp、Phe> Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser> Thr>Val、Trp 或 Tyr ； 氨基酸位置433位置上的Lys ； 氨基酸位置 434 上的 Ala、Phe> His、Ser、Trp 或 Tyr ； 和氨基酸位置436上的His (EU编号)。
21.权利要求18-20中任一项的抗原结合分子，其中亲本IgG选自获自非人动物的IgG0
22.权利要求18-20中任一项的抗原结合分子，其中亲本IgG是人IgG。
23.权利要求1-22中任一项的抗原结合分子，其具有拮抗活性。
24.权利要求1-23中任一项的抗原结合分子，其与膜抗原或可溶性抗原结合。
25.权利要求1-24中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域包含与受体结合的人工配体。
26.权利要求1-24中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合结构域包含与配体结合的人工受体。
27.权利要求1-24中任一项的抗原结合分子，其是抗体。
28.权利要求27的抗原结合分子，其中所述抗体选自嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
29.药物组合物，其包含权利要求1-28中任一项的抗原结合分子。
30.用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性而促进抗原结合分子介导的细胞对抗原摄入的方法，其中所述抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性。
31.用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性且降低其在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性pH范围内的抗原结合活性而促进抗原结合分子介导的细胞对抗原摄入的方法，其中所述抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性。
32.用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性而增加单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目的方法，其中所述抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性。
33.用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性且降低其在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性pH范围内的抗原结合活性而增加单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目的方法，其中所述抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性。
34.用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性而提高抗原结合分子从血浆中消除抗原的能力的方法，其中所述抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性。
35.用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性并降低其在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性pH范围内的抗原结合活性而提高抗原结合分子从血浆中消除抗原的能力的方法，其中所述抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性。
36.用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性而改进抗原结合分子的药代动力学的方法，其中所述抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性。
37.用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性并降低其在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性PH范围内的抗原结合活性而改进抗原结合分子的药代动力学的方法，其中所述抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性。
38.用于促进抗原结合分子与在细胞外与抗原结合分子结合的抗原胞内解离的方法，这通过提高其在中性PH范围内的人FcRn结合活性并降低其在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性PH范围内的抗原结合活性来进行，其中所述抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性。
39.用于促进以抗原结合的形式摄入细胞的抗原结合分子以无抗原形式胞外释放的方法，这通过提高其在中性PH范围内的人FcRn结合活性且降低其在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性PH范围内的抗原结合活性来进行，其中所述抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性。
40.用于通过提高其在中性pH范围内的人FcRn结合活性而降低血浆中总血浆抗原浓度或游离血浆抗原浓度的方法，其中所述抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性。
41.用于降低血浆中总血浆抗原浓度或游离血浆抗原浓度的方法，这通过提高其在中性PH范围内的人FcRn结合活性且降低其在酸性pH范围内的抗原结合活性至小于在中性PH范围内的抗原结合活性来进行，其中所述抗原结合分子包含抗原结合结构域和人FcRn结合结构域，并在酸性PH范围内具有人FcRn结合活性。
42.权利要求30-41中任一项的方法，其中所述酸性pH范围为pH5. 5-6. 5，所述中性pH 范围为 pH 7. 0-8. O。
43.权利要求30-41中任一项的方法，其中所述在中性pH范围内人FcRn结合活性的提高是通过用不同氨基酸取代人FcRn结合结构域的亲本IgG Fe结构域中的至少一个氨基酸而引起的增加。
44.权利要求30-41中任一项的方法，其中所述在中性pH范围内人FcRn结合活性的提高是通过用不同氨基酸取代选自人FcRn结合结构域的亲本IgG Fe结构域中的以下位置氨基酸中的至少一个氨基酸而引起的增加237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434 和 436 (EU 编号)。
45.权利要求31、33、35、37-39和41中任一项的方法，其中通过用组氨酸取代抗原结合分子的至少一个氨基酸或插入至少一个组氨酸降低在酸性pH范围内抗原结合分子的抗原结合活性至低于在中性PH范围内的抗原结合活性。
46.权利要求31、33、35、37-39和41中任一项的方法，其中所述抗原结合结构域获自抗原结合结构域文库。
47.权利要求31、33、35、37-39和41中任一项的方法，其中所述抗原结合活性的降低用KD (在酸性pH范围内)/KD (在中性pH范围内)值的增加来表示，所述值是相对于组氨酸取代或插入之前酸性PH范围和中性pH范围内的抗原结合活性的比率。
48.用于产生抗原结合分子的方法，所述方法包括以下步骤 (a)选择通过改变抗原结合分子的人FcRn结合结构域中的至少一个氨基酸获得的具有在中性PH范围内强于3. 2微摩尔的人FcRn结合活性的抗原结合分子； (b)得到编码抗原结合分子的基因，其中在(a)中制备的人FcRn结合结构域与抗原结合结构域连接；和 (C)使用(b)中制备的基因产生抗原结合分子。
49.用于产生抗原结合分子的方法，所述方法包括以下步骤 (a)选择与在改变在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子的人FcRn结合结构域中的至少一个氨基酸之前相比，在中性pH范围内具有较强的人FcRn结合活性的抗原结合分子； (b)改变抗原结合分子的抗原结合结构域中的至少一个氨基酸，并选择与在酸性pH范围内相比在中性PH范围内具有较强抗原结合活性的抗原结合分子； (c)获得编码抗原结合分子的基因，其中在(a)和(b)中制备的人FcRn结合结构域与抗原结合结构域连接；和(d)使用在(C)中制备的基因产生抗原结合分子。
50.用于产生抗原结合分子的方法，所述方法包括以下步骤 (a)选择与在改变在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子的人FcRn结合结构域中的至少一个氨基酸之前相比，在中性pH范围内具有较强的人FcRn结合活性的抗原结合分子； (b)选择与在酸性pH范围内相比在中性pH范围内具有较强抗原结合活性的抗原结合分子; (c)获得编码抗原结合分子的基因，其中在(a)和(b)中制备的人FcRn结合结构域与抗原结合结构域连接；和 (d)使用在(C)中制备的基因产生抗原结合分子。
51.通过权利要求48-50中任一项的生产方法产生的抗原结合分子。
52.用于筛选抗原结合分子的方法，所述方法包括以下步骤 (a)选择通过改变抗原结合分子的人FcRn结合结构域中的至少一个氨基酸获得的具有在中性PH范围内强于3. 2微摩尔的人FcRn结合活性的抗原结合分子； (b)得到编码抗原结合分子的基因，其中在(a)中制备的人FcRn结合结构域与抗原结合结构域连接；和 (C)使用(b)中制备的基因产生抗原结合分子。
53.用于筛选抗原结合分子的方法，所述方法包括以下步骤 (a)选择与在改变在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子的人FcRn结合结构域中的至少一个氨基酸之前相比，在中性PH范围内具有较强的人FcRn结合活性的抗原结合分子； (b)改变抗原结合分子的抗原结合结构域中的至少一个氨基酸，并选择与在酸性pH范围内相比在中性PH范围内具有较强抗原结合活性的抗原结合分子； (c)获得编码抗原结合分子的基因，其中在(a)和(b)中制备的人FcRn结合结构域与抗原结合结构域连接；和 (d)使用在(C)中制备的基因产生抗原结合分子。
54.用于筛选抗原结合分子的方法，所述方法包括以下步骤 (a)选择与在改变在酸性pH范围内具有人FcRn结合活性的抗原结合分子的人FcRn结合结构域中的至少一个氨基酸之前相比，在中性pH范围内具有较强的人FcRn结合活性的抗原结合分子； (b)选择与在酸性pH范围内相比在中性pH范围内具有较强抗原结合活性的抗原结合分子; (c)获得编码抗原结合分子的基因，其中在(a)和(b)中制备的人FcRn结合结构域与抗原结合结构域连接；和 (d)使用在(C)中制备的基因产生抗原结合分子。
55.权利要求30-54中任一项的方法，其中所述抗原结合结构域包含与受体结合的人工配体。
56.权利要求30-54中任一项的方法，其中所述抗原结合结构域包含与配体结合的人工受体。
57.权利要求30-54中任一项的方法，其中所述抗原结合分子为抗体。
全文摘要
本发明的目的是提供用于促进抗原结合分子介导的细胞对抗原摄入的方法、用于促进血浆抗原浓度降低的方法、用于增加单个抗原结合分子可与之结合的抗原的数目的方法、用于改进抗原结合分子的药代动力学的方法、促进细胞对抗原摄入的经改良的抗原结合分子、能够促进血浆抗原浓度降低的抗原结合分子、能够与抗原重复结合的抗原结合分子、具有改进的药代动力学的抗原结合分子、包含所述抗原结合分子的药物组合物和用于产生上述这些的方法。本发明人发现在血浆pH下具有人FcRn结合活性且抗原结合活性在早期内体pH下比在血浆pH下低的抗体促进细胞对抗原的摄入；这类抗体可增加单个抗体分子可与之结合的抗原的数目；通过给予这类抗体可促进血浆抗原的降低；且通过使用这类抗体可改进抗体药代动力学。
文档编号C07K16/00GK102918057SQ201180026699
公开日2013年2月6日 申请日期2011年3月30日 优先权日2010年3月30日
发明者井川智之, 石井慎也, 前田敦彦, 中井贵士 申请人:中外制药株式会社