专利名称：基于重组蛋白的抗链球菌感染疫苗的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及亚单位免疫原性或疫苗组合物及其在用于免疫易受链球菌感染的哺乳动物中的用途。本发明还涉及制备、配制和施用该组合物的方法。
背景技术：
马中的链球菌感染主要由各种马链球菌(Streptococcus equi)引起，马链球菌包括三个亚种，分别命名为马(equi)亚种、兽疫(zooepidemicus)亚种和反会动物(ruminatorium)亚种，下文仅简称为马链球菌马亚种(S. equi)、马链球菌兽疫亚种(S. zooepidemicus)和马链球菌反会动物亚种(S. ruminatorium)(参考文献15、24、40)。实际上局限于马的马链球菌马亚种为腺疫(strangle)的病原体，腺疫为世界上广泛分布且高度感染性的马科上呼吸道的严重疾病。腺疫为世界范围内最经常报告的马科疾病之一，其特征在于发热、流涕以及在咽后和下颌淋巴结形成脓肿。在一些病例中所述疾病表现为体内新陈代谢病程，即通常所说的“假腺疫(bastard strangle)”。所述疾病具有世界范围内的分布并引起巨大的经济损失(参考文献39)。马链球菌兽疫亚种被认为是在健康马上呼吸道中经常发生的机会性共生体。然而，在应激或病毒感染后，其可引起产生腺疫样症状的继发感染。另外，马链球菌兽疫亚种不仅感染马，而且还感染许多其他动物，诸如猪、山羊、狗、猫和牛。甚至已报道了由兽疫亚种引起的人类感染病例(参考文献5)。该亚种已被怀疑为病症例如子宫内膜炎、宫颈炎、流产、乳腺炎、肺炎、脓肿和关节感染中的原发性病原体。已从患有乳腺炎的绵羊和山羊的乳分离了马链球菌反刍动物亚种(参考文献10)。酿脓链球菌(Stre ptococcus pyogenes)为引起各种疾病例如脓疱病、咽炎、坏死性筋膜炎和中毒性休克综合症的重要人类病原体。虽然可以用抗生素例如青霉素、四环素或庆大霉素(gentamicin)来治疗和治愈这些链球菌感染，但将期望能够预防该感染的爆发以及消除或降低与抗生素治疗相关的抗性株发展风险的有效预防剂。相关技术说明然而，虽然已进行了许多努力以开发预防剂例如抗马链球菌的疫苗，但对于马亚种、兽疫亚种和反刍动物亚种或酿脓链球菌(S. pyogenes)，目前市场上仍没有可获得的有效和安全的疫苗。现存抗腺疫疫苗基于马链球菌马亚种的失活，例如马链球菌马亚种的热杀死株或减毒株或者为富含由马链球菌马亚种产生的M-蛋白(即免疫原性蛋白质)的酸提取物/变溶菌素。基于M样蛋白的抗马链球菌兽疫亚种的疫苗公开于US-A-5，583，014。在WO87/00436、参考文献17和WO 2009/093014A2中公开了将马链球菌马亚种的减毒株用作抵抗由马链球菌马亚种引起的感染的疫苗。商业抗腺疫疫苗，Equilis StrepE(来自Intervet, UK)发售于2004年。然而，该疫苗基于马链球菌马亚种的减毒(活、缺失突变的)菌株，该疫苗的安全性和效力受到怀疑(参考文献23、35)。由于以前开发的基于活或失活细菌的疫苗或免疫制品受到副作用的影响，并且可能提供的保护不够，因此存在对于保护以抵抗马链球菌马亚种感染和/或预防其传播而不引起不期望的副作用的、有效和安全的预防剂，例如疫苗的需求。近年来，已鉴定和表征了与宿主细胞的细胞外基质(ECM)或血浆蛋白的不同成分相互作用和/或结合的链球菌表面蛋白。已表征的马链球菌马亚种和马链球菌兽疫亚种的胞外表面蛋白的实例为FNZ(参考文献29)、EAG(参考文献27)、胶原样蛋白(SclC、SclD,SclE、SclF、SclG、SclH和Sell)(参考文献21、22)、CNE(还称为 See)(参考文献25)、ZAG(参考文献18和W095/07296)。此外，被认为释放到周围培养基的马链球菌马亚种胞外蛋白的实例为SFS (参考文献28)、IdeE和IdeZ (参考文献26)、IdeE2和IdeZ2 (参考文献16)。这些类型的蛋白为用作免疫目的的活性成分的潜在候选者。该类型蛋白作为保护马抵抗腺疫的潜在疫苗的成分的用途被公开于WO2004/032957AUW0 00/37496、W02007/115059A2、WO 98/01561 和 WO 2009/075646A1。Flock, M.等人(2004)(参考文献11)报道了在马腺疫的小鼠模型中，使用分别命名为FNZ、SFS和EAG的蛋白的部分来免疫小鼠。FNZ和EAG被认为是用于开发安全并有效的抗腺疫疫苗的期望候选者。Timoney等人(2007)(参考文献42)报道了重组DNA产生的马亚种的胞外蛋白作为疫苗成分是无效的。推测在早期报道的结果中，对于通过重组DNA技术产生的、在小鼠实验中显示保护的一些马链球菌马亚种蛋白不适用于马。因此，重组体形式的胞外定位的马链球菌马亚种蛋白作为疫苗成分必然有功能并不是显而易见的。参考文献45中，报道了使用来自马链球菌马亚种的重组抗原EAG、CNE和SclC接种马以抵抗腺疫。在该研究中，接种的马在用马链球菌马亚种激发(challenge)后显示细菌收率显著减少和流涕水平显著降低。虽然为开发有效的疫苗已进行了许多努力，并且在参考文献14和15、WO2004/032957A1、WO 2009/075646A1中提供的一些免疫成分是用于保护以抵抗马链球菌马亚种感染的疫苗的期望候选者，但仍期望开发安全的、具有高度免疫原性和显示有限副作用或没有副作用的疫苗。人类病原体酿脓链球菌还表达与ECM和/或宿主血液成分相互作用的许多胞外蛋白(参考文献6、7、9、33)。其中之一为称作EndoS的内切糖苷酶，其能够水解人免疫球蛋白G(IgG)上天冬酰胺-连接的聚糖的壳二糖核心(参考文献8)。EndoS在一系列文章中被进一步表征，描述了例如酶性质、特异性等(参考文献1、2、3、4、34)。EndoS在治疗或预防由IgG抗体介导的疾病例如自身免疫病中的用途公开于W0/2008/071418A2，和EndoS在分离和分析IgG中的活体外的用途公开于WO 2009/033670A2。马链球菌马亚种的EndoSe和马链球菌兽疫亚种的EndoSz或其片段作为抗细菌感染或引起免疫原应答(immunogenicresponse)或保护性免疫应答的疫苗的用途公开于WO 2011/059385A1 (将其全部公开内容引入本文以作参考)。 发明内容
本发明基于抗原性的、适合的免疫原性的、包含含有源自在马链球菌马亚种和马链球菌兽疫亚种之一或两者中存在的蛋白的至少一种抗原表位或抗原决定簇的多种抗原、适合的免疫原的组合物及其在免疫非人类哺乳动物抵抗马链球菌马亚种和/或马链球菌兽疫亚种中的用途。根据本发明，组合物的至少一种成分为包含两个或多个抗原或其片段的融合蛋白或多肽。本发明还涉及亚单位免疫原或疫苗组合物,其包含上述抗原组合物作为免疫成分；涉及制备所述抗原性的、适合的免疫原性组合物或疫苗组合物的方法；涉及在非人类哺乳动物中诱导抗马链球菌马亚种和/或马链球菌兽疫亚种的免疫应答的方法；以及涉及在非人类哺乳动物中预防性或治疗性处理马链球菌马亚种和/或马链球菌兽疫亚种感染的方法。本发明还涉及特异性抗原融合多肽本身。根据适合的实施方案，本发明涉及保护马科例如马抵抗由马链球菌马亚种引起的疾病，例如腺疫、上呼吸道感染、创伤感染和子宫内膜炎的疫苗。词语“保护”是包括完全保护和降低感染严重性之间的任何情况的泛称。可用各种方式测量保护程度，关于例如马链球菌马亚种在马中的感染，疫苗的效果可以是降低临诊症状和降低临床疾病，其中可观察到温度升高幅度的降低、淋巴结(Iympnodes)肿胀的降低和细菌从被感染动物的传播降低等。如何测量免疫组合物在激发后的效力的方法和步骤可从例如参考文献14和WO2009/075646A1 中获得。出于各种原因，在马中进行接种和激发实验之前，在小型动物模型中研究疫苗中待使用的新抗原的评价。关于由马亚种引起的上呼吸道感染，已描述了优选和良好建立的接种和实验感染模型(参考文献11、12、13、14、16、43、WO 2004/032957A1、WO2009/075646A1)。该模型以高度的可靠性被用于筛选和评价在马中具有引发保护性免疫原应答潜能的马链球菌马亚种抗原(参考文献13、14)。在由马链球菌马亚种引起的感染的情形中，“非人类哺乳动物”的表述主要指属于马科的由马、驴和斑马及其杂 种如马骤和驴骤组成的动物。骆骑和单峰骑(dromedarie)也包含于其中。关于由马链球菌兽疫亚种引起的感染，“非人类哺乳动物”的表述另外还指其它哺乳动物例如牛、猪、狗和猫。本发明的上述各方面及其优选实施方案定义于所附权利要求书中。在特定实施方案中，本发明使用选自氨基酸序列SEQ IDN0S:22、24、26、28、30、32、
34、38、42的一种或多种多肽和选自核苷酸序列SEQ ID NO S: 21、23、25、27、29、31、33、37、41的一种或多种核苷酸序列。除非另有陈述，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的微生物学、重组DNA技术和分子生物学及免疫学的常规技术。该技术说明于文献例如Samtoook等人(2001)MolecularCloning:A laboratory manual,第三版，Cold Spring HarbourPress0 除非另有定义，否则本文所使用的所有科技术语与由本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同。分子例如蛋白质或核酸的“片段”意思是指氨基酸或核苷酸序列的部分。术语“类似物”指与参考序列具有80%以上、尤其是90%以上序列同源性(“同一性”)的核酸或氨基酸序列的变体。通常，“同一性”指两个多核苷酸或多肽序列各自准确的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的对应性。确定核酸序列同一性的技术在本领域中是熟知的，并且用于计算序列之间同一性的软件程序是可获得的。许多马链球菌马亚种蛋白在各种报道中具有不同的命名。为了便于阅读，将本申请及以前报道/专利申请文献和选择性命名示于下表I中。表I
权利要求
1.一种抗原组合物，其包含源自马链球菌马亚种或兽疫亚种抗原的多个抗原成分，所述抗原成分包含 (i)第一融合多肽，其包含命名为EAG的蛋白的至少一部分和命名为CNE的蛋白的至少一部分； 和(ii)至少一种另外的多肽，其选自 (a)第二融合多肽，其包含命名为Eq5的蛋白的至少一部分和命名为Eq8的蛋白的至少一部分， (b)第三融合多肽，其包含命名为IdeE的蛋白的至少一部分和命名为Eq5的蛋白的至少一部分， (C)命名为EndoSe的蛋白或命名为EndoSz的蛋白的至少一部分， (d)命名为IdeE的蛋白的至少一部分， (e)命名为IdeE2的蛋白的至少一部分， (f)命名为Eq27的蛋白的至少一部分， (g)命名为Eq54的蛋白的至少一部分， (h)命名为Scl的蛋白家族的蛋白的至少一部分，其中各所述蛋白的所述至少一部分包含至少一种抗原表位。
2.根据权利要求1所述的抗原组合物，其中所述第一融合多肽进一步包含命名为Scl的蛋白家族的至少一种蛋白的至少一部分。
3.根据权利要求1或2所述的抗原组合物，其中所述第一融合多肽进一步包含命名为Eq54的蛋白的至少一部分。
4.根据权利要求1至3任一项所述的抗原组合物，其中所述命名为EAG的蛋白的至少一部分包含所述蛋白的N端部分。
5.根据权利要求1至4任一项所述的抗原组合物，其中所述命名为CNE的蛋白的至少一部分包含所述蛋白的N端部分。
6.根据权利要求1至5任一项所述的抗原组合物，其中所述至少一种另外的多肽包含权利要求1中所述的第二融合多肽，和所述命名为IdeE的蛋白的至少一部分。
7.根据权利要求6所述的抗原组合物，其进一步包含所述命名为IdeE2的蛋白的至少一部分。
8.根据权利要求1至5任一项所述的抗原组合物，其中所述至少一种另外的多肽包含权利要求1中所述的第三融合多肽。
9.根据权利要求8所述的抗原组合物,其进一步包含所述命名为EndoSe或EndoSz的蛋白的至少一部分。
10.根据权利要求1至9任一项所述的抗原组合物，其中所述第一融合多肽包含SEQIDNO 24中所示的，从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
11.根据权利要求1至9任一项所述的抗原组合物，其中所述第一融合多肽包含SEQIDNO 28中所示的，从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
12.根据权利要求1至9任一项所述的抗原组合物，其中所述第一融合多肽包含SEQIDNO 34中所示的，从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
13.根据权利要求1至12任一项所述的抗原组合物，其中所述第二融合多肽包含SEQID NO 22中所示的，从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
14.根据权利要求1至13任一项所述的抗原组合物，其中所述第三融合多肽包含SEQID NO 30中所示的，从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
15.根据权利要求6所述的抗原组合物，其包含(i)含有如SEQID NO:22所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的融合多肽，(ii)含有如SEQ ID N0:24所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的融合多肽，和(iii)含有如SEQ ID N0:26所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的多肽。
16.根据权利要求8所述的抗原组合物，其包含(i)含有如SEQID NO:28所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的融合多肽，(ii)含有如SEQ ID N0:30所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的融合多肽，和(iii)含有如SEQ ID N0:32所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的多肽。
17.根据权利要求8所述的抗原组合物，其包含(i)含有如SEQID NO: 34所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的融合多肽，(ii)含有如SEQ ID N0:30所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的融合多肽，和(iii)含有如SEQ ID N0:32所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的多肽。
18.根据权利要求8所述的抗原组合物，其包含(i)含有如SEQID NO: 34所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的融合多肽，和(ii)含有如SEQ ID N0:30所示(从第12个氨基酸开始)的氨基酸序列的融合多肽。
19.一种抗原融合多肽，其包含SEQ ID N0:22中所示的，从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
20.一种抗原融合多肽，其包含SEQ ID NO:24中所示的，从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
21.一种抗原融合多肽，其包含SEQ ID NO:28中所示的，从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
22.—种抗原融合多肽，其包含SEQ ID N0:30中所示的，从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
23.一种抗原融合多肽，其包含SEQ ID NO:34中所示的，从第12个氨基酸开始的氨基酸序列。
24.一种抗原组合物，其包含权利要求19至23所述的至少一种融合多肽，或其类似物。
25.一种用于保护非人类哺乳动物抵抗马链球菌感染的疫苗组合物，其包含作为免疫成分的权利要求1至18和24任一项所述的抗原组合物，和药物学可接受载体。
26.根据权利要求25所述的疫苗组合物，其进一步包含佐剂。
27.一种用于保护非人类哺乳动物抵抗马链球菌感染的疫苗组合物，其包含至少一种重组载体和多核苷酸，所述多核苷酸插入所述至少一种重组载体中并编码权利要求1至18和24任一项所述的组合物的抗原成分，所述一种载体或多种载体能够在易受马链球菌感染的哺乳动物中活体内表达所述成分。
28.根据权利要求27所述的疫苗组合物，其中所述载体为质粒或病毒载体形式的表达载体。
29.根据权利要求25至28任一项所述的疫苗组合物，其以生理学可施用形式，优选可通过肌内、皮内、皮下或鼻内接种的施用形式来提供。
30.根据权利要求25至28任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗能够保护易感哺乳动物抵抗马链球菌感染，尤其是保护马抵抗由马链球菌马亚种引起的腺疫。
31.根据权利要求30所述的疫苗组合物，其能够在对马链球菌易感的哺乳动物，尤其是马中刺激定向抵抗马链球菌抗原的血清、粘膜和/或支气管的抗体应答。
32.—种生产根据权利要求1至18和24任一项所述的抗原组合物的抗原的方法，所述方法包括 (a)提供编码所述抗原的DNA片段并将所述片段导入至少一种表达载体； (b)将包含所述DNA片段的所述至少一种载体导入至少一种相容性宿主细胞； (c)在表达由所述DNA片段编码的产物所需的条件下培养在步骤(b)中提供的所述至少一种宿主细胞；和 (d)从各培养的宿主细胞中分离表达产物，和任选地， (e)纯化来自步骤(d)的分离产物，优选通过色谱法来纯化。
33.一种根据权利要求25至28任一项所述的疫苗组合物的制备方法，所述疫苗组合物包含权利要求1至18和24任一项所述的抗原组合物作为免疫成分，其中所述方法包括将抗原组合物与药物学可接受载体混合。
34.根据权利要求1至18和24任一项所述的抗原组合物在制备保护抵抗马链球菌感染，尤其是在马中抵抗由马链球菌马亚种感染引起的腺疫的疫苗中的用途。
35.根据权利要求1至18和24任一项所述的抗原组合物，其用于预防性或治疗性处理由马链球菌引起的感染。
36.一种生产抗血清的方法，所述方法包括将根据权利要求1至18和24任一项所述的抗原组合物施用到非人类哺乳动物宿主从而在所述宿主中产生抗体和回收包含所述宿主中所产生的所述抗体的抗血清。
37.一种在哺乳动物，尤其是马中预防性或治疗性处理马链球菌感染的方法，其包括向所述哺乳动物施用免疫有效量的权利要求25至28任一项所述的疫苗组合物，或根据权利要求36所述生产的抗血清。
38.一种保护马抵抗马链球菌感染的方法，其包括用权利要求25至28任一项所述的疫苗组合物来皮下、皮内、肌内或鼻内接种马，从而在所述马中诱导抵抗马链球菌的免疫应答。
39.根据权利要求38所述的方法，其中在所述马中诱导在血清和/或鼻咽粘液中的IgG和/或IgA和/或IgM抗体形式的免疫应答。
40.一种抗体制品，其包含对根据权利要求1至18和24任一项所述的抗原组合物的抗原特异的至少一种，和优选至少两种单克隆或多克隆抗体，或抗体片段。
41.根据权利要求40所述的抗体制品，当施用到易被马链球菌感染的哺乳动物时，其用于预防性或治疗性提供被动免疫。
42.一种被动免疫的方法，其包括向哺乳动物施用权利要求40或41所述的抗体制品。
全文摘要
抗原组合物包含源自马链球菌马亚种或兽疫亚种抗原的多种抗原成分，其中至少一种成分为包含两个或更多个该抗原或其片段的融合蛋白或多肽。抗原组合物可用于免疫哺乳动物来抵抗马链球菌马亚种和/或兽疫亚种。还公开了包含抗原组合物作为免疫成分的疫苗组合物。
文档编号C07K16/12GK103068838SQ201180026088
公开日2013年4月24日 申请日期2011年5月25日 优先权日2010年5月26日
发明者B·古斯, J-I·弗洛克, L·弗里克伯格, M·弗洛克 申请人:英特瓦克公司