专利名称：Trail r2-特异性多聚体支架的利记博彩app
技术领域：
本发明总体上涉及抗体模拟物的领域，具体地涉及用于例如产生具有新型结合特征的产物的基于纤连蛋白III型(Fn3)结构域的多聚体支架。具体地，本发明涉及衍生自人胰糖蛋白C的第3FnIII结构域的TRAIL R2-特异性多聚体支架，以及它们用于TRAIL R2 受体检测和TRAIL R2-介导的功能的调节例如癌症和其它障碍的治疗的用途。背景领域能够特异性结合期望的靶表位的生物分子具有作为治疗剂、研究和医学诊断工具的极大重要性。该类分子的公知实例为抗体。可选择特异性结合几乎任何结构表位和具有对于所述表位的亲和力的抗体。然而，经典抗体是难以在简单真核系统中表达的结构复杂的异源四聚体分子。因此，大多数抗体使用复杂且昂贵的哺乳动物细胞表达系统来产生。具有相对确定的三维结构的蛋白质(通常称为蛋白质支架)可用作用于设计工程产物的试剂。其中这类支架是有用的一个具体领域是抗体模拟物设计的领域。抗体模拟物，即小的非抗体蛋白质治疗剂，利用抗体和抗体片段的有利方面，例如对靶的高亲和力结合以及低免疫原性和毒性，同时避免一些缺点，例如抗体片段聚集的倾向以及不如全长IgG稳定。这些缺点可通过使用通过除去抗体天然折叠的部分产生的抗体片段来解决。然而，当通常包埋在疏水环境例如可变结构域与恒定结构域之间的界面中的氨基酸残基变得暴露于溶液时，这通常引起聚集。基于支架的抗体模拟物的一个实例基于III型(FnIII)的纤连蛋白模块(在门(phyla)间和蛋白质种类间(例如在哺乳动物的血液和结构蛋白质中)被广泛发现的结构域)的结构。TRAIL (肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体，在文献中也称为Apo2L和TNFSF10)属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族并且已被鉴定为肿瘤细胞的程序化细胞死亡或细胞凋亡的激活物。TRAIL的膜结合和可溶性形式都能够通过与位于靶细胞上的TRAIL受体相互作用来触发细胞凋亡。在人中，已鉴定了 5个受体具有对TRAIL的结合活性。在TRAIL对TRAILRl或TRAIL R2结合后，触发了半胱天冬酶相关的细胞死亡。鉴于该细胞死亡活性，正在寻找基于TRAIL的治疗方法。已开发了几种基于TRAIL或TRAIL Rl或R2人激动抗体的治疗性方法，然而，TRAIL具有极短的寿命，其结合诱饵受体，并且抗体的大尺寸可限制它们的肿瘤渗透。因此，存在对可结合TRAIL受体的新型分子、包含此类分子的药物组合物、用于筛选此类分子的方法以及用于在许多癌症的治疗性治疗中使用此类分子的方法的需要。本文中的参考资料的引述或论述不应当被解释为这对于本发明是现有技术的承认。发明概述本发明提供了包含2个Tn3单体支架的TRAIL R2_特异性重组多聚体支架，其中(a)每一个Tn3单体支架包含命名为Α、B、C、D、E、F和G的7个β链，和6个命名为ΑΒ、BC、⑶、DE、EF和FG的环区域，(b)Tn3单体支架以串联形式连接，以及(c)重组多聚体支架特异性结合TRAIL R2。在一些实施方案中，TRAIL R2-特异性多聚体支架包含3、4、5、6、7或8个Tn3单体支架。在一些其它实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架中的所有Tn3单体支架以串联形式存在。在一些实施方案中，TRAIL R2-特异性多聚体支架的至少一个Tn3单体支架通过接头或通过异源部分直接连接于1、2、3、4、5、6或7个其它Τη3单体支架。在某些实施方案中，TRAIL R2-特异性多聚体支架直接连接而无间插在Tn3单体支架之间的接头。在一些 实施方案中，TRAIL R2-特异性多聚体支架的至少2个Tn3单体支架通过接头连接。在一些实施方案中，接头包含肽接头。在一些实施方案中，肽接头是柔性肽接头。在某些实施方案中，肽接头包含(GxS)y序列，其中X和y为整数，其中x=l、2、3或4，并且其中y=l、2、3、4、
5、6 或 7。在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架对TRAIL R2的结合与TRAIL R2特异性Tn3单体支架的所述结合相比较得到了增强。在一些实施方案中，TRAILR2-特异性多聚体支架对TRAIL R2的结合与TRAIL R2特异性Tn3单体支架的所述结合相比较增强了对靶的作用。在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2特异性支架对TRAIL R2的结合相对TRAILR2特异性Tn3单体支架的所述结合的增强是结合亲和力的增强和/或结合亲合力的增强。在其它实施方案中，对于TRAIL R2的结合亲和力和蛋白质稳定性相对于TRAIL R2特异性Tn3单体支架的所述结合亲和力和蛋白质稳定性得到了增强。在一些实施方案中，对于TRAIL R2的结合亲合力和蛋白质稳定性相对于TRAIL R2特异性Tn3单体支架的所述亲合力和蛋白质稳定性得到了增强。在一些实施方案中，TRAIL R2-特异性多聚体支架包含含有功能性部分的接头。在一些实施方案中，功能性部分为免疫球蛋白或其片段。在某些实施方案中，免疫球蛋白或其片段选自Fab片段、Fab’片段、Fd片段、Fd’片段、Fv片段、dAb片段、F (ab’)2片段、scFv、双链抗体、线性抗体、全长抗体、Fe区域及所述部分的两个或更多个的组合。在某些实施方案中，免疫球蛋白或其片段包含IgG的Fe结构域和铰链区。在其它实施方案中，免疫球蛋白或其片段还包含CHl结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白或其片段包含Ck结合域或CA结构域。在一些实施方案中，TRAIL R2-特异性多聚体支架的Tn3单体支架的至少一个融合于异源部分。在一些实施方案中，异源部分包含选自如下物质的组合物蛋白质、肽、蛋白质结构域、接头、药物、毒素、细胞毒素剂、成像剂、放射性核素、放射性化合物、有机聚合物、无机聚合物、聚乙二醇(PEG)、生物素、人血清白蛋白(HSA)、HSA FcRn结合部分、抗体、抗体的结构域、抗体片段、单链抗体、结构域抗体、白蛋白结合结构域、酶、配体、受体、结合肽、非-FnIII支架、附加表位、重组多肽聚合物、细胞因子以及所述部分的两种或更多种的组
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在一些具体实施方案中，将TRAIL R2-特异性多聚体支架缀合于PEG。在其它实施方案中，超过2个Tn3单体支架通过接头连接并且至少一个接头在结构上和/或功能上与另外的接头不同。·在一些实施方案中，TRAIL R2-特异性多聚体支架中的Tn3单体支架以分枝形式连接。在其它实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架中的一些Tn3单体支架以线性串联方式连接并且一些Τη3单体支架以分枝形式连接。在一些实施方案中，TRAILR2-特异性多聚体支架中的至少2个Tn3单体支架是相同的。在其它实施方案中，TRAILR2-特异性多聚体支架中的至少2个Tn3单体支架是不同的。在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架结合至少另外的靶，其可以是T细胞抗原。在一些实施方案中，该T细胞抗原为⑶40L。在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架为受体激动剂。在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架的至少2个Tn3单体支架结合TRAILR2上的相同表位。在其它实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架的至少2个Tn3单体支架结合TRAIL R2上的不同表位。在一些实施方案中，不同TRAILR2表位为非重叠表位。在其它实施方案中，不同TRAIL R2表位为重叠表位。在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2_特异性多聚体支架中的至少2个Tn3单体支架的β链与SEQ ID NO: I的β链具有至少90%的序列同一性。在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架中的至少2个Tn3单体支架包含氨基酸序列IEV (Xab) nALITff (Xbc) JELX1YGI (Xcd) JTIX2L (Xde) nYSI (Xef) JEVSLIC (Xfg) nKX3TFTT其中Xffi、XBC, Xcd, Xde、Xef和XFe分别代表存在于AB、BC、CD、DE、EF和FG环中的氨基酸残基，其中X1代表氨基酸残基A或T，其中X2代表氨基酸残基D或G，其中X3代表氨基酸E或G，并且其中环的长度η为2与26之间的整数。在一些实施方案中，AB环包含SEQID NO: 35，CD环包含SEQ ID NO: 37以及EF环包含SEQ ID NO: 39。在一些实施方案中，BC环包含选自SEQ ID Ν0:97、98或168的序列。在一些实施方案中，DE环包含选自SEQ IDΝ0:102、103和179的序列。在一些实施方案中，FG环包含选自SEQ ID NO: 106、108、109、169和170。在一些实施方案中，BC环包含SEQ ID N0:97, DE环包含SEQ ID NO: 179以及FG环包含SEQ ID Ν0:170。在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架包含 SEQ ID NO:209 或 204。在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2_特异性多聚体支架以I μ M或更小的亲和力(Kd)结合TRAIL R2受体。在另一个实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架以500nM或更小的亲和力(Kd)结合TRAIL R2受体。在另一个实施方案中，本发明的TRAILR2-特异性多聚体支架以IOOnM或更小的亲和力(Kd)结合TRAIL R2受体。本发明还提供了编码任何上述多聚体支架的分离的核酸分子。在一些实施方案中，表达载体包含核酸。在其它实施方案中，宿主细胞包含载体。本发明还提供了产生本发明的TRAIL R2_特异性多聚体支架的方法，包括在其中由核酸分子编码的多聚体支架被表达的条件下培养宿主细胞。本发明还提供了在药学上可接受的赋形剂中包含本发明的重组TRAIL R2-特异性多聚体支架的组合物。本发明还提供了通过施用有效量的包含本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架的组合物来预防、治疗、缓解或管理有此需要的患者的癌症的方法。在一些实施方案中，癌症选自肺癌、非何杰金氏淋巴瘤、卵 巢癌、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌和多发性骨髓瘤。本发明还提供了利用包含本发明的TRAIL R2_特异性多聚体支架的组合物诊断患者的疾病或对其成像的方法。还提供了诱导表达RAIL R2的细胞的细胞凋亡的方法，包括将细胞与本发明的TRAILR2-特异性多聚体支架接触。在一些实施方案中，预防、治疗、缓解或管理有此需要的患者的癌症的方法还包括另外的疗法，其中所述疗法为免疫疗法、生物疗法、化学疗法、放射疗法或小分子药物疗法。在一些实施方案中，TRAIL R2_特异性多聚体支架特异性结合人TRAIL R2。在一些具体实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架结合TRAIL R2并且(a)激活TRAIL R2受体，(b)模拟TRAIL对TRAIL R2受体的结合，(c)促进TRAIL R2受体二聚化或寡聚化，(d)诱导细胞凋亡，(e)降低或抑制细胞活力，或(f)活性(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的组合。在其它实施方案中，本发明的支架提供了改变表达TRAIL R2的细胞的活性的方法，包括将细胞与根据权利要求1-47中任一项所述的TRAIL R2特异性多聚体支架接触，其中多聚体支架结合TRAIL R2并且(a)激活TRAIL R2受体，(b)模拟TRAIL对TRAIL R2受体的结合，(c)促进TRAIL R2受体二聚化或寡聚化，(d)诱导细胞凋亡，(e)降低或抑制细胞活力，或⑴活性(a)、(b)、(c)、⑷和(e)的组合。在一些实施方案中，将PEG在N端或C端上缀合于本发明的TRAIL R2_特异性多聚体支架。附图简述为了举例说明本发明，附图中描述了本发明的某些实施方案。然而，本发明不限于附图中描述的实施方案的精确安排和工具。图I显示了多价Tn3支架的线性、抗体样和融合形式。多价Τη3支架包含通过黑色八边形块表示的间隔子联接的两个或更多个Τη3模块，其中所述间隔子可以是例如接头。图2显示了按照图I中显示的3种不同分子形式产生的TRAILR2-特异性多价Τη3支架(命名为Α2至Α9)，效价(Τη3模块的数目)从2变化至8。图3显示了相应于在大肠杆菌(E. coli)中表达的命名为Al至Α5的线性串联构建体(效价从I变化至8)的粗制细菌培养基的非还原性SDS-PAGE分析(右边的凝胶)和亲和纯化的样品(左边的凝胶)。图4显示了测量单价(Al)和多价(Α2，A3)Τη3支架对TRAIL R2的结合的竞争ELISA。图5显示了结合H2122细胞的TRAIL R2-特异性多价支架A9与不结合TRAIL R2的关联对照支架(B9)相比较的流式细胞术柱状图。图6A显示了效价对多价支架对表达TRAIL R2的细胞系H2122的特异性杀伤的影响。图6B显示了 TRAIL R2-特异性多价支架对H2122肿瘤细胞杀伤的特异性。图7A显示了分子形式对包含4个Tn3模块的TRAIL R2-特异性多价支架杀伤H2122细胞的影响。图7B显示了分子形式对包含8个Tn3模块的TRAIL R2_特异性多价支架杀伤H2122细胞的影响。
图8A显示了线性融合的四价-(A3)和八价(A5) TRAIL R2-特异性Tn3支架对结直肠腺癌细胞系Colo205的特异性杀伤。图8B显示了线性融合的四价-(A3)和八价(A5) TRAIL R2-特异性Tn3支架对表达TRAIL R2的白血病Jurkat细胞系的特异性杀伤。图9A显示了鼠⑶40L-特异性串联二价Tn3支架(Μ13构建体)的设计。图9Β显示了具有连接两个Μ13模块的接头的纯化的单价Μ13构建体(⑶40L-特异性Τη3构建体)或串联二价支架的SDS-PAGE分析，所述接头包含1、3、5或7个Gly4Ser单元(称为GS)。将单价Μ13构建体在泳道2中电泳，构建体Cl在泳道3和7中电泳，构建体C2在泳道4和8中电泳，构建体C3在泳道5和9中电泳，构建体C4在泳道6和10中电泳。将样品在非还原条件(泳道2-6)或还原条件(泳道7-10)下进行电泳。图9C显示了 MuCD40L-特异性单价(Μ13)或二价串联支架对MuCD40L与固定在 生物传感器芯片上的鼠CD40受体的结合的抑制。显示了各种构建体的半最大抑制浓度(IC50)。图9D显示了 MuCD40L-特异性单价(M13)Tn3、二价串联支架或抗体MRl (抗-Mu⑶40L抗体)对B细胞上的Mu⑶40L-诱导的⑶86表达的抑制作用。
图10显示了通过细菌培养基的SDS-PAGE分析的在大肠杆菌中重组表达的可溶性单价和TRAIL R2/⑶40L-双特异性串联二价Tn3支架构建体的表达水平。单价支架Al和79分别示于泳道2和3中。通过长度递增的Gly4Ser氨基酸接头串联连接的包含Al和79的串联支架构建体(与构建体C5、C6、C7和C8关联)示于泳道4-7中。利用星号在染色的凝胶上标示表达的构建体。图IlA显示了使用捕获ELISA测定的双特异性Tn3支架对TRAIL R2的结合。图IlB显示了使用捕获ELISA测定的双特异性Tn3支架对人⑶40L的结合。图12显示了使用AlphaScreen 测定法测定的双特异性串联Tn3支架C5、C6、C7和C8对TRAIL R2和CD40L的同时结合。图13显示了在盐酸胍存在的情况下Tn3支架的稳定性。显示了每一个测试的支架的Cm(中点值)。图14显示了通过差示扫描量热法(DSC)分析的3个不同的具有不同环序列但具有相同长度FG环(9个氨基酸)的Τη3支架与具有更长的FG环的亲代Τη3支架相比较的热稳定性。图15显示了在盐酸胍存在的情况下，与亲代(WT) Τη3支架相比较具有9个氨基酸长度的FG环(P1C01、Α6和71)的Τη3支架的稳定性的增加。图16Α显示了三特异性/三价Τη3支架的图示和表达。D1-1E11-79支架包含Synagis&-结合结构域(Dl)，紧接着TRAIL R2-FC结合结构域(IEll)和对于人CD40L(79)是特异性的C-末端Tn3结构域。柔性(Gly4Ser)3接头将每一个结构域分隔。图16Β显示表达并且纯化的Dl-IEl 1-79支架的SDS-PAGE (4-12%Bis_Tris)凝胶。该构建体的预期分子量为约34，081道尔顿。图17A显示使用AlphaScreen结合分析证明的三特异性/三价Tn3支架Dl-IEl 1-79 对 huCD40L 和 TRAIL R2_Fc 的同时结合。AlphaScreen 信号(ASS)显示为Trai 1R2-Fc浓度的函数。
图17B显示使用AlphaScreen结合分析证明的三特异性/三价Tn3支架01-巧11-79对11110)4(^和8丫1^§丨3@的同时结合。AlphaScreen 信号(ASS)显示为Synagis 浓度的函数。图18显示使用ELISA证明的三特异性/三价Tn3支架Dl-IEl 1-79对TRAIL R2_Fc和Synagis' 的同时结合。图19显示亲代TRAIL R2结合克隆1C12与其亲和成熟的衍生物的序列比对。突出显示工程二硫键的位置，箭头指示一个构架突变的位置，在亲和成熟过程中产生的环的变化示于突出显示的块A、B、C和D中。图20显示1C12克隆及其亲和成熟的衍生物的CellTiter-Glo细胞存活测定。图21显示作为时间的函数的小鼠血清中G6串联的浓度。
图22A显示了相应于克隆F4的犬交叉反应的工程化增强的序列比对。所有这些克隆间的共同特征是处于DE环之前2个氨基酸的从D至G的突变。图22B显示由F4或F4modl单体产生的对人或犬TRAIL R2_Fc与F4modl涂覆的板的结合的抑制的ELISA测量。图23A显示了相应于克隆F4modl的种系化(germlining)的序列比对,特别是F4、F4modl和F4modl2与TN3种系的比较。图23B显示了 F4、F4modl或F4modl2单体对人或犬TRAILR2_Fc与F4modl涂覆的板的结合的抑制的ELISA测量。图23C显示比较G6串联6与F4modl2串联6的Colo205细胞杀伤测定。图23D显示比较G6串联8与F4modl2串联8的Colo205细胞杀伤测定。图24显示比较G6串联8与F4modl2串联8在TRAIL抗性细胞系HT29中的活性HT29细胞杀伤测定。图25显示相应于在Antitope EpiScreen免疫原性分析中测试的克隆的序列比对。突出显示相对于克隆F4modl2的差异。图26A显示非-SEC-纯化的G6串联8的SEC描记线。图26B显示SEC-纯化的G6串联8的SEC描记线。图27显示了响应不同剂量的Tn3TRAIL R2激动剂G6串联6和G6串联8的Colo205结直肠癌异种移植物模型的肿瘤体积的改变。图28显示响应不同剂量的Tn3TRAIL R2激动剂G6串联6和G6串联8的Colo205结直肠癌异种移植物模型的体重的改变。发明详述定义在详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于特定组合物或方法步骤，这样其可变化。必须指出，如本说明书和所附权利要求中使用的，除非上下文明确地指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the) ”包括复数所指物。术语“一(a)”(或“一 (an)”)以及术语“一个或多个”和“至少I个”在本文中可互换使用。此外，本文中所用的“和/或”将被用作两个指定的特征或组分的每一个的单独或一起的特定公开内容。因此，在本文中在短语例如“A和/或B”中使用的术语“和/或”意指包括“A和B”、“A或B”、“A” (单独的)和“B” (单独的)。同样地，短语例如“A、B和/或c”中使用的术语“和/或”意指包括下列实施方案的每一个A、B和C ;A、B或C ;A或C ;A或B ;B或C ;A和C ;A和B ;B和C ;A(单独的)；B(单独的)和C(单独的)。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明相关的领域内的技术人员通常理解的含义相同的含义。例如，生物医学和分子生物学简明词典(Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology), Juo, Pei-Show,第 2版，2002，CRC Press ;细胞和分子生物学词典(The Dictionary of Cell and MolecularBiology),第3版，1999，Academic Press ；以及生物化学和分子生物学牛津词典(Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology),修订版，2000，OxfordUniversity Press,为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般词典。单位、前置代号(prefixe)和符号以它们的国际单位制(SystSme Internationalde Unites) (SI)接受的形式来表示。数值范围包括界定范围的数字。除非另外指出，否则氨基酸序列以氨基至羧基方向从左至右书写。本文中提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限制，通过参考本说明书其是作为整体而存在。因此，即将在下文中定义的术语通过参考说明书作为整体得到更全面的定义。·
应理解，无论在本文中何处用词汇“包含”描述实施方案，也都提供了以“由……组成”和/或“基本上由.....组成”描述的其它类似实施方案。在本文中利用它们的通常已知的三字母符号或利用由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的一字母符号提及氨基酸。同样地利用它们通常接受的单字母代码提及核苷酸。如本文中所用，术语“表位”是指能够结合本发明的支架的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特殊的三维结构特征以及特殊的电荷特征。构象和非构象表位区别在于对前者但非对后者的结合在变性溶剂存在的情况下丧失。术语“纤连蛋白III型(FnIII)结构域”和“Fnlll结构域”是指与人纤连蛋白III型结构域同源的多肽，所述人纤连蛋白III型结构域具有分布在两个β折叠片之间的至少7个β链(所述β链自身彼此靠在一起以形成蛋白质的核心)，并且还包含将β链彼此连接的溶剂暴露环。在β折叠片夹层的每一个边缘上存在至少3个这样的环，其中所述边缘是与β链的方向垂直的蛋白质的边界。在某些实施方案中，FnIII结构域包含连接于命名为AB、BC、CD、DE、EF和FG的6个环区域的命名为A、B、C、D、E、F和G的7个β链，其中环区域连接每一个β链。术语“DNA”是指两个或更多个共价键合的天然存在的或经修饰的脱氧核糖核苷酸的序列。术语“融合蛋白”是指包括⑴联接于(ii)第二不同的蛋白质(即，“异源”蛋白质)的本发明的一个或多个支架的蛋白质。术语“异源部分”在本文中用于表示组合物至本发明的支架的添加，其中所述组合物通常不是FnIII结构域的部分。示例性异源部分包括蛋白质、肽、蛋白质结构域、接头、药物、毒素、成像剂、放射性化合物、有机和无机聚合物以及可能提供非FnIII结构域本身非固有的活性的任何其它组合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、细胞毒素剂、放射性核素、成像剂、生物素、二聚化结构域(例如亮氨酸拉链结构域)、人血清白蛋白(HSA)或其FcRn结合部分、抗体的结构域或片段(例如，抗体可变结构域、CHl结构域、Ck结构域、CA结构域、CH2或CH3结构域)、单链抗体、结构域抗体、白蛋白结合结构域、IgG分子、酶、配体、受体、结合肽、非-FnIII支架、附加表位、重组多肽聚合物、细胞因子等。如本文中所用，术语“接头”是指联接或连接两个或更多个支架的任何分子装配体。接头可以是其功能为用作支架的模块之间的“间隔子”的分子，或其还可以是具有其它功能的分子(即，“功能性部分”)。包括在“异源部分”的定义中的分子也可用作接头。术语“连接的”和“融合的”可互换使用。这些术语是指通过无论什么方法(包括化学缀合或重·组方法)将两个或更多个支架、异源部分或接头连接在一起。术语“多聚体”、“多聚体支架”和“多价支架”是指包含至少2个缔合的FnIII支架的分子。形成多聚体支架的支架可通过允许每一个支架独立地起作用的接头连接。“多聚体的”和“多价的”在本文中可互换使用。多价支架可以是单特异性的或双特异性的。术语“结构域”或“蛋白质结构域”是指可折叠成稳定的三维结构(通常与蛋白质的其余部分独立的)并且可被赋予特定功能的蛋白质的区域。该结构保持与原始蛋白质内的结构域的功能相关的特定功能，例如，酶促活性、针对另一种分子的识别基序的产生或为蛋白质存在于特定蛋白质环境中提供必需的结构组分。在蛋白质家族内和相关蛋白质超家族内，蛋白质结构域可以是进化上保守的区域。当描述多聚体支架的组分时，术语“结构域”、“单体支架”和“模块”可互换使用。“天然FnIII结构域”是指由活生物体编码的任何非重组FnIII结构域。“蛋白质序列”或“氨基酸序列”意指以氨基末端至羧基末端的方向存在的多肽的氨基酸组成的线性表现，其中所述表现中的彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。术语“核酸”是指任何两个或更多个共价键合的核苷酸或核苷酸类似物或衍生物。如本文中所用，该术语包括但不限于DNA、RNA和PNA。“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用。术语“多核苷酸”意欲包括单个核酸以及多个核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA (mRNA)或质粒DNA (pDNA)。术语“分离的”核酸或多核苷酸意欲指已从其天然环境中取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，对于本发明的目的而言，包含在载体中的编码例如本发明的支架的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的其它实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化的(部分或大体上)多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以为调控元件或可包括调控元件例如启动子、核糖结合位点或转录终止子。术语“药学上可接受的”是指可给动物(例如，哺乳动物)施用而无明显有害医学后果的化合物或蛋白质。术语“生理上可接受的载体”是指对治疗的宿主不具有明显的有害影响并且保持与其一起施用的化合物的治疗性质的载体。一个示例性生理上可接受的载体是生理盐水。其它生理上可接受的载体及其它制剂对于本领域技术人员来说是已知的并且描述于例如《雷明顿药学大全》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(第18版),编者A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa.(通过引用并入本文)。
“多肽”意指通过酰胺键(肽键)线性连接的两个或更多个氨基酸的任何序列，无论长度、翻译后修饰或功能。“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。因此，肽、二肽、三肽或寡肽包括在“多肽”的定义内，并且可使用术语“多肽”替代这些术语的任何术语，或可与其互换使用。术语“多肽”还意欲指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、利用已知的保护/封闭基团进行的衍生、蛋白质水解切割或利用非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可衍生自天然生物来源或通过重组技术产生，但不一定从指定的核酸序列翻译。多肽可以以任何方式(包括通过化学合成)来产生。作为本发明的多肽还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任何组合。变体可天然存在或为非天然存在的。可使用本领域已知的诱变技术产生非天然存在的变体。变异多肽可包含保守或非保守氨基酸置换、缺失或添加。作为“衍生物”还包括包含一个或多个天然存在的20种标准氨基酸的氨基酸衍生物的肽。“随机化的”或“突变的”意指相对于模板序列包括一个或多个氨基酸改变，包括缺 失、置换或添加。“随机化”或“突变”意指将这样的氨基酸改变引入序列的过程。随机化或突变可通过通常核酸编码序列的有意、盲目或自发序列变异来实现，以及可通过任何技术例如PCR、易错PCR或化学DNA合成来产生。术语“随机化”、“随机化的”、“突变”、“突变的”
等在本文中可互换使用。“关联”或“关联、非突变的蛋白质”意指除引入变异蛋白质的氨基酸外在序列上与变异蛋白质相同的蛋白质，其中所述变异蛋白质被随机化或突变。“RNA”意指两个或更多个共价键合的、天然存在的或经修饰的核糖核苷酸的序列。本术语中包括的经修饰的RNA的一个实例为硫代磷酯酯RNA。如本文中所用，术语“本发明的支架”或“本发明的支架”是指多聚体支架以及单体FnIII支架。术语“靶”是指被本发明的特定支架识别的化合物。常见的靶包括蛋白质、多糖、多核苷酸和小分子。术语“靶”和“抗原”在本文中可互换使用。如本文中所用，例如在术语“特异性结合”或“特异的结合”中的术语“特异性”是指本发明的支架籍以通过一个或多个抗原结合结构域结合一个或多个抗原并且该结合使得一个或多个抗原结合结构域与一个或多个抗原之间产生一定互补性的相对亲和力。根据该定义，当本发明的支架对表位的结合比其对随机、无关表位的结合更容易时，所述支架被认为“特异性结合”该表位。如本文中所用，术语“亲和力”是指本发明的某些支架对单个表位的结合的强度。如本文中所用，术语“亲合力”是指本发明的支架群体与某些表位之间的复合物的总体稳定性，即多个支架与抗原的结合的功能性组合的强度。亲合力与单个抗原结合结构域与特定表位的亲和力以及本发明的支架的效价相关。术语“对靶的作用”是指本发明的多聚体支架对一个或多个靶的结合以及因这样的结合而引起的生物效应。在这方面，多聚体支架中的多抗原结合单元可与多个靶和/或表位相互作用并且，例如使两个靶在物理上更靠近，通过与不同靶相互作用触发代谢级联等。关于TRAIL R2，“对靶的作用”是指例如通过增强、刺激或激活TRAIL R2的一个或多个生物学活性所获得的作用。如本文中所用，术语“效价”是指潜在抗原结合模块的数目，例如，本发明的支架中的FnIII模块的数目。当本发明的支架包含超过一个抗原结合模块时，每一个结合模块可特异性结合例如相同靶或不同靶中的相同表位或不同表位。
如本文中所用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可与第二巯基形成二硫键或桥的巯基。术语“Tn3模块”和“Tn3支架”，如本文中所用，是指这样的FnIII支架，其中A β链包含 SEQ ID Ν0:42,Ββ 链包含 SEQ ID NO:43, 链 SEQ ID 勵:45或131，00 链包含SEQ ID NO: 46，E β 链包含 SEQ ID NO: 47，FP 链包含 SEQ ID NO: 49 以及 β 链 G 包含 SEQID Ν0:52，其中至少I个环为“野生型Τη3支架”中的环的非天然存在的变体。在某些实施方案中，除Ce链( 例如，SEQ ID NO:45或131中的半胱氨酸)和FP链(SEQ ID NO:49)中的半胱氨酸残基不被置换外，Τη3模块的一个或多个β链包含至少I个氨基酸置换。如本文中所用，术语“野生型Τη3支架”是指包含SEQ ID NO: I的FnIII支架，SP从人生腱蛋白C的第3个FnIII衍生的工程FnIII支架。术语“免疫球蛋白”和“抗体”包括各种广泛种类的在生物化学上可区分的多肽。本领域技术人员将理解重链被分类为Y、μ、α、δ或ε。该链的性质是将抗体的“种类”分别确定为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。这些种类的每一个种类的经修饰的形式对于本领域技术人员来说是可容易辨别的。如本文中所用，术语“抗体”包括但不限于完整抗体、经修饰的抗体、抗体VL或VL结构域、CHl结构域、C K结构域、C λ结构域、Fe结构域(参见上文)、CH2或CH3结构域。如本文中所用，术语“经修饰的抗体”包括被改变以使它们为非天然存在的抗体的合成形式，例如包含至少2个重链部分但不包含两个完整的重链的抗体(例如，缺失结构域的抗体或微小抗体(minibody));经改变结合两个或更多个抗原或结合单个抗原的不同表位的抗体的多特异性形式(例如，双特异性、三特异性等)。此外，术语“经修饰的抗体”包括抗体的多价形式(例如，三价、四价等，结合3个或更多个拷贝的相同抗原的抗体)。(参见，例如，Antibody Engineering, Kontermann&DubeI 编著,2010SpringerProtocols, Springer)。术语“体内半衰期”以其通常的含义使用，即50%的多肽的生物活性仍然存在于身体/靶器官时的时间，或多肽的活性为其初始值的50%时的时间。作为测定功能性体内半衰期的另一选择，可测定“血清半衰期”，即50%的多肽分子在被清除之前在血浆或血流中循环时的时间。血清半衰期的测定通常比测定功能性体内半衰期简单，并且血清半衰期的量度通常是功能性体内半衰期的量度的良好指征。针对血清半衰期的可选择的术语包括血衆半衰期、循环半衰期、循环半衰期(circulatory half-life)、血清清除、血衆清除和清除半衰期。待保留的功能性通常选自促凝血、蛋白质水解、辅因子结合、受体结合活性或其它类型的与特定蛋白质相关的生物活性。关于功能性体内半衰期或血浆半衰期的术语“增加的”用于表示多肽的相关半衰期相对于参照分子(例如未修饰的多肽)的半衰期在统计学上得到显著增加，如在可比较的条件下测定的。如本文中所用，术语“表达”是指基因籍以产生生物化学分子例如本发明的支架或其片段的过程。所述过程包括基因在细胞内的功能性存在的任何表现，包括但不限于基因敲低以及瞬时表达和稳定表达。其包括但不限于基因至一种或多种mRNA的转录，以及这样的mRNA至一种或多种多肽的翻译。如果最终的期望产物为生物化学分子，则表达包括生物化学分子和任何前体的产生。
“表达产物”可以是核酸，例如通过基因的转录产生的信使RNA，或多肽。本文中描述的表达产物还包括具有转录后修饰例如磷酸化的核酸，或具有翻译后修饰(例如甲基化、糖基化、脂质的添加、与其它蛋白质亚基的缔合、蛋白水解切割等)的多肽。术语“载体”或“表达载体”在本文中用于指根据本发明用作用于将期望的表达产物引入宿主细胞并且在其中表达的媒介物的载体。如本领域技术人员已知的，此类载体可容易地选自质粒、噬菌体、病毒和腺病毒。一般地，与本发明相容的载体可包括选择标记、适当的限制位点以赋予促进期望的核酸的克隆和进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。术语“宿主细胞”是指具有使用重组DNA技术构建的并且编码至少I个表达产物的载体的宿主细胞。在用于从重组宿主分离表达产物的方法的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用，除非另外明确地指出，否则是指表达产物的来源，即表达产物从“细胞”的回收意指从离心沉淀的完整细胞回收，或从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物回收。 如本文中所用，术语“治疗”或“医治”是指治疗性治疗和预防性或防护性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)受试者不期望的生理变化或病况，例如炎性疾病或病况的进展。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的缓和、疾病程度的减轻、疾病的稳定的(即，未恶化的)状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的好转或缓和以及缓解(无论部分还是完全)，无论可检测的还是不可检测的。术语“医治”也指与当不接受医治时预期的存活时间相比较延长的存活时间。需要医治的人包括已患有病况或障碍的人以及易于患病况或障碍的人或其中将进行病况或障碍预防的人。术语“受试者”、“个体”、“动物”、“患者”或“哺乳动物”是指期望对其进行诊断、预
后或治疗的任何个体、患者或动物，特别地哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家养动物、家畜和动物园动物、运动动物或宠物动物例如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、母牛等。如本文中所用，术语“TRAIL受体”是指结合TRAIL并且当结合TRAIL时，激活肿瘤细胞的程序化细胞死亡(细胞凋亡)的蛋白质。TRAIL受体的非限定性实例包括TRAIL-R2受体。术语“TRAIL R2”或“TRAIL R2受体”在本文中可互换使用，是指全长 TRAIL 受体序列和 Sheridan 等人，Science, 277:818-821(1997) ；Pan 等人，Science, 277:815-818(1997)，美国专利 No. 6，072，047 和 6，342，369 ;PCT 公布No. W098/51793、W098/41629、W098/35986、W099/02653、W099/09165、W098/46643 和W099/11791PCT 公布；Screaton 等人，Curr. Biol. ,7:693-696(1997) ；ffalczak 等人，EMBOJ. , 16:5386-5387(1997) ;Wu 等人，Nature Genetics, 17:141-143 (1997)中描述的受体的可溶性细胞外结构域形式。代表性全长TRAIL受体序列可在GenBank登录号AAC51778. I和014763. 2下获得。术语“TRAIL受体激动剂”或“激动剂”以最广义使用，包括体外、原位或体内部分或完全地增强、刺激或激活TRAIL R2及其生物活性变体的一个或多个生物学活性的任何分子。这样的生物活性的实例包括细胞凋亡以及文献中进一步报导的生物活性。激动剂可以以直接或间接方式起作用。例如，作为引起受体激活或信号转导的其与TRAILR2结合的结果，TRAIL受体激动剂可用于体内、体外或原位部分或完全地增强、刺激或激活一个或多个TRAIL R2受体或一个或多个TRAIL R2受体和其它靶的一种或多种生物学活性。“TRAIL”或“TRAIL多肽”是指结合一个或多个TRAIL受体包括TRAIL R2的配体以及其生物活性片段。代表性TRAIL序列可在GenBank登录号AAH32722. I和P50591. I下获得。片段包括但不限于具有TRAIL多肽序列的约5至约50个氨基酸残基，或约5至约25个，或约10至20个残基，或约12至约20个氨基酸残基的粗略。任选地，TRAIL肽由不超过25个氨基酸残基(例如，25、23、21、19、17、15个或更少的氨基酸残基)组成。术语“细胞凋亡”和“细胞凋亡活性”以广义使用并且是指哺乳动物的细胞死亡的有序或受控形式，其通常伴随特征性细胞变化之一，包括细胞质的凝缩、质膜微绒毛的丧失、细胞核的分裂、染色体DNA的降解或线粒体功能的丧失。该活性可使用本领域公知的方法例如通过细胞活力测定、FACS分析或DNA电泳、对膜联蛋白V的结合、DNA的片段、细胞皱 缩、内质网扩张、细胞片段化和/或膜囊(细胞凋亡小体)的形成来测定和测量。引言TRAIL-R2蛋白由TNF -受体超家族基因的成员编码，并且包含细胞内死亡结构域。在一些情况下，其也被称为 TNFRSF10B、CD262、DR5、KILLER、KILLER/DR5、TRAILR2、TRICK2、TRICK2A、TRICK2B、TRICKB 或 ZTNFR9。该受体可被肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TNFSF 10/TRAIL/AP0-2L)激活，并且转导细胞凋亡信号。此外，TRAIL-R2诱导的细胞凋亡牵涉半胱天冬酶和细胞内适体分子FADD/M0RT1 (Walczak等人EMB0J, (1997)，16，5386-97)。虽然几种类型的正常细胞表达TRAIL R2，但通过该受体的细胞凋亡信号转导似乎主要限制于肿瘤细胞，所述肿瘤细胞在它们通过癌基因例如Myc或Ras的转化的背景中变得对死亡受体介导的细胞凋亡更加易感(Wang等人，Cancer Cell 5:501-12(2004)；Nesterov等人，Cancer Res. 64:3922-7 (2004))。TRAIL-R2频繁地由人癌症细胞系以及原发性肿瘤表达。本发明提供了能够结合TRAIL R2的重组非天然存在的蛋白质支架的家族。具体地，本文中描述的蛋白质可用于显示与抗体可变区的互补决定区(“CDR”)类似的确定的环。可将这些环经历随机化或限制进化以产生能够结合许多靶化合物的多样性。蛋白质可被组装成能够结合TRAIL R2和不同靶的多特异性支架。在具体实施方案中，本发明提供了用于预防、缓解、检测、诊断或监控疾病(例如但不限于癌症)的TRAIL-R2特异性结合剂。在其它具体实施方案中，本发明的TRAIL-R2特异性结合支架对于治疗其中癌细胞表达TRAIL-R2的癌症是有用的。在一些实施方案中，癌症可包括但不限于肺癌、非何杰金氏淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌和多发性骨髓瘤。本发明还提供了使用支架消耗细胞群体的方法。在一个实施方案中，本发明的方法在消耗下列细胞类型中是有用的嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞、单核细胞和肿瘤细胞。本发明的支架为包含衍生自人腱糖蛋白C的第3FnIII结构域的单体支架的多聚体支架，其中，至少一个非天然存在的分子内二硫键已被工程化。组成彼此独立地正确折叠的本发明的多聚体支架的Tn3支架保留它们的结合特异性和亲和力，并且每一个单体支架保持其功能性质。当组成本发明的多聚体支架的Tn3支架被装配在高效价多聚体支架(例如六价或八价支架)中时，彼此独立地正确折叠的单体支架保留它们的结合特异性和亲和力，并且每一个单体支架保留其功能性质。
即使当构建体的拓扑学是非线性时，例如当以复杂分枝结构(例如，Fe融合构建体或抗体样构建体)装配单体Τη3或多聚体Τη3支架时，多聚体Τη3支架，包括高效价支架(例如，六价或八价)，仍然正确折叠。天然FnIII结构域例如人纤连蛋白(IOFnIII)的第IOFnIII结构域和绝大部分天然存在的FnIII结构域不包含二硫键或游离半胱氨酸。当通过引入多个半胱氨酸对多结构域蛋白质进行工程改造时，蛋白质表达的缺乏、所得蛋白质的沉淀或非功能性蛋白质的产生是普遍事件。这类有害作用归因于导致不正确的蛋白质折叠的分子内结构域内和/或结构域间二硫键的不正确形成，和/或分子间二硫键的不正确形成。当半胱氨酸和/或蛋白质结构域的数目增加时，这些作用通常增强。例如，包含8个野生型Τη3支架(SEQ ID NO: I)的线性多聚体支架可沿着单个多肽氨基酸序列包含16个半胱氨酸。在另一个示例性实施方案中，包含4个Τη3模块(其中两个Τη3模块连接于IgG重链并且两个Τη3连接于IgG轻链)的抗体样构建体可包含分布在4个不同的多肽链间的8个半胱氨酸。本发明的多聚体支架，例如包含4、6或8个线性Τη3模块，包含这样的数目的半胱氨酸和这样的结构复杂性的多聚体支架，正确折叠并且当与它们各自的单体相比较时显示增强的稳定性和靶结合性质。当以高效价多聚体形式装配包含一个或多个工程二硫键的Τη3支架时，每一个个体单体支架正确折叠，从而保留其结合特异性和亲和力，以及其功能性质。此外，单体支架能够形成稳定的、功能性的和正确折叠的多聚体支架。本发明的多聚体支架的有利方面是它们结合多个表位的能力，例如⑴结合单个革巴中的多个表位，(ii)结合多个祀中的单个表位，(iii)结合位于一个祀的不同亚单元上的多个表位或(iv)结合多个靶上的多个表位，从而增强亲合力。此外，归因于多聚体支架的柔性和通过接头改变多个Tn3单体之间的距离的可能性，多聚体Τη3支架能够在表面上(在相同细胞/表面上或在不同细胞/表面上)结合多个革El分子。作为它们同时结合超过一个靶的能力的结果，可将本发明的多聚体支架用于调节多个途径、交叉连接细胞表面上的受体、结合分离的细胞上的细胞表面受体和/或将靶分子或细胞结合至基质。根据FnIII结构域的先前序列分析，可在BC和FG环中看到大的变异，这表明这些环对于稳定性不是至关重要的(参见，例如，PCT公布No:WO 2009/058379)。本发明提供了具有增强的稳定性的Τη3支架，其在氨基酸序列上可变化但包含具有比人糖腱生蛋白C的第3FnIII的相应FG环的长度短的长度的FG环。已观察到缩短FG环导致具有增强的稳定性的突变型Tn3支架。因此，本发明的另一个方面提供了具有增强的蛋白质稳定性的野生型Τη3支架的变体(SEQ ID NO: I)。在某些实施方案中，本发明的Τη3单体支架包含具有9个氨基酸和与包含人腱糖蛋白C的天然第三FnIII结构域的支架(该支架具有10个氨基酸的FG环长度)相比较增强的稳定性的FG环。此外，本发明提供了具有指定的FG环长度的各种Τη3支架的文件，所述文库用于分离具有增强的稳定性的Tn3支架。此外，本发明提供了可结合TRAIL R2和一个或多个另外的靶的多特异性支架，其中支架对特定靶的亲和力通过突变进行了调节的亲和力成熟支架以及其在动物物种间的免疫原性和/或交叉反应通过突变进行了调节的支架。同样地，本发明还提供了产生本发明的支架的方法以及工程化具有期望的物理化学、药理学或免疫学性质的支架的方法。此夕卜，本发明还提供了此类支架和方法用于治疗性、预防性和诊断性应用的用途。FnIII结构基序本发明的Tn3支架基于III型纤连蛋白模块(FnIII)(广泛地发现于活病毒的所有三个结构域间和众多蛋白质种类中的结构域)的结构。在具体实施方案中，本发明的支架衍生自人生腱蛋白C的第三FnIII结构域(SEQID Ν0:4)。在一个具体实施方案中，本发明的支架包含Τη3模块。该结构域的总体三维折叠与最小的功能性抗体片段重链的可变区(VH)的总体三维折叠密切相关，骆驼和美洲骆·驼(例如，骆马(llamas))的单结构域抗体中的所述片段包含完整的抗原识别单元。本发明的Tn3单体支架和来自腱糖蛋白C的天然FnIII结构域的特征在于相同的三维结构，即在一侧上有3个β链(A、B和E)和在另一侧上有4个β链((、04和6)通过6个环区域连接的β-夹层结构。根据连接至每一个环的N和C端的β链命名这些环区域。因此，AB环位于β链A与B之间，BC环位于β链B与C之间，⑶环位于β链C与D之间，DE环位于β链D与E之间，EF环位于β链E与F之间，FG环位于β链F与G之间。FnIII结构域具有耐受随机化的溶剂暴露环，这有利于产生能够以高亲和力结合特定靶的蛋白质支架的多样性库(diverse pool)。在本发明的一个方面，Tn3结构域用作支架，将所述支架经历被设计来随机化一个或多个环的定向进化，所述环与抗体可变区的互补决定区(CDR)类似。这样的定向进化法导致对于目标靶例如TRAILR2具有高亲和力的抗体样分子的产生。此外，在一些实施方案中，本文中描述的支架可用于显示确定的暴露环(例如，先前被随机化的并且基于靶结合选择的环)以指导结合这类引入的环的分子的进化。可进行该类型的选择以鉴定任何单个CDR-样环的识别分子或者，可选择地用于识别组合入非线性表位结合部分的两个或所有三个CDR样环的识别分子。在一些实施方案中，本发明的支架是基于PCT公布No. W02009/058379中描述的人生腱蛋白C的第三FnIII结构域的结构基序的分子。一组3个环(命名为BC、DE和FG)(所述环可赋予特异性靶结合)分别分布在B与C链之间、D与E链之间以及F与Gi3链之间。人生腱蛋白C的第三FnIII结构域的环BC、DE和FG环分别为9、6和10个氨基酸长。这些环的长度落在在抗体重链中发现的关联抗体-识别环的狭窄范围内，即，在长度上分别为7-10、4-8和4-28个氨基酸。类似地，第二组环ABXD和EF环(在长度上分别为7、7和8个氨基酸)分布在A与Ββ链之间、C与Di3链之间以及E与Fi3链之间。在随机化和选择对靶的高亲和力结合后，Tn3结构域中的环可使得与靶的接触等同于抗体中的关联CDR环的接触。因此，在一些实施方案中，随机化AB、CD和EF环，然后选择其对一个或多个靶例如TRAIL R2的高结合亲和力结合。在一些实施方案中，可与BC、DE和FG环的随机化平行地进行该随机化和选择过程，然而在其它实施方案中，连续地进行该随机化和选择过程。
本发明的单体支架本发明提供了重组非天然存在的FnIII支架，其包含连接于多个环区域的多个β链结构域，其中所述环区域的一个或多个通过从野生型Tn3 (SEQ ID NO: I)的关联环缺失、置换或添加至少I个氨基酸而变化。为了具有新型结合特征的改进的Tn3分子，可将野生型Tn3经历氨基酸添加、缺失或置换。应当理解，当将改进的支架的序列与Τη3的序列相比较时，使用相同的β链和环的定义。可使用人腱 糖蛋白C的第3FnIII结构域、野生型Tn3支架或先前的改进的Τη3支架产生改进的Τη3支架。在一些实施方案中，本发明的单体支架包含氨基酸序列IEV (Xab) nALITff (Xbc) ^ELX1YGI (Xcd) nTTIDL (Xde) nYSI (Xef) JEVSLIC (Xfg) nKETFTT，其中XAB、XBC、Xcd> Xde> Xef和Xrc分别代表存在于AB、Be、CD、DE、EF和FG环中的氨基酸残基，其中X1代表氨基酸残基A或T，并且其中n=2-26。在一个实施方案中，Xab由SEQ ID NO:35组成。在一个实施方案中，Xbc由SEQ IDNO:36组成。在一个实施方案中，Xm由SEQ IDNO:37组成。在一个实施方案中，Xde由SEQID NO:38组成。在一个实施方案中，Xef由SEQ ID NO:39组成。在一个实施方案中，Xfg由SEQ ID NO:40 组成。在一个实施方案中，Xffi包含SEQ ID NO: 35。在一个实施方案中，Xbc包含SEQ IDN0:36。在一个实施方案中，Xm包含SEQ ID N0:37。在一个实施方案中，Xde包含SEQ IDN0:38。在一个实施方案中，Xef包含SEQ ID N0:39。在一个实施方案中，XFe包含SEQ IDN0:40。在某些实施方案中，Xab由SEQ ID NO: 35组成，Xm由SEQ IDNO: 37，且Xef由SEQID NO:39组成。在一个实施方案中，Xbc由SEQ ID NO:36组成，Xde由SEQ ID NO:38组成，且 Xfg 由 SEQ ID NO: 40 组成。在某些实施方案中，Xab包含SEQ ID NO: 35，Xm包含SEQ ID NO: 37，且Xef包含SEQID NO: 39。在一个实施方案中，Xbc包含SEQ ID NO: 36, Xde包含SEQ ID NO: 38，且Xrc包含SEQ ID NO:40。在一些实施方案中，本发明的单体支架包含Tn3模块。在其它实施方案中，本发明的支架包含Τη3模块(SEQ ID NO: I)，其中人生腱蛋白C的第三FnIII结构域的β链C(SEQID NO ；4)被包含N末端半胱氨酸的变体β链C(SEQ ID N0:45或SEQ ID NO :131)替代并且其中人生腱蛋白C的第三FnIII结构域的β链F(SEQ ID NO:48)被包含C末端半胱氨酸的变体β链F(SEQ ID NO:49)替代。在一些实施方案中，本发明的支架包含Tn3模块，其中除C和F β链(分别地SEQ ID Ν0:45或131和SEQ ID NO:49)中的半胱氨酸残基不可被置换外，一个或多个β链包含至少I个氨基酸置换。可对连接本发明的支架的多个β链的环的长度和/或序列多样性进行随机化。在一个实施方案中，本发明的支架具有至少I个对其长度和/或序列多样性进行随机化的环。在一个实施方案中，可对支架的至少I个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个环的长度和/或序列多样性进行随机化。在一个实施方案中，使本发明的支架的至少I个环保持恒定同时对至少I个另外的环的长度和/或序列多样性进行随机化。在另一个实施方案中，使环ABXD和EF的至少I个、至少2个或全部3个保持恒定，同时对环BC、DE和FG的至少I个、至少2个或全部3个的长度或序列多样性进行随机化。在另一个实施方案中，对环AB、⑶和EF的至少I个、至少2个或全部3个进行随机化，同时对环BC、DE和FG的至少I个、至少2个或全部3个的长度或序列多样性进行随机化。在另一个实施方案中，对环ABXD、EF、BC、DE和FG的至少I个、至少2个、至少3个、至少4、至少5个或全部6个的长度或序列多样性进行随机化。在一些实施方案中，使环内的一个或多个残基保持恒定，同时对其它残基的长度和/或序列多样性进行随机化。在一些实施方案中，使环内的一个或多个残基保持预定的有限数目的不同氨基酸，同时对其它残基的长度和/或序列多样性进行随机化。因此，本发明的支架可包含一个或多个具有简并共有序列和/或一个或多个不变体氨基酸残基的环。在一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的AB环K-X-X-X-X-X-a，其中X代表天冬酰氨、天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨 酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸，并且其中(a)代表丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在另一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的AB环K-X-X-X-X-X-X-X-a，其中X代表天冬酰氨、天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸，并且其中(a)代表丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在另一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的BC环S-X-a-X-b-X-X-X-G，其中X代表任意氨基酸，其中(a)代表脯氨酸或丙氨酸并且其中(b)代表丙氨酸或甘氨酸。在另一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的BC环S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G，其中X代表任意氨基酸，并且其中(c)代表脯氨酸、丝氨酸或甘氨酸。在另一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的BC环A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G，其中X代表任意氨基酸，其中(d)代表脯氨酸、谷氨酸或赖氨酸，其中(e)代表天冬酰胺或甘氨酸，并且其中(f)代表丝氨酸或甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的⑶环Xn，其中X代表任意氨基酸，并且其中n=6、7、8、9或10。在另一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的CD环Xn，其中X代表天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸，并且其中n=7、8或9。在一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的DE环x-x-x-x-x-x，其中X代表任意氨基酸。在一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的EF环X-b-L-X-P-X-c-X，其中X代表天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸，其中(b)代表天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸，并且其中(c)代表异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的FG环X-a-X-X-G-X-X-X-b，其中X代表任意氨基酸，其中(a)代表天冬酰胺、苏氨酸或赖氨酸，并且其中(b)代表丝氨酸或丙氨酸。在另一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的FG环X-X-X-X-X-X-X-X-X (X9)，其中X代表任意氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的FG环X-a-X-X-X-X-b-N-P-A，其中X代表任意氨基酸，其中(a)代表天冬酰胺、苏氨酸或赖氨酸，并且其中(b)代表丝氨酸或甘氨酸。在具体的实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的FG环X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A，其中X代表任意氨基酸，并且其中(a)代表天冬酰胺、苏氨酸或赖氨酸。在某些实施方案中，本发明的支架包含被认为比人腱糖蛋白C的第三FnIII结构域的关联FG环短至少I个氨基酸残基并且在一个或多个位置上被进一步随机化的FG环。在具体的实施方案中，环BC、DE和FD的至少I个被随机化，其中Αβ链包含SEQID NO:41 或 42，Ββ 链包含 SEQ ID NO:43，链包含 SEQ ID NO:44， β 链包含 SEQ IDNO: 46，E β 链包含 SEQ ID NO: 47，FP 链包含 SEQ ID NO: 48、49、50 或 51 且 G β 链包含 SEQID NO: 52 或 53，AB 环包含 SEQ ID NO: 35，CD 环包含 SEQ ID NO: 37，且 EF 环包含 SEQ IDΝ0:39。在其它具体的实施方案中，环AB、⑶和EF的至少I个被随机化，其中A β链包含 SEQ ID NO: 41 或 42，B β 链包含 SEQ ID NO: 43，CP 链包含 SEQ ID NO: 44 或 45，DP 链包含 SEQ ID Ν0:46，Εβ 链包含 SEQ ID N0:47, 链包含 SEQ ID Ν0:48、49、50 或 51，以及
链包含 SEQ ID NO:52 或 53，BC 环包含 SEQ ID NO:36，DE 环包含 SEQ ID NO:38 以及 FG环包含 SEQ ID NO:40。增强的支架稳定性非天然存在的二硫键本发明的Τη3支架的稳定性可通过许多不同的方法来增强。在一些实施方案中，本发明的支架通过延伸N和/或末端区域来稳定。N和/或C末端区域可被延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个氨基酸。在其它实施方案中，本发明的Τη3支架可通过引入增加血清半衰期的改变来稳定，如本文中所描述的。在另一个实施方案中，本发明的Τη3支架包含至少I个氨基酸残基的添加、缺失或置换来稳定支架的疏水核。本发明的Τη3支架可通过工程化非天然二硫键来进行有效地稳定。这样的工程支架可有效地表达为多聚体支架的部分。二硫键的正确形成和工程支架的正确折叠通过支架的生物活性的保持得到证明。包含非天然二硫键的工程支架可同时结合至少2个靶(参见，例如，实施例8)或三个靶(参见，例如，实施例12)的事实提供了支架的三维结构未被工程二硫键显著改变并且靶结合环的相对位置得到保持的证据。在一些实施方案中，本发明的支架包含非天然存在的二硫键，如PCT公布No. WO 2009/058379中所描述的。可利用生物信息学方法来鉴定适用于工程二硫键的候选位置。在一个实施方案中，本发明的Τη3单体支架包含至少I个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个非天然存在的分子内二硫键。在具体的实施方案中，本发明提供了获得与包含2、3、4或更多个工程分子内二硫键的人腱糖蛋白C的第三FnIII结构域相比较具有增强的稳定性的Τη3支架的方法。在一个实施方案中，本发明的Τη3单体支架包含至少一种非天然存在的分子内二硫键，其中所述至少一种非天然存在的二硫键稳定单体支架。在另一个实施方案中，本发明的多聚体支架包含至少I个非天然存在的二硫键，其中所述键位于相同多聚体支架的两个不同的单体支架之间。在另一个实施方案中，本发明的支架包含至少I个非天然存在的二硫键，其中所述键位于两个不同的多聚体支架之间。即，二硫键为分子间二硫键。例如，二硫键可连接不同的支架(例如，两个分离的Tn3单体、分离的Τη3单体支架和多聚体支架或两个多聚体支架)、Τη3支架和接头、Τη3支架和Fn结构域，或Τη3支架和抗体或其片段。在一些实施方案中，本发明的支架包含至少I个非天然存在的连接支架与分离的异源部分、支架与融合或缀合于相同支架的异源部分或支架与融合或缀合于不同支架的异源部分的分子间二硫键。在一些实施方案中，本发明的支架包含形成至少2个、至少3个、至少4或更多个支架的多聚体支架的二硫键。在另一个实施方案中，本发明的支架可包含N和/或C末端区域的延伸。在一个实施方案中，本发明的支架包含改变以延长血清半衰期，如本文中所描述的。在另一个实施方案中，本发明的支架包含至少I个氨基酸残基的添加、缺失或置换以稳定支架的疏水核心。在具体的实施方案中，本发明的支架包含至少一个天然存在的分子内二硫键，其中Αβ链结构域包含SEQ ID Ν0:42,Ββ链包含SEQ ID NO:43，CP链包含SEQ ID NO:45， β 链包含 SEQ ID NO:46，Εβ 链包含 SEQ ID NO:47，链包含 SEQ ID NO:49 且链·包含 SEQ ID NO:52。在具体的实施方案中，本发明的支架包含至少I个非天然存在的分子内二硫键，其中Αβ链结构域由SEQ ID Ν0:42组成，Ββ链由SEQ ID Ν0:43组成，链由SEQ IDNO:45 组成， β 链由 SEQ ID NO:46 组成，Εβ 链由 SEQ ID NO:47 组成，链由 SEQ IDNO:49组成，且GP链由SEQ ID NO:52组成。在具体的实施方案中，本发明的支架包含至少I个非天然存在的分子内二硫键，其中Αβ链结构域基本上由SEQ ID NO:42组成，Ββ链基本上由SEQ ID NO:43组成，
链基本上由SEQ ID NO:45组成， β链基本上由SEQ ID NO:46组成，Εβ链基本上由SEQID NO:47组成，Fβ链基本上由SEQ ID NO:49组成，且GP链基本上由SEQ IDNO:52组成。增强的支架稳定性FG环长度本发明人已发现FG环的长度在Tn3支架的稳定性中起着重要作用。具体地，包含非天然存在的变体FG环(其比FOI的FG环中发现的长度短至少I个氨基酸)Τη3支架经显示具有增强的稳定性。在某些实施方案中，本发明的支架包含比人腱糖蛋白C的第三FnIII结构域的FG环短至少I个氨基酸残基的非天然存在的变体FG环。在具体的实施方案中，通过FG环中缺失至少I个氨基酸来增强Τη3支架的稳定性。在另一个实施方案中，可通过在FG环中缺失至少I个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个或至少10个氨基酸来增强Τη3支架的稳定性。特别地预期已稳定的Τη3支架可包含至少I个非天然存在的二硫键。在某些实施方案中，Τη3支架变体还包含已对其长度和/或序列进行随机化的至少I个环，(即AB、BC、⑶、DE、EF和/或FG)。特别地预期Tn3支架变体可包含至少I个非天然存在的~■硫键。在某些实施方案中，Τη3支架变体包含比野生型Τη3支架的FG环短至少I个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或至少10个氨基酸残基的FG环，其中Τη3支架变体还包含至少I个氨基酸置换。稳定性测量
分离的或作为多聚体支架的部分的已稳定的本发明的FnIII支架的稳定性的增强可容易地利用本领域已知的技术来测量，例如热(Tni)和离液序列高的变性(chaotropicdenaturation)(例如利用尿素或胍盐的处理)、蛋白酶处理(例如利用嗜热菌蛋白酶的处理)或另一种本领域接受的测定蛋白质稳定性的方法。用于测量蛋白质稳定性的技术的综述可见于例如 John Wiley 和 Sons. 2007 的"Current Protocols in Molecular Biology"和〃Current Protocols in Protein Science〃中。多聚体支架本发明的一个方面提供了包含至少2个以串联形式连接的本发明的Tn3单体支架的多聚体支架。可以以多个形式装配此类多聚体支架。在一些实施方案中，以线性形式装配单体支架，然而在其它实施方案中，以分枝形式装配支架(参见，例如，图I)。在特定方面，本发明提供了多聚体支架，其中至少2个Τη3支架通过肽接头串联连接。在一些实施方案中，本发明的多聚体支架中的Τη3支架结合TRAILR2，然而第二 Τη3支架结合不同的靶，从而显示多个功能，和/或结合相同的靶，从而增加靶结合的效价和/或亲合力、靶的其它作用。在一些实施方案中，当多个支架结合相同祀时，实现了祀结合的效价和/或亲合力的增加。 在一些实施方案中，效价的增加增强了对靶的特异性作用，例如增加靶蛋白质的二聚化。在具体的实施方案中，本发明的多聚体支架包含至少2个串联连接的本发明的Τη3单体支架,其中每一个Τη3支架结合至少I个祀,并且其中每一个Τη3支架包含连接于多个环区域的多个β链，其中至少I个环为野生型Τη3结构域中的关联环的非天然存在的变体。多聚体串联支架在一个实施方案中，本发明的多聚体支架包含2、3、4、5、6、8个或更多个本发明的Τη3单体支架。在一些实施方案中，一些Τη3单体支架以串联形式连接。在另一个实施方案中，一些Τη3单体支架以串联形式连接并且一些Τη3单体支架不以串联形式连接。在具体的实施方案中，本发明的多聚体支架包含2个或3个或4个或5个或6个或7个或8个或9个或10个或更多个串联连接的本发明的支架(参见，例如，图I和图2)。在一个实施方案中，多聚体支架通过Τη3单体支架之间的共价结合，例如直接连接Τη3支架或通过包含接头例如肽接头来产生。在具体的实例中，通过构建编码单体Τη3支架的融合基因或可选择地通过将半胱氨酸残基的密码子工程化到单体Τη3支架中(且能够在表达产物之间形成二硫键)来产生共价结合的支架。在一个实施方案中，本发明的多聚体支架包含至少2个彼此直接连接而无任何另外的间插氨基酸的Τη3支架。在另一个实施方案中，本发明的多聚体支架包含至少2个通过接头例如肽接头串联连接的Τη3支架。在具体的实施方案中，本发明的多聚体支架包含至少2个通过肽接头串联连接的Τη3支架，其中肽接头包含I至约1000或I至约500或I至约250或I至约100或I至约50或I至约25个氨基酸。在具体的实施方案中，本发明的多聚体支架包含至少2个通过肽接头串联连接的Τη3支架，其中肽接头包含I至约20或I至约15或I至约10或I至约5个氨基酸。在具体的实施方案中，本发明的多聚体支架包含至少2个通过接头例如肽接头串联连接的Τη3支架，其中接头为功能性部分。基于多聚体支架的期望的功能和/或特征选择功能性部分。例如，用于纯化的功能性部分(例如，组氨酸标记物)可用作接头。用作接头的功能性部分包括但不限于聚乙二醇(PEG)、细胞毒素剂、放射性核素、成像剂、生物素、二聚化结构域、人血清白蛋白(HSA)或其FcRn结合部分、抗体的结构域或片段、单链抗体、结构域抗体、 白蛋白结合结构域、IgG分子、酶、配体、受体、结合肽、非-Tn3支架、附加表位、重组多肽聚合物、细胞因子等。可用作功能性接头的具体肽接头和功能性部分公开于下文中。在一些实施方案中，多聚体Τη3支架包含至少2个通过一个或多个接头连接的Τη3支架，其中间插在每一个Τη3支架之间的接头可以是相同的接头或不同的接头。在一些实施方案中，接头可包含多个接头，其可以是相同的接头或不同的接头。在一些实施方案中，当串联多个接头时，一些或所有接头可以是功能性部分。多聚体支架的结合化学计量学在一些实施方案中，多聚体Τη3支架包含对于TRAIL R2是特异性的支架。在其它实施方案中，本发明的多聚体支架包含对于不同表位是特异性的支架，所述表位可以是TRAIL R2上或不同靶上的不同表位。在具体的实施方案中，多聚体Tn3支架可结合相同TRAIL R2分子上的两个或更多个不同表位(例如，非-重叠表位)。在另一个具体的实施方案中，多聚体Tn3支架可结合TRAIL R2上的两个或更多个表位。在另一个具体的实施方案中，多聚体Tn3支架结合TRAILR2上的两个或更多个不同的表位以及另外地，结合一个或多个不同靶分子上的至少I个表位。在另一个具体的实施方案中，多聚体Tn3支架可结合TRAIL R2 二聚体上的相同表位。在另一个实施方案中，多聚体Tn3支架可结合至少两个TRAIL R2分子上的相同表位。在某些实施方案中，多聚体Tn3支架可结合相邻细胞表面上的两个或更多个拷贝的TRAIL R2分子上的相同表位。在一些实施方案中，多聚体Tn3支架可以以相同或不同的结合亲和力和/或亲合力结合TRAIL R2上或不同靶中的相同表位或不同表位。在另一个实施方案中，多聚体Tn3支架中的单体支架可按照设计来获得或增强(例如，协同地)期望的对靶的作用(例如靶二聚化)的特定结合模式结合一个或多个拷贝的TRAIL R2上的表位。例如，线性多聚体支架中的Tn3支架可按照一定的模式结合单个TRAIL R2或或多个TRAIL R2，例如6个模块的线性多价支架中的Tn3支架可按照AAABBB模式、AABBAA模式、ABABAB模式、AAAABB模式等结合两个TRAIL R2靶A和B ;按照AABBCC模式、ABCABC模式和ABCCBA模式等结合3个靶；按照ABCDDA模式、ABCADA模式等结合4个靶；等。此外，当多聚体本发明的支架包含多个工程(例如，二硫硫键工程、环工程、或二硫键工程和环工程两者)和非工程支架，可按照特定模式排列这样的单体支架以获得或增强特定生物效应。可组合地装配单体Tn3支架的此类组合，随后使用本领域已知的方法进行评价。在一些实施方案中，以分枝结构形式存在的多聚体Τη3支架，例如以Fe融合或抗体样形式存在的多聚体支架，还可结合单个TRAILR2或按照特定模式结合多个TRAIL R2。例如，在某些实施方案中，融合于抗体样形式的Tn3多聚体支架的IgG重链的线性形式的Τη3支架可结合第一靶，然而融合于抗体样形式的Τη3支架中的IgG轻链的多价Τη3线性支架可结合第二靶。在另一个实施方案中，融合于抗体样形式的Τη3支架的IgG重链的线性形式的Τη3支架可以以特定的亲和力结合靶，然而融合于抗体样形式的支架的IgG轻链的线性形式的支架可以以不同的亲和力结合相同靶。在一些实施方案中，融合于抗体的“Y”的左臂的链的Tn3支架可结合第一靶，然而融合于抗体的“Y”的右臂的链的Τη3支架可结合第二靶。融合本发明提供了包含至少2个Τη3单体支架的多聚体Τη3支架，然而可将至少一个Τη3单体支架融合于异源部分。在本说明书中，不将异源部分用作间隔子来连接支架，但可给多聚体Τη3支架提供额外的功能性。例如，在一些实施方案中，可将结合TRAIL R2的多聚体Tn3支架融合于细胞毒素剂以有利于特定靶细胞的杀伤。在一些实施方案中，异源部分可用作接头。本发明包括缀合于或融合于一个或多个异源部分的多聚体Τη3支架的用途，所述异源部分包括但不限于肽、多肽、蛋白、融合蛋白、核酸分子、小分子、模拟剂(mimeticagent)、合成药物、无机分子和有机分子。本发明包括重组地融合于或化学地缀合于异源蛋白质或多肽或其片段的多聚体Tn3支架的用途。缀合包括共价和非共价缀合。在一些实施方案中，可将多聚体Τη3支架融合于或化学缀合于至少10、至少20、至少30、至少40、至少·50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少500或至少1000个氨基酸的多肽以产生融合蛋白。多聚体Τη3支架至一个或多个异源部分的融合或缀合可以是直接的，即无间插在Τη3支架与异源部分之间的接头，或通过本文中描述的接头序列进行的。在一些实施方案中，通过将Τη3支架融合或缀合于对于靶细胞的特定细胞表面受体例如TRAIL R2是特异性的抗体，支架可用于在体外或体内将异源多肽靶向特定细胞类型。融合于或缀合于异源多肽的多聚体Tn3支架还可用于体外免疫测定和使用本领域已知的方法的纯化法。参见，例如，国际公布 No. WO 93/21232 ;欧洲专利 No. EP 439，095 ；Naramura 等人 Immunol.Lett. 39:91-99，1994 ;美国专利 No. 5，474，981 ；Gillies 等人，PNAS 89:1428-1432，1992 ；和Fell等人，J. Immunol. 146:2446-2452, 1991，将所述文献通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，可通过将多聚体Tn3支架与免疫球蛋白或其结构域(包括但不限于IgG的恒定区(Fe))融合或缀合(例如，通过N或C端)来使支架与人免疫反应结合。类似地，支架与补体蛋白例如例如CIq之间的融合可用于靶向细胞。多聚体Τη3支架与毒素之间的融合可用于特异性破坏携带本文中描述的特定抗原的细胞。各种出版物描述了用于获得其半衰期可通过将FcRn-结合多肽引入分子来进行改变的生理活性分子的方法(参见，例如，WO 97/43316;美国专利No. 5，869，046;美国专利No. 5，747，035 ;W0 96/32478和WO 91/14438)，通过将分子与其FcRn-结合亲和力可得到保留但对于其它Fe受体的亲和力已被大大减小的抗体融合(参见，例如，W099/43713)，或通过将分子与抗体的FcRn结合结构域融合(参见，例如，WO 00/09560 ;美国专利No. 4，703，039)。增加生理活性分子的半衰期的具体技术和方法还可见于美国专利No. 7，083，784。具体地，预期可将多聚体Tn3支架融合于来自IgG的Fe区域，其中Fe区域包含氨基酸残基突变M252Y/S254T/T256E或H433K/N434F/Y436H，其中按照氨基酸Kabat编号方案命名位置。在一些实施方案中，可通过将多价Τη3支架与本质上无特定结构的重组多肽(例如，ΧΤΕΝ 多肽)基因融合或通过与聚乙二醇(PEG)缀合来增加多聚体Tn3支架的半衰期。在一些实施方案中，可将多聚体Τη3支架与增加或延长体内或血清半衰期的分子融合。在一些实施方案中，可将支架与白蛋白例如人血清白蛋白(HSA)、其新生儿Fe受体(FcRn)结合片段、PEG、多糖、抗体、补体、血红蛋白、结合肽、脂蛋白及其它因子融合或缀合以增加其在血流中的半衰期和/或其组织穿透力。可利用标准技术，例如通过从使用公共可获得的基因序列构建的重组融合基因表达融合蛋白来产生这些融合的任何融合。此外，可将本发明的支架融合于标记序列例如帮助纯化的肽。在一些实施方案中，标记氨基酸序列为多组氨酸肽(His-标记物)，例如八组氨酸-标记物(His-8-标记物)或六组氨酸-标记物(His-6-tag)例如PQE表达载体(QIAGEN, Inc. , 9259EtonAvenue, Chatsworth, Calif,91311)中提供的标记物，除其它载体外，所述载体中的许多载体是商购可得的。如 Gentz 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824，1989 中所描述的，例如，多组氨酸提供了融合蛋白的方便纯化。用于纯化的其它肽标记物包括但不限于血凝素(〃HA〃)标记物(其相应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(参见，例如，Wilson等人，Cell 37:767, 1984))、FLAG标记物、Strep-标记物、myc-标记物、V5标记物、GFP-标记物、AUl-标记物、AU5-标记物、ECS-标记物、GST-标记物或OLLAS标记物。 可通过基因改组、基因改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)产生包含本发明的支架的另外的融合蛋白。可将DNA改组用于改变Tn3支架对靶的作用(例如，产生具有更高亲和力和更低解离速率的支架，或具有增强二聚化TRAIL R2的能力的支架)。可通过在重组之前利用易错PCR、随机核苷酸插入或其它方法进行随机诱变来改变Tn3支架。可将编码结合特定靶的支架的多核苷酸的一个或多个部分与一个或多个异源分子的一个或多个组分、基序、区段、部分、结构域、片段等组合。抗体-样多聚体支架在一些实施方案中，本发明的多聚体支架包含至少2个Τη3支架，其中将至少一个Τη3支架融合于抗体(例如，IgG)的结构域或片段，包括但不限于完整抗体、抗体可变结构域、CHl结构域、C K结构域、C λ结构域、Fe结构域、CH2或CH3结构域。在一些实施方案中，可将Τη3支架融合于抗体的结构域或片段。抗体的结构域或片段还可通过类似于下文中描述的Fe结构域提供二聚化或多聚化结构域(其有利于本发明的多聚体支架的形成)来增强多聚体支架的亲合力和/或亲和力。此外，抗体的结合域或片段可进一步增强支架对靶的作用，例如更高效地二聚化或多聚化靶。在一些实施方案中，仅将一个包含2个Τη3结构域的多聚体Τη3串联支架缀合于或融合于抗体的结构域片段。例如，可将单个多聚体串联支架融合于抗体的结构域或片段(例如，抗体的重链或轻链)的多肽的N端。在一些实施方案中，通过将一个或多个Τη3支架融合或缀合于抗体的结构域或片段(例如，抗体的重链和/或轻链)的多肽的N端和/或C端来产生多聚体Τη3支架。在一些实施方案中，一些或所有融合于抗体的结构域或片段的Τη3支架是相同的。在一些其它实施方案中，一些或所有融合于抗体的结构域或片段的Τη3支架是不同的。在一些实施方案中，用于产生抗体样多价Τη3支架的串联Τη3支架可包含相同数目的Τη3模块。在其它实施方案中，用于产生抗体样多价Τη3支架的串联Τη3支架可包含不同数目的Τη3模块。例如，可以例如通过将线性形式的四价Τη3支架融合于单个位置，或通过将一个Τη3单体支架融合于一个位置并且将三聚体线性形式的Τη3支架融合于另一个位置，或通过将两个二聚体Tn3线性形式的支架融合于两个不同的位置，或通过融合4个Τη3单体支架(每一个支架融合于单个位置)来形成四价Τη3支架。在具体的实施方案中，本发明的多聚体Τη3支架包含4个融合于抗体的结构域或片段的多价体线性Τη3支架，其中每一个多聚体线性Τη3支架包含2个通过接头串联连接的Τη3单体支架(图I)。在其它实施方案中，本发明的多聚体Τη3支架包含至少I个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个融合于抗体的结构域或片段的本发明的单体或多聚体Τη3支架。在一个具体的实施方案中，可通过将一个Τη3支架融合于抗体的结构域或片段的轻链和重链的每一个的N端来产生四价Τη3支架(参见，例如，图2中的Α9构建体)。可通过将Τη3支架的任何组合融合于抗体或经修饰的抗体的结构域或片段来产生抗体样形式的多价Τη3支架。经修饰的抗体的实例包括缺失结构域的抗体、微小抗体(参见，例如，美国专利No. 5，837，821)、四价微小抗体、四价抗体(参见，例如，Coloma&Morrison, Nature Biotechnol. 15:159-163，1997 ;国际公布 No.TO 95/09917)、热稳定的抗体、人源化抗体等。用于产生根据图I的抗体样多价Tn3支架的本发明的线性支架的每一个Tn3支架可包含相同的接头和接头分布或不同的接头或不同的接头分布。Fe-融合多聚体支架在一些实施方案中，本发明的多聚体Τη3支架包含多个连接于Fe结构域的单体或多聚体Τη3支架。多聚体本发明的Τη3支架与包含Fe结构域的抗体片段的融合通过提供有助于多聚体FnIII支架的二聚体形成的二聚化结构域进一步增强了多聚体Τη3支架的亲合力和/或活性。在一些实施方案中，仅将一个多聚体Τη3支架融合于Fe结构域。在具体的实施方案中，本发明的多聚体Τη3支架包含2个融合于Fe结构域的多聚体Τη3支架，其中每一个多聚体Τη3支架包含2个或更多个通过一个或多个接头连接的Τη3支架(图I)。在一个具 体的实施方案中，融合于Fe结构域的多聚体Τη3支架为线性形式的支架。在一个具体的实施方案中，将2个串联包含2个Τη3结构域的线性形式的Τη3支架融合于Fe结构域以产生效价为4的多聚体Τη3支架(参见，例如，图2中的Α7构建体)。在另一个具体的实施方案中，将两个线性形式的支架(其每一个包含4个Τη3单体支架)融合于Fe结构域以产生效价为8的多聚体Τη3支架(参见，例如，图2中的Α8构建体)。I在一些实施方案中，融合于Fe结构域的Τη3支架包含相同数目的Τη3模块。在一些实施方案中，融合于Fe结构域的Τη3支架包含不同数目的Τη3模块。在一些实施方案中，融合于Fe结构域的Τη3支架包含相同的接头。在其它实施方案中，融合于Fe结构域的Τη3支架包含不同的接头。在一些实施方案中，可通过使用有利于异二聚体形成的Fe结构域突变来二聚化本发明的不同多聚体Τη3支架。已知Fe区域的变体(例如，氨基酸置换和/或添加和/或缺失)增强或消除了抗体的效应子功能并且可改变抗体的药代动力学性质(例如，半衰期)。因此，在某些实施方案中，本发明的多特异性Τη3支架包含Fe结构域，所述结构域包含其中已在Fe区域产生一个或多个改变以改变多聚体Τη3支架的功能和/或药代动力学性质的改变的Fe区域。
还已知可改变Fe区域的糖基化以增强或减弱效应子功能和/或抗炎活性。因此，在一个实施方案中，本发明的多聚体FnIII支架的Fe区域包含改变的氨基酸残基的糖基化以改变多聚体支架的细胞毒性和/或抗炎性质。多聚体支架的拓扑学本领域技术人员应理解，图I和图2以及整个说明书中的上述多聚体支架仅为示例性实例。图I和图2中显示的构建体拓扑学或形式举例说明在一些实施方案中，将本发明的支架融合于抗体的Fe结构域的组成多肽的N端。可将本发明的支架以任何适当的空间排列融合于Fe结构域、抗体轻链和抗体重链的C端。例如，在一些实施方案中，可通过将FnIII单体支架融合于抗体的每一个重链的N端和将FnIII单体支架融合于抗体的每一个轻链的C端结构域，通过将FnIII单体支架融合于抗体的每一个轻链的N端和将FnIII单体支架融合于抗体的每一个重链的C端,或通过将FnIII单体 支架融合于抗体的每一个重链的N端和将FnIII单体支架融合于抗体的每一个轻链的N端来产生四价支架。可将单体和/或多聚体FnIII支架融合于包含可变区和恒定区的全长重链和/或轻链。或者，可将FnIII单体和/或多聚体支架融合于仅包含恒定区的截断的重链和/或轻链(例如，如在图2中显示的A9构建体中)。多聚体Tn3支架可使用图I中显不的形式作为构件块(building block)来产生。例如，抗体样和Fe融合形式为包含更简单的线性形式的Tn3模块的组合。因此，在一些实施方案中，更复杂的多聚体Τη3支架形式可通过组合如图I中显示的构件块来产生。图I和2还举例说明了在一些实施方案中，多聚体Τη3支架可以是线性或分枝的并且显示不同水平的分枝。例如，Fe形式提供了一级分枝形式的实例，然而抗体样形式提供了二级分枝形式的实例。更高级分枝结构可通过用Fe融合形式构件块或抗体样构件块替代抗体样形式或Fe融合形式中的线性形式构件块，然后将它们连接于Fe或抗体的组成多肽的C端或N端来获得。图I和2以及表I举例说明了这样的事实在一些实施方案中，多聚体Τη3支架中的接头在结构和功能上可以是多样的并且可提供多个联接点。例如，除通过(Gly4Ser)2GlyThrGlySerAlaMetAlaSer (Gly4Ser) ^la接头连接的第4和第5Τη3模块外，Α4和Α5构建体中的所有Τη3模块通过(Gly4-Ser)3Ala接头连接。例如，在A7构建体中，第一和第二 Tn3结构域以及第三和第四Τη3结构域通过(Gly4Ser)3Ala接头连接,然而第二和第三Τη3结构域通过作为功能性部分接头的Fe结构域连接。图I中显示的Fe融合物举例说明了在一些实施方案中，可将单体或多聚体Τη3支架融合于功能性部分接头的多肽的N端。在一些实施方案中，可容易地将本发明的单体或多聚体Τη3支架融合于Fe融合形式的构建体中的Fe结构域的C端。类似地，抗体样形式的构建体中的抗体或经修饰的抗体也是功能性部分接头。在该情况下，图I的抗体样实例中显示的抗体提供了 6个可能的联接点，而非2个联接点(如在(Gly4Ser) 3Ala 或(Gly4Ser) 2GlyThrGlySerAlaMetAlaSer (Gly4Ser) Ala 接头中)或 4 个可能的联接点(如在Fe结构域的情况下)。图I中显示的抗体样形式举例说明了在一些实施方案中，功能性部分接头中仅N末端联接点被Tn3支架占据。在抗体样形式的构建体中，可容易地将一些或所有本发明的Τη3支架融合于抗体或经修饰的抗体结构域的重链和轻链的C端。可应用其它融合化学计量学，即可将1、2、3、4、5、6、7、8或更多个本发明的Τη3支架融合于抗体或经修饰的抗体。图I和2还举例说明了在一些实施方案中，可通过组合其它多聚体Tn3支架产生多聚体Τη3支架。例如，图2的Fe形式Α6、Α7和Α8支架可以是同二聚体Τη3支架，其中多聚体Τη3支架通过两个多肽链形成，每一个多肽链包含融合于Fe结构域的线性形式的Τη3支架，所述多肽转而通过分子间二硫键连接。图I和2的抗体样支架举例说明了异四聚体Τη3支架，其中相应于两种不同类型的支架(2个通过将Τη3单体支架融合于IgG轻链恒定区形成的Τη3支架，和2个通过将Τη3单体支架融合于IgG的CHl-铰链区-Fe区形成的2个Τη3支架)的多肽通过分子间二硫键连接。本发明的支架的产生本文中描述的Τη3支架可用于用于进化新型或改进的靶结合蛋白的任何技术。在一个具体的实例中，将靶固定在固体载体例如柱树脂或微量滴定板孔上，随后将靶与基于·候选支架的结合蛋白的文库接触。这样的文库可由通过随机化CDR样环的序列和/或长度从Τη3支架构建的克隆组成。在这方面，噬菌体展示是一种公知技术，其允许筛选大型寡肽文库以鉴定能够特异性结合靶的所述文库的成员。噬菌体展示是籍以将变体多肽以与外壳蛋白的融合蛋白的形式展示在卩遼菌体颗粒的表面上的技术(Scott, J. K.和Smith，G.P. (1990) Science249:386)。可将生物信息学方法用于确定天然存在的FnIII结构域的环长度和多样性参数选择。通过使用该分析，可将环长度和序列多样性的参数选择用于开发“限制随机化("restricted randomization) ”法。在该限制随机化中，将相对环长度和序列参数选择并入文库策略的开发中。将环长度和序列多样性分析整合入文库开发导致限制随机化(即，随机化的环内的某些位置受到限制，其中氨基酸可位于该装置)。本发明还提供了包含多种多样的非天然存在的Tn3支架群体的重组文库。在一个实施方案中，文库包含含有连接于多个环区域的多个β链结构域的非天然存在的Τη3支架，其中一个或多个所述环相异在于至少I个氨基酸的缺失、置换或添加。在具体的实施方案中，文库包含衍生自野生型Τη3支架的Τη3支架。如上所述，可对连接支架的多个β链的环的长度和/或序列多样性进行随机化。在一个实施方案中，本发明的文库包含具有至少I个已对其长度和/或序列多样性进行随机化的环的Τη3支架。在一个实施方案中,对Τη3支架的至少I个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个环的长度和/或序列多样性进行标准化。在一个实施方案中，使至少I个环保持恒定，然而对至少I个另外的环的长度和/或序列多样性进行随机化。在另一个实施方案中，使环ABXD和EF的至少I个、至少2个或所有3个保持恒定，同时对环BC、DE和FG的至少I个、至少2个或所有3个的长度或序列多样性进行随机化。在另一个实施方案中，对环ABXD和EF的至少I个、至少2个或至少所有3个进行随机化，同时对环BC、DE和FG的至少I个、至少2个或所有3个的长度和/或序列多样性进行随机化。我们发现比FOI的FG环中发现的氨基酸长度短至少I个氨基酸的FG环经显示增强的稳定性。因此，本发明提供了包含Tn3支架的文库，其中除使FG环的长度保持比人生腱蛋白C的第三FnIII结构域的关联FG环(包含10个氨基酸残基)短至少I个氨基酸外，对至少I个环的长度和/或序列多样性进行随机化。在一些实施方案中，本发明的文库包含Τη3支架，其中每一个支架包含连接于6个环区域的命名为A、B、C、D、E、F和G的7个β链，其中环区域连接每一个β链并且被命名为AB、BC、⑶、DE、EF和FG;并且其中至少一个环为野生型Tn3支架环的非天然存在的变体，并且其中FG环比野生型Τη3支架中的关联环短至少一个氨基酸。在具体的实施方案中，本发明的文库包含FnIII支架，其中Αβ链包含SEQ IDNO: 42，B β 链包含 SEQ ID NO: 43，CP 链包含 SEQ ID NO: 45，DP 链包含 SEQ ID NO: 46，E β链包含 SEQ ID NO:47，FP 链包含 SEQ ID NO:49，且 GP 链包含 SEQ ID NO:52。在具体的实施方案中，本发明的文库包含FnIII支架，其中Αβ链由SEQ ID NO:42组成，Ββ 链由 SEQ ID NO:43 组成，链由 SEQ ID NO:45 组成， β 链由 SEQ ID NO:46组成，Εβ链由SEQ IDN0:47组成，FP链由SEQ ID NO:49组成，且GP链由SEQ ID NO:52组成。在具体的实施方案中，本发明的文库包含FnIII支架，其中Αβ链基本上由SEQ IDΝ0:42组成，Ββ链基本上由SEQ ID Ν0:43组成，CP链基本上由SEQ ID Ν0:45组成， β链基本上由SEQ ID NO:46组成，Εβ链基本上由SEQ ID NO:47组成，链基本上由SEQID Ν0:49组成，且GP链基本上由SEQ ID Ν0:52组成。如上所述，使环内的一个或多个残基保持恒定，同时对其它残基的长度和/或序列多样性进行随机化。任选地或可选择地，使环内的一个或多个残基保持恒定，同时对其它残基的长度和/或序列多样性进行随机化。因此，本发明的文库包含可含有一个或多个具有简并共有序列和/或一个或多个不变体氨基酸残基的环的Τη3支架。 在另一个实施方案中，本发明的文库包含拥有具有下列共有序列的经随机化的BC环的Τη3支架S-X-a-X-b-X-X-X-G，其中X代表任意氨基酸，其中(a)代表脯氨酸或丙氨酸并且其中(b)代表丙氨酸或甘氨酸。在另一个实施方案中，本发明的文库包含拥有具有下列共有序列的经随机化的BC环的Tn3支架S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G，其中X代表任意氨基酸并且其中(c)代表脯氨酸、丝氨酸或甘氨酸。在另一个实施方案中，本发明的文库包含拥有具有下列共有序列的经随机化的BC环的Tn3支架A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G，其中X代表任意氨基酸，其中(d)代表脯氨酸、谷氨酸或赖氨酸，其中(e)代表天冬酰胺或甘氨酸，并且其中(f)代表丝氨酸或甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的文库包含拥有具有具有下列共有序列的被随化的DE环的Tn3支架Χ-Χ-Χ-Χ-Χ-Χ，其中X代表任意氨基酸。在一个实施方案中，本发明的文库包含拥有具有下列共有序列的经随机化的FG环的Τη3支架X-a-X-X-G-X-X-X-b，其中X代表任意氨基酸，其中(a)代表天冬酰胺、苏氨酸或赖氨酸，并且其中(b)代表丝氨酸或丙氨酸。在另一个实施方案中，本发明的文库包含拥有具有下列共有序列的经随机化的FG环的FnIII支架Χ-Χ-Χ-Χ-Χ-Χ-Χ-Χ_Χ (X9)，其中X代表任意氨基酸。在具体实施方案中，本发明的文库包含支架，其中支架包含氨基酸序列=IEV(Xab)nALITff (Xbc)^ELX1YGI (Xcd) JTIDL(Xde) JSI (XEF)nYEVSLIC (Xfg)nKETFTT，其中 XAB、XBC、Xcd, XDE、Xef和Xrc分别代表存在于AB、BC、CD、DE、EF和FG环中的氨基酸残基，其中X1代表氨基酸残基A或T，并且其中n=2-26以及m=l_9。本发明还提供了用于通过筛选本发明的文库鉴定结合靶例如TRAIL R2并且与野生型Tn3支架相比较具有增强的稳定性或增强的对靶例如TRAIL R2的作用的重组Tn3支架的方法。在某些实施方案中，用于鉴定与野生型Tn3支架相比较具有增强的蛋白质稳定性并且特异性结合靶的重组Τη3支架的方法，包括(a)在适合于形成支架靶配体复合物的条件下将靶配体与本发明的文库接触；(b)从复合物获得结合靶配体的支架；(c)确定步骤(b)中获得的支架的稳定性是否大于野生型Tn3支架的稳定性。可使用相同的方法鉴定具有增强的对于靶的结合亲和力、亲合力等的重组Τη3支架。在一个实施方案中，在步骤(a)中，将本发明的支架文库与固定的靶一起温育。在一个实施方案中，在步骤(b)中，洗涤支架靶配体复合物以除去非特异性结合剂，在极严格的 条件下洗脱最紧密的结合剂，将其经历PCR以恢复序列信息。特别地预期步骤(b)中获得的结合剂和/或序列信息可用于使用本文中公开的或本领域技术人员已知的方法产生新文库，可将所述新文库在进行或不进行序列的进一步诱变的情况下用于重复选择过程。在一些实施方案中，可进行许多轮选择直至获得具有足够的对于抗原的亲和力的结合剂。本发明的其它实施方案为编码包含本发明的支架和上述支架的文库的分离的核酸分子的集合。可将本发明的支架经历亲和力成熟。在本领域接受的方法中，将特定结合蛋白经历选择增强的对于特定祀的亲和力的方案(参见Wu等人，Proc Natl Acad SciUSA. 95(11) :6037-42)。所得的本发明的支架可显示至少与亲和力成熟之前的支架一样高的结合特征。本发明还提供了鉴定能够结合靶以形成支架靶复合物的蛋白质支架的氨基酸序列。在一个实施方案中，方法包括a)将本发明的文库与固定的或可分离的靶接触；b)将支架靶复合物与游离支架分离；c)引起(b)的分离的支架复制以导致新的多肽展示文库，其与(a)中的多肽展示文库区别在于具有减少的多样性和被富集在能够结合靶的展示的支架中；d)任选地用(C)的新文库重复步骤(a)和(b) ；iP e)测定编码来自⑷的种类的展示支架的区域的核酸序列，从而推导能够结合靶的肽序列。在另一个实施方案中，还可在从文库筛选鉴定后进一步对本发明的支架进行随机化。在一个实施方案中，本发明的方法包括使用本文中描述的方法进一步对从文库鉴定的支架的至少I个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个环进行随机化。在另一个实施方案中，将进一步随机化的支架经历随后的鉴定能够结合靶的支架的方法。该方法包括(a)将所述进一步随机化的支架与固定的或可分离的靶接触，(b)将进一步随机化的支架靶复合物与游离支架分离，(c)引起(b)的分离的支架复制，任选地重复步骤(a)-(c)，和(d)测定编码所述进一步随机化的支架的区域的核酸序列，从而推导能够结合靶的肽序列。在其它实施方案中，进一步随机化的支架包含至少I个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个先前在第一文库中被随机化的随机化的支架。在可选择的其它实施方案中，进一步随机化的支架包含至少I个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个先前在第一文库中未被随机化的随机化的环。本发明还提供了用于获得至少2个结合至少I个或多个靶的Tn3支架的方法。该方法允许筛选协同作用以引发特定反应的试剂。当需要需要超过一个支架的协同作用的激动活性(例如，但不限于属于TNF受体家族的受体的激动)时，可以有利地使用这样的筛选。该方法允许筛选协同试剂而无需对文库重新格式化以形成多聚体复合物。在一个实施方案中，本发明的方法包括在允许支架靶配体复合物形成的条件下将靶配体与本发明的文库接触，使所述支架与交联剂(定义为将至少两个相同的或不同的支架拉近在一起的试齐U)衔接，其中支架的交联引发可检测的反应，以及从所述复合物获得结合靶的所述支架。在其它实施方案中，交联剂为支架特异性抗体或其片段、其片段的附加表位特异性抗体、二聚化结构域例如例如Fe区域、卷曲螺旋基序(coiled coil motif)(例如,但不限于亮氨酸拉链)、化学交联剂或本领域已知的另一种二聚化结构域。本发明还提供了利用本发明的支架检测化合物的方法。基于通过文库筛选获得的支架的结合特异性，在测定中使用这样的支架有可能在样品中检测到靶，例如以用于诊断方法。在一个实施方案中，检测化合物的方法包括在允许化合物支架复合物形成的条件下 将样品中的所述化合物与本发明的支架接触，然后检测所述支架，从而检测样品中的所述化合物。在其它实施方案中，标记(即，放射性标记、突光、酶联或比色标记(colorimetriclabel))支架以帮助检测化合物。本发明还提供了利用本发明的支架捕获化合物的方法。基于通过文库筛选获得的支架的结合特异性，在测定中使用这样的支架有可能捕获样品中的特定靶，例如用于纯化方法。在一个实施方案中，捕获样品中的化合物的方法包括在允许化合物支架复合物形成的条件下将样品中的所述化合物与本发明的支架接触，然后从样品取出所述复合物，从而捕获所述样品中的所述化合物。在其它实施方案中，将支架固化以帮助取出化合物支架复合物。在一些实施方案中，从本发明的文库分离的支架包含至少I个、至少2个、至少4个、至少5个、至少6个或更多个随机化的环。在一些实施方案中，可将分离的支架环序列从供体支架交换至接受者支架中的任何环(例如，可将来自供体支架的FG环序列转移至接受者支架中的任何环)。在具体的实施方案中，可将分离的环序列转移至接受支架的关联环(例如，可将来自供体支架的FG环序列转移至FG环位置中的接受者支架)。在一些实施方案中，可将分离的环序列与各种接受者支架随机地“混合和匹配”。在其它实施方案中，分离的支架序列可通过环序列来鉴定。例如，将文库用于淘选特定的靶，然后分离特定结合剂的集合。可将随机化的环序列表征为独立于支架背景的特定序列(即，结合靶X的支架，其中所述支架包含SEQ ID Ν0:Χ的FG环序列)。在可选择的实施方案中，当支架显示两个结合靶X的环序列时，可将环序列表征为在支架序列不存在的情况下结合靶X。换句话说，预期从文库分离的结合特定靶的支架可表达为结合独立于支架主链的靶的可变环序列。该方法与抗体的可变区中的CDR的概念类似。亲和力成熟TRAIL R2Tn3支架的开发可包括一个或多个体外或体内亲和力成熟步骤。可使用导致Tn3结构域或Τη3结构域环的氨基酸变化的任何亲和力成熟法，所述氨基酸变化可增强Τη3支架对期望的抗原的结合。这些氨基酸变化可以例如通过随机诱变、“模糊”诱变(“walkthough”mutagenesis)和精确诱变(“look through”mutagenesis)。这样的诱变可以例如使用易错PCR、酵母或细菌的“增变”株、在基于FnIII的结合分子的全部或部分的从头开始合成过程中随机或确定的核酸变化的整合来实现。用于进行亲和力成熟和/或诱变的方法描述于例如美国专利 No. 7，195，880,6, 951，725,7, 078，197,7, 022，479,5, 922，545、5，830，721,5, 605，793，5，830，650,6, 194，550,6, 699，658,7, 063，943,5, 866，344 和 PCT 公布 No. W006023144 中。这样的亲和力成熟法可能还需要增强抗原结合筛选测定的严格性以选择具有增强的对抗原的Tn3支架。用于增强蛋白质间相互作用测定的严格性的本领域公认的方法可用于此处。在一个实施方案中，改变一个或多个测定条件(例如，测定缓冲液的盐浓度)以减小Τη3支架对于期望的抗原的亲和力。在另一个实施方案中，缩短Τη3支架结合期望的抗原所允许的时间长度。在另一个实施方案中，可将竞争结合步骤添加至蛋白质间相互作用测定。例如，可首先允许Τη3支架结合期望的固定的抗原。随后添加用于竞争与固定的抗原结合 的特定浓度的非固定的抗原，以便具有最低的对于抗原的亲和力的Τη3支架从固定的抗原洗脱，从而导致具有增强的结合亲和力的Τη3支架的选择。测定条件的严格性可通过增加被添加至测定的非固定抗原的浓度来进一步增强。筛选方法可能还需要多轮的选择以富集一种或多种具有增强的抗原结合的Τη3支架。在一个实施方案中，在第一轮选择上，可向Τη3支架中引入其它氨基酸突变。在另一个实施方案中，在每一轮选择中，可增强对期望的抗原结合的严格性以选择具有增强的对于抗原的亲和力的Τη3支架。在一些实施方案中，通过对Τη3的BC、DE和FG环的部分的饱和诱变来进行亲和力成熟。在一些实施方案中，使用Kunkel诱变进行饱和诱变。在其它实施方案中，通过使用PCR进行饱和诱变。在一些实施方案中，应用至少I轮、至少2轮、至少3轮、至少4轮、至少5轮或超过5轮亲和力成熟。在一些实施方案中，将饱和诱变仅用于一个环，然而在一些其它实施方案中，在一轮亲和力成熟过程中仅诱变一个环或环的部分。在一些实施方案中，在相同轮的亲和力成熟过程中突变超过一个环或一个或多个环的部分。在其它实施方案中，在相同轮的亲和力突变过程中同时突变BC、DE和FG环。在装配成结合相同靶的不同表位的多聚体支架的Tn3支架情况下或在双特异性Τη3支架的情况下，可独立地筛选每一种结合特异性。因此，在一些实施方案中，使用Τη3支架的第一文库进行鉴定结合第一靶例如TRAIL R2的单个Tn3结合分子的第一筛选，其中改变一个或多个环中的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，可进行鉴定结合不同靶或结合相同靶的不同表位的单个Τη3分子的另外的筛选。在一些实施方案中，使用曬菌体展不文库随机化环。在一些实施方案中，可使用本文中公认的方法测定Τη3支架对期望的靶的结合。同样地，还可使用本领域公认的方法测定筛选中鉴定的Τη3支架的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的单体亲和力成熟的支架显示与亲和力成熟之前相同的Τη3支架相比较对于TRAIL R2的亲和力增强至至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少40倍、至少60倍、至少80倍或至少100倍或更多倍，如通过表面等离体共振技术或通过本领域已知的其它测定法测量的。在一些实施方案中，本发明的单体亲和力成熟的支架具有低于5 μ Μ、低于I μ Μ、低于500 μ Μ、低于250 μ Μ、低于100 μ M或低于50 μ M的解离常数(Kd)，如通过表面等离子体共振技术或通过本领域已知的其它测定法测量的。这些亲和力成熟法可用于开发具有期望的增强的结合性质例如增强的亲和力或其它期望特征，例如有利的药代动力学性质、高效力、低免疫原性、增强的或减弱的与来自其它生物体的TRAIL R2受体的交叉反应性等的Tn3支架。串联重复的产生串联构建体的连接可使用本领域已知的限制性内切酶(包括但不限于II型和IIS型限制性内切酶)通过在限制位点上连接寡核苷酸来产生。本发明的多聚体Τη3支架可在C端和/或N端和/或结构域之间包含接头，如本文中所描述的。此外,可将包含至少I个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个环的本发明的支架或多肽支架融合或缀合于二聚化结构域，包括但·不限于选自如下部分的抗体部分⑴具有VL、CL、VH和CHl结构域的Fab片段；(ii)Fab’片段，其为在CHl结构域的C端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)具有VH和CHl结构域的Fd片段；(iv)具有VH和CHl结构域以及在CHl结构域的C端上具有一个或多个半胱氨酸残基的Fd’片段；(V)具有抗体的单臂的VL和VH结构域的Fv片段；(vi) dAb片段,其由VH结构域组成；(vii)分离的CDR区域；(viii)F(Bbi )2片段，包括通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab’片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如,单链Fv ;scFv)；(x)具有两个抗原结合位点的“双链抗体”，其包含连接于相同多肽链中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)；(xi)包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区；(xii)全长抗体；和(xiii)包含CH2-CH3的Fe区域，其还可包含铰链区和/或CHl区的全部或部分。在下面的实例中例示了各种效价、亲和力和空间定向方案。支架的产生本发明的支架的重组表达需要构建包含编码支架的多核苷酸的表达载体。在已获得编码支架的多核苷酸后，可使用本领域公知的技术通过重组DNA技术产生用于产生支架的载体。因此，本文中描述了用于通过表达包含支架编码核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。可将对于本领域技术人员来说是公知的方法用于构建包含支架多肽编码序列和适当的转录及翻译控制信号的表达载体。此类方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供了包含有效地连接于启动子的编码本发明的支架的核苷酸序列的可复制载体。通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞，随后通过常规技术培养转染的细胞以产生本发明的支架。因此，本发明包括包含有效地连接于异源启动子的编码本发明的支架的多核苷酸的宿主细胞。适当的宿主细胞包括但不限于微生物例如细菌(例如，大肠杆菌(E. coli)和枯草芽孢杆菌(B. subtilis))。可将多种宿主-表达载体系统用于表达本发明的支架。此类宿主-表达系统代表籍以产生目标编码序列并随后纯化所述序列的载体(vehicle)，而且还代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本发明的支架的细胞。这类宿主-表达系统包括但不限于利用包含支架编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物例如细胞(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)或哺乳动物细胞系统(例如，C0S、CH0、BHK、293、NSO 和 3T3 细胞)。用于产生本发明的支架的方法公开于例如公布No:W02009/058379中。在已通过重组表达产生本发明的支架后，可利用本领域内已知的用于纯化蛋白质的任何方法来纯化 其。可按比例扩大研究实验室的本发明的支架的生产以在分析规模反应器或生产规模反应器中产生支架，如美国专利申请公布No. US2010/0298541A1中所描述的。分泌型支架的可扩展的生产可细胞内产生或可以以分泌的形式产生本发明的Tn3支架。在一些实施方案中，分泌型支架正确地折叠并且具有完全的功能。可通过可扩展法(scalable process)生产本发明的Tn3支架。在一些实施方案中，可在研究实验室中，通过可按比例扩大以在分析规模生物反应器(例如，但不限于5L、10L、15L、30L或50L的生物反应器)中生产本发明的Tn3支架的本发明的可扩展法生产Τη3支架。在其它实施方案中，可在研究实验中，通过可按比例扩大至在生产规模的生物反应器(例如，但不限于75L、100L、150L、300L或500L)中生产本发明的支架的本发明的可扩展法生产支架。在一些实施方案中，本发明的可扩展法导致与在研究实验室中进行的生产方法相比较几无或无生产效率的下降。接头多聚体支架中的Tn3支架通过蛋白质和/或非蛋白质接头连接，其中每一个接头融合于至少2个本发明的Τη3支架。适当的接头可由蛋白质接头、非蛋白接头及其组合组成。接头的组合可以是同聚体或异聚体。在一些实施方案中，本发明的多聚体Τη3支架包含多个其中所有接头都是相同的单体Τη3支架。在其它实施方案中，多聚体Τη3支架包含多个其中至少I个接头在功能上或结构上与其余接头不同的单体Τη3支架。在一些实施方案中，接头本身可通过直接或间接参与对靶的结合为多聚体FnIII支架的活性作出贡献。在一些实施方案中，蛋白质接头为多肽。接头多肽应当具有这样长度，所述长度足以以使它们采取彼此相对正确的构象(以便它们保留期望的活性)的方式连接2个或更多个本发明的单体支架或2个或更多个本发明的多聚体支架。在一个实施方案中，多肽接头包含I至约1000个氨基酸残基、I至约50个氨基酸残基、1-25个氨基酸残基、1-20个氨基酸残基、1-15个氨基酸残基、1-10个氨基酸残基、1-5个氨基酸残基、1-3个氨基酸残基。本发明还提供了编码多肽接头序列的核酸例如DNA、RNA或两者的组合。被选择包含在多肽接头中的氨基酸残基应当显示不显著干扰本发明的多聚体Tn3支架的活性或功能的性质。因此，多肽接头应当在总体上不显示与本发明的多聚体支架的活性或功能不一致，或干扰内部折叠，或与一个或多个Τη3单体结构域中的氨基酸残基形成键或其它相互作用(这严重地阻碍了本发明的多聚体支架对TRAILR2的结合)的电荷。天然存在的以及人工肽接头用于将多肽连接入新型连接的融合多肽的用途在文献中是公知的。因此，融合2个或更多个本发明的支架的接头是天然接头、人工接头或其组合。在一些实施方案中，存在于多聚体本发明的支架中的所有肽接头的氨基酸序列是相同的。在其它实施方案中，存在于本发明的多聚体支架中的至少两个肽接头的氨基酸序列是不同的。在一些实施方案中，多肽接头具有构象柔性。在具体实施方案中，多肽接头序列包含(G-G-G-G-S)x氨基酸序列，其中X为正整数。在一些实施方案中，多肽接头为固有地非结构化的天然或人工多肽(参见，例如，Schellenberger等人，Nature Biotechnol. 27:1186-1190, 2009 ；也参见，Sickmeier 等人，NucleicAcidsRes.35:D786-93, 2007)。
可以以引入包含用于非多肽部分的联接基团的氨基酸残基的方式修饰肽接头。此类氨基酸残基的实例可以是半胱氨酸残基(随后可将非肽部分联接于其)或氨基酸序列可包含体内N-糖基化位点(从而将糖部分(体内)联接于肽接头)。在一些实施方案中，存在于多肽多聚体中的所有肽接头的氨基酸序列是相同的。或者，存在于多肽多聚体中的所有肽接头的氨基酸序列可以不同。支架的标记或缀合本发明的支架可以以非缀合形式使用或可缀合于多个异源部分的至少一个以有利于靶检测或用于成像或治疗。当进行纯化时，可在纯化之前或之后标记或缀合本发明的支架。许多异源部分不存在本发明的支架可与其连接的适当的官能团。因此，在一些实施方案中，通过接头将效应分子联接于支架，其中接头包含用于缀合的反应基团。在一些实施方案中，缀合于本发明的支架的异源部分可用作接头。在其它实施方案中，部分可通过可被切割或不可切割的接头缀合于支架。在一个实施方案中，可切割的连接分子为可氧化还原切割的连接分子，以便连接分子在具有更低的氧化还原电位的环境(例如细胞质或具有更高浓度的具有游离巯基的分子的其它区域)中可被切割。可因氧化还原电位的变化而被切割的连接分子的实例包括包含二硫化物的那些连接分子。在一些实施方案中，对本发明的支架进行工程化以提供用于缀合的反应基团。在这样的支架中，N端和/或C端还可用于提供用于缀合的反应基团。在其它实施方案中，可将N端缀合于一个部分(例如，但不限于PEG)同时将C端缀合于另一个部分(例如，但不限于生物素)，或反之亦然。术语“聚乙二醇”或“PEG”意指聚乙二醇化合物或其衍生物(具有或不具有偶联剂、偶联或活化部分(例如，具有巯基、三氟甲磺酸盐、三氟乙基磺酸单甲氧基(Tresylate)、氮丙啶、环氧乙烷、N-羟基琥珀酰亚胺或马来酰亚胺部分))。术语“PEG”意欲表示分子量为500至150，OOODa的聚乙二醇，包括其类似物，其中例如末端OH基已被甲氧基替代(称为mPEG)。可用聚乙醇(PEG)衍生本发明的支架。PEG为具有两个末端羟基的环氧乙烷重复单元的线性、水溶性聚合物。按照它们的分子量(通常在约500道尔顿至约40，000道尔顿的范围内)将PEG分类。在具体的实施方案中，使用的PEG具有从5，OOO道尔顿变化至约20，000道尔顿的分子量。偶联于本发明的支架的PEG可为分枝的或未分枝的。参见，例如，Monfardini, C.等人 1995Bioconjugate Chem 6:62-69。PEG 可从 NektarInc. , Sigma Chemical Co.和其它公司商购获得。这样的PEG包括但不限于单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸盐(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG_NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸单甲氧基(MePEG-TRES)和单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-頂)。简而言之，利用惰性基团例如甲氧基或乙氧基在一个末端给所使用的亲水聚合物例如PEG加帽。此后，通过与适当的活化剂例如氰基尿素卤化物(例如，氰尿酰氯、氰尿酸溴或氰尿酸氟)、羰基二咪唑、酸酐试剂(例如，二卤代丁二酸酐，例如二溴丁二酸酐)、酰叠
氮、对-重氮基二苄醚、3-(对-重氮基苯氧基)-2-羟丙醚)等反应来在另一端活化聚合物。随后将活化的聚合物与本文中描述的多肽反应以产生利用聚合物衍生的多肽。或者，可活化发明的支架中的官能团以与聚合物反应或可使用已知的缀合法在协调的偶联反应中连接两个基团。将容易地理解，可使用许多本领域技术人员已知的和使用的其它反应方案，利用PEG来衍生本发明的多肽。可将PEG在支架的末端上或支架内的一个或多个官能团上偶联至本发明的支架。在某些实施方案中，将PEG偶联在N端或C端。在其它实施方案中，可将本发明的支架、其类似物或衍生物缀合于诊断剂或可检测剂。这样的支架可用于监控或预后疾病的发展或进展作为临床测试法的部分，例如测定特定疗法的功效。本发明还包括缀合于治疗性部分的支架的用途。可将支架缀合于治疗性部分例如细胞毒素，例如细胞抑制剂(cytostatic agent)或杀细胞剂、治疗剂或放射性金属离子,例如α-发射体。细胞毒素或细胞毒素剂包括对细胞有害的任何试剂。测定支架可通过许多本领域已知的体外测定法来测定支架对抗原的结合亲和力和其它结合性质，所述测定法包括例如，平衡法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、或动力学(例如，BIAGORE 分析)以及其它方法例如间接结合测定、竞争性结合测定、凝胶电泳和层析(例如，凝胶过滤)。这些和其它方法可利用待检查的一个或多个组分上的标记和/或应用多种检测法，包括但不限于生色(chromogenic)、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力和动力学的详细描述可见于 Paul, ff. E.编著，Fundamental Immunology,第 4 版，Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)。在一些实施方案中，本发明的支架以特定动力学特异性结合靶。在一些实施方案中，本发明的支架可具有低于 I X 1(T2M、I X 1(Γ3Μ、I X 1(Γ4Μ、I X 1(Γ5Μ、I X 1(Γ6Μ、I X 1(Γ7Μ、I X 1(Γ8Μ、I X 1(Γ9Μ、I X 1(Γ10Μ、I X 1(ΓηΜ、I X 1(Γ12Μ、I X 1(Γ13Μ、I X KT14M 或低于 I X KT15M 的解离常数或KdG^ffZXJ。在具体实施方案中，本发明的支架具有500 μ Μ、100 μ Μ、500ηΜ、100nM、lnM、500pM、IOOpM或更少的Kd，如通过BIAcore测定 或通过本领域已知的其它测定法测定的。在可选择的实施方案中，本发明的支架的亲和力以缔合常数(Ka)进行描述，所述缔合常数计算为至少 I X IO2M' I X IO3M' I X IO4M' I X IO5M' I X IO6M' I X IO7M'
IX IO8M' I X IO9M' I X IO10ITiI X IO11ITiI X IO12M' I X IO13M' I X IO14M' I X IO15IT1 或至少5X IO15M4的比率在某些实施方案中，与本发明的支架与靶表位解离所处的比率可以比Kd*Ka的值更相关。在一些实施方案中，本发明的支架具有小于10、'小于5x10、'小于KT4S'小于5x10、'小于KT5S'小于5xl(T5s'小于l(T6s'小于5xl(T6s'小于KT7S'小于 5xl(T7s'小于 10Λ'小于 5χ1θΛ'小于 I(T9S'小于 δχΙΟΛ-1 或小于 KTicV1的kf。在某些其它实施方案中，本发明的支架与靶表位缔合所处的比率可以比Kd或Ka的值更相关。在该情况下，本发明的支架以至少IO5M4s'至少δχΙΟΜ 、至少IO6M4s'至少5x IO6IT1S'至少 IO7IT1S'至 少 5x IO7M-1S-1 或至少 IO8M-1S-1 或至少 IO9M-1S-1 的 km 率结合靶。还可将本发明的支架联接于固体载体，这对于靶的免疫测定或纯化是特别有用的。此类固体载体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。TRAIL R2_ 特异性 Tn3 支架TRAIL R2蛋白由TNF-受体超家族基因的成员编码，并且包含细胞内死亡结构域。在一些情况下，其也可称为 TNFRSF10B ;CD262、DR5、KILLER、KILLER/DR5、TRAILR2、TRICK2、TRICK2A、TRICK2B、TRICKB 或 ZTNFR9。该受体可被肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TNFSF 10/TRAIL/AP0-2L)激活，并且转导细胞凋亡信号。此外，TRAIL R2诱导的细胞凋亡涉及半胱天冬酶和细胞内适体分子FADD/M0RTI (Walczak等人· EMB0J, (1997)，16，5386-97)。本发明提供了特异性结合TRAIL R2的Tn3支架。在具体的实施方案中，本发明的支架特异性结合人TRAIL R2。在其它具体实施方案中，本发明的Tn3支架结合来自小鼠、鸡、恒河猴、食蟹猴、大鼠或兔子的TRAIL R2同源物。在一些实施方案中，本发明的Tn3支架结合TRAIL R2的暴露表位。这样的实施方案包括在细胞和/或经转染以异位表达受体的细胞上内源表达的TRAIL R2。在其它实施方案中，本发明的Tn3支架识别在单体TRAIL R2上展示的表位。在其它实施方案中，本发明的Tn3支架识别在TRAIL R2的同二聚体形式上显示的表位。在其它实施方案中，本发明的Tn3支架结合单体TRAIL R2并且促进2个或更多个TRAIL R2分子的二聚化或寡聚化(例如，但不限于多聚体支架)。在其它实施方案中，本发明的支架减弱或抑制TRAIL R2与TRAIL配体的相互作用。在其它实施方案中，本发明的支架模拟TRAIL配体与TRAIL R2的相互作用。在其它实施方案中，本发明的Tn3支架通过TRAIL-R2激活细胞信号转导。本发明还提供了使用本文中描述的Τη3支架调节TRAIL R2活性的方法。在一些实施方案中，本发明的方法包括将表达TRAIL R2的细胞与TRAIL R2特异性支架接触，以及阻断与TRAIL配体的相互作用。在其它实施方案中，本发明的方法包括将表达TRAIL R2的细胞与TRAIL R2-特异性Tn3支架接触，以及模拟TRAIL配体与TRAILR2的相互作用。在其它实施方案中，本发明的方法包括通过与TRAIL R2_特异性Tn3支架接触来激活TRAIL R2。在其它实施方案中，本发明的方法包括通过将在细胞上表达的TRAIL R2的单体与TRAIL R2特异性支架并且促进二聚化或寡聚化来接触二聚化或寡聚化TRAIL R2。在其它实施方案中，TRAIL R2的二聚化可通过使用例如但不限于多聚体Tn3支架来实现，所述多聚体Τη3支架模拟TRAIL R2 二聚体、稳定TRAIL R2 二聚体形成、使TRAIL R2单体去稳定或仅识别细胞上展示的TRAIL R2 二聚体。
在其它实施方案中，TRAIL R2的二聚化或寡聚化可通过使用偶联有支架二聚化或寡聚化试剂的单体Tn3支架来实现。这样的支架二聚化或寡聚化试剂可包括例如但不限于抗支架抗体，具有偶联有探针表位标记物的抗体的表位标记物的支架的使用，或本文中描述的和本领域已知的各种蛋白质二聚化或寡聚化基序的整合。在其它实施方案中，TRAILR2 二聚体或寡聚体可通过施用单体支架，然后施用支架二聚化或寡聚化试剂来诱导。在一些实施方案中，本发明的方法包括施用降低细胞活力(如通过本领域已知的常规测定法测量)的TRAIL R2特异性支架。在其它实施方案中，细胞活力的降低是细胞凋亡的激活，如通过本领域已知的测定法测量的。在其它实施方案中，细胞活力的降低是细胞分裂的抑制，如通过本领域接受的方法测量的。在一些实施方案中，细胞活力与在处理不存在的情况下的细胞活力相比较降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多。在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2_结合Tn3支架以与TRAIL R2的配体(称 为TRAIL)相似的活性激活TRAIL R2。在其它实施方案中，本发明的TRAIL R2-结合Tn3支架能够充分激活TRAIL R2以导致一个或多个细胞内信号转导途径的激活，包括半胱天冬酶3、半胱天冬酶8、半胱天冬酶10或FDAA的激活。在其它实施方案中，本发明的TRAIL R2-结合Tn3支架在至少一个癌症细胞类型中激活细胞凋亡。在其它实施方案中，本发明的TRAILR2-结合Tn3支架在至少一个细胞类型中显示与TRAIL相比较增强的细胞凋亡的激活。在其它实施方案中，本发明的TRAIL R2结合Tn3支架可结合与TRAIL(配体)所结合的表位相同的TRAIL R2上的表位或竞争对所述表位的结合。在这样的实施方案中，TRAIL R2结合支架能够阻断或抑制TRAIL R2与TRAIL的相互作用至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多，这可使用可溶性TRAIL配体(例如TRAIL配体的114-281片段)、结晶学研究或其它已知的体内或体外研究来在体外竞争性测定中进行测定。在疗法中使用Tn3TRAIL R2_特异性支架的方法已知TRAIL R2介导细胞凋亡信号转导。虽然几种类型的正常细胞表达TRAILR2，但通过该受体的细胞凋亡信号似乎主要限制于肿瘤细胞，所述肿瘤细胞在它们通过癌基因例如Myc或Ras的转化的背景中变得对死亡受体介导的细胞凋亡更易感(Wang等人，Cancer Cell 5:501-12(2004) ;Nesterov等人，Cancer Res. 64:3922-7 (2004))。TRAILR2通常由人癌细胞系以及原发性肿瘤表达。在一些实施方案中，给需要治疗的受试者(例如，癌症患者)施用本发明的TRAILR2特异性支架。在这样的实施方案中，给有此需要的受试者施用包含TRAIL R2特异性支架的无菌、无热源组合物。可使用本领域公知的多种体外和体内测定法例如但不限于细胞凋亡活性、使用膜联蛋白V结合的半胱天冬酶激活以及肿瘤负荷或体积的减小来测量治疗效率。在其它实施方案中，本发明的TRAILR2特异性支架对于诊断和检测癌症或其它TRAIL R2相关疾病是有用的。在这样的实施方案中，将本发明的TRAIL R2特异性支架连接于检测剂例如但不限于放射性同位素、荧光或化学发光标记物。这样的连接的结合剂在检测或诊断受试者或采自所述受试者的样品的癌症或TRAIL R2相关疾病的方法中是有用的。此外，TRAIL R2特异性支架在诊断和治疗其它TRAILR2相关病理病况例如哺乳动物(包括人)的免疫相关疾病中是有用的。
特异性TRAIL R2结合序列在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2特异性Tn3单体支架包含至少I个、至少
2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个结合TRAIL R2的环序列。在一些实施方案中，T·RAIL R2特异性Tn3支架包含选自1C12(SEQ ID NO: 132)、G3 (SEQ ID NO: 133)、IElI (SEQ ID NO: 134)、C4 (SEQ ID NO: 135)、Cll (SEQ ID NO: 136)、F4 (SEQ ID NO: 137)和G6 (SEQ ID NO: 138)的TRAIL R2结合单体支架克隆的至少I个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个环序列。在一些实施方案中，TRAIL R2特异性Tn3单体支架包含至少I个选自表4中所列的环序列的环序列。在其它实施方案中，TRAIL R2特异性单体支架包含至少I个选自表4中所列的BC环序列的BC环序列。在其它实施方案中，TRAIL R2特异性单体支架包含至少I个选自表4中所列的DE环序列的DE环序列。在其它实施方案中，TRAIL R2特异性单体支架包含至少I个选自表4中所述列的FG环序列的FG环序列。在一些实施方案中，TRAIL R2特异性Tn3单体支架包含选自表4中所列的BC环序列的BC环序列；和选自表4中所列的DE环序列的DE环序列。在其它实施方案中，TRAILR2特异性单体支架包含选自表4中所列的BC环序列的BC环序列；以及选自表4中所列的FG环序列的FG环序列。在其它实施方案中，TRAIL R2特异性支架包含选自表4中所列的DE环序列的DE环序列；以及FG环序列选自表4中所列的FG环序列。在一些实施方案中，TRAIL R2特异性Tn3单体支架包含相应于来自1、2或3个不同Τη3克隆的环序列。在一些实施方案中，TRAIL R2特异性Tn3多聚体支架为线性多聚体，例如二聚体例如SEQ ID NO: 139的IEll串联2支架、四聚体例如SEQ ID NO: 140的IEll串联4支架或SEQ ID NO: 143的G6串联4支架、六聚体例如SEQ ID NO: 141的IEll串联6支架、SEQIDNO: 144的G6串联6支架或SEQ ID NO: 167的F4modl2串联6、或八聚体例如SEQ ID NO: 142的IEll串联8支架、SEQ ID NO: 145的G6串联8支架或SEQ ID NO: 166的F4modl2串联8支架。在一些实施方案中，TRAIL R2特异性Tn3多聚体支架为Fe融合物，例如，SEQ IDNO: 149 的 lC12Fc 融合物、SEQ ID NO: 150 的 G3Fc 融合物、SEQ ID NO: 151 的 IEllFc 融合物、SEQ ID NO: 152 的 C4Fc 融合物或 SEQ ID NO: 153 的 G6Fc 融合物。在一些实施方案中，TRAIL R2特异性Tn3多聚体支架为抗体样融合物，例如由SEQID N0:154的lC12IgGl重链恒定区支架与SEQID勵155的1(121^轻链支架的缔合产生的支架，由SEQ ID NO: 156的G3IgGl重链支架与SEQ ID NO: 157的G3 κ轻链支架的缔合产生的支架，由SEQ ID NO: 158的IEllIgGl重链支架与SEQ ID NO: 159的IEll κ轻链支架的缔合产生支架，由SEQ ID NO: 160的C4IgGl重链支架与SEQ ID NO: 161的C4 κ轻链支架的缔合产生支架，或由SEQ ID NO: 162的G6IgGl重链支架与SEQ ID NO: 163的G6 κ轻链支架的缔合产生支架。在一些实施方案中，TRAIL R2特异性Tn3多聚体支架以线性形式组合Fe融合形式，例如SEQ ID NO: 164的IEll串联2Fc融合物或SEQ ID NO: 165的IEll串联4Fc融合物。在某些实施方案中，当TRAIL R2特异性Tn3多聚体支架序列在序列的C端包含接头和/或组氨酸标记物时，可除去该C末端接头和/或组氨酸标记物，从而相应的氨基酸序列包含C末端接头和His标记物序列的缺失。在一些实施方案中，将TRAIL R2特异性Tn3多聚体支架缀合于PEG。在具体实施方案中，将 F4modl2 串联 6(SEQ ID NO: 167)或 F4modl2 串联 8(SEQ ID NO: 166)支架缀合于PEG。在其它实施方案中，将PEG在缀合于多聚体支架分子的N端或C端。药物组合物在另一个方面，本发明提供了组合物，例如但不限于与药学上可接受的载体一起配制的包含一种本发明的支架或多聚体支架或其组合的药物组合物。此类组合物可包含一种本发明的支架或例如但不限于两种或更多种不同的本发明的支架的组合。例如，本发明的药物组合物可包含结合靶抗原上不同表位的支架或具有互补活性的支架的组合。在具体的实施方案中，药物组合物包含多聚体本发明的支架。还可在联合治疗(例如与其它试剂组合的)中施用本发明的药物组合物。例如， 联合治疗可包括与至少一种其它疗法(其中所述疗法可以为放射疗法、化学疗法、辐照疗法或药物疗法)组合的本发明的支架。本发明的药物化合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。药物给药和施用为了制备包含本发明的Tn3支架的药物或无菌组合物，将支架与药学上可接受的载体或赋形剂混合。选择治疗剂的施用方案取决于几个因素，包括实体的血清或组织周转率、症状的水平、实体的免疫原性和靶细胞在生物学基质中的可及性。在某些实施方案中，施用方案使递送至患者的治疗剂的量最大化至与副作用的可接受水平一致。针对具体的患者、组合物以及施用模式，可改变本发明的药物组合物的活性成分的实际水平以获得有效地实现期望的治疗反应而无对患者无毒的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于多个药代动学因素，包括使用的本发明的具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、待使用的具体化合物的排泄速度、治疗的持续时间、与使用的具体组合物组合使用的其它药物、化合物或材料、等治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和既往医疗史等医学领域公知的因素。本发明的组合物还可使用本领域已知的多种方法中的一种或多种，通过一个或多个施用途径来进行施用。在某些实施方案中，可配制本发明的Τη3支架以确保正确的体内分布。使用支架的方法本发明的Τη3支架具有体外和体内诊断及治疗效用。例如，可将此类分子给例如体外或离体培养的细胞或受试者的细胞例如，体内施用以治疗、预防或诊断多种障碍。同样地，作为亚单元交联的结果，许多细胞表面受体激活或灭活。本发明的Τη3支架可用于通过交联细胞表面受体来刺激或抑制靶细胞的反应。在另一个实施方案中，本发明的支架可用于阻断多个细胞表面受体例如TRAIL R2与抗原的相互作用。在另一个实施方案中，本发明的Tn3支架可用于增强多个细胞表面受体与抗原的相互作用。在另一个实施方案中，可能使用包含共有对相同抗原的特异性或结合两个不同抗原的结合结构域的本发明的Τη3支架交联细胞表面受体的同二聚体或异二聚体。在另一个实施方案中，本发明的Τη3支架可用于将配体或配体类似物递送至特定的细胞表面受体。本发明还提供了不容易用常规抗体实现的靶向表位的方法。例如，在一个实施方案中，本发明的Tn3支架可用于首先靶向邻近抗原并且当结合时，另一个结合结构域可衔接隐蔽抗原。本发明还提供了使用本发明的Τη3支架将不同细胞类型相合的方法。在一个实施方案中，本发明的支架可利用一个结合结构域结合靶细胞并且通过另一个结合结构域招募另一个细胞。在另一个实施方案中，所述第一细胞可以是癌细胞并且所述第二细胞为免疫效应细胞例如NK细胞。在另一个实施方案中，本发明的Τη3支架可用于增强两种不同细胞，例如可能增强免疫反应的抗原递呈细胞和T细胞之间的相互作用。本发明还提供了使用Τη3支架缓解、治疗或预防癌症或其症状的方法。在一个实施方案中，本发明提供了使用本发明Τη3支架消耗抗TRAIL细胞群体的方法。在这方面，本发明的Tn3支架可用于治疗一些类型的抗治疗性癌症(therapy resistant cances)。本发明还提供了使用Tn3支架消耗细胞群体的方法。在一个实施 方案中，本发明的方法用于消耗下列细胞类型嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞、单核细胞和肿瘤细胞。本发明还提供了使用支架灭活、抑制或消耗细胞因子的方法。本发明还提供了使用Τη3支架蛋白作为诊断试剂的方法。在这方面，在一些实施方案中，本发明的Τη3支架对TRAIL R2受体的结合可诊断性用于检测表达TRAIL R2的细胞。在其它实施方案中，本发明的Tn3支架区分抗TRAIL但对TRAIL模拟物敏感的细胞群体与抗TRAIL并且也抗TRAIL模拟物的细胞群体的能力(参见例如，实施例19)可用于诊断目的。本发明的Tn3支架可用于其中需要同时高效地捕获不同抗原的试剂盒或试剂。还预期由细胞凋亡的异常引起的癌症也可利用本发明的方法和组合物来治疗。在另一个实施方案中，本发明提供了用于预防、管理、处理或缓解癌症的方法。TRAIL R2特异性多聚体Tn3支架可用于治疗癌症例如肺癌、非何杰金氏淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、结直肠癌和多发性骨髓瘤。利用TRAIL R2特异性多聚体Tn3进行的癌症的治疗还可包括另外的疗法，例如免疫疗法、生物疗法、化学疗法、放射疗法或小分子药物疗法。治疗癌症的方法可包括给有此需要的受试者施用(与手术组合地、单独地或与标准或实验性化学疗法、激素疗法、生物疗法/免疫疗法和/或放射疗法的施用进一步组合地)一剂预防或治疗有效量的一种或多种本发明的Τη3支架。根据这些实施方案，可以将或可以不将用于预防、管理、治疗或缓解癌症、自身免疫、炎性或感染性疾病或其一种或多种症状的本发明的Τη3支架缀合或融合于部分(例如，治疗剂或药物)。等同物本领域技术人员可识别或能够仅使用常规实验确定本文中描述的本发明的特定实施方案的许多等同物。此类等同物意欲包括在下列权利要求中。本说明书中提及的所有公开案、专利和专利申请都是通过引用并入本说明书，其引用程度就如同将每一个别公开案、专利或专利申请特定且个别地通过引用并入本文。本申请要求保护2010年4月13日提交的美国临时专利申请No. :61/323，708的优先权的利益，将其整个内容通过引用并入本文。此外，为了所有目的，将2008年10月10日提交的并且公布为国际公布No. WO 2009/058379Α2的PCT申请PCT/US2008/012398号通过引用整体并入本文。表I.装配代表性的本发明的支架的分子组分的序列和SEQ IDNO
权利要求
1.一种包含两个Tn3单体支架的TRAIL R2-特异性重组多聚体支架，其中 (a)每一个Tn3单体支架包含命名为A、B、C、D、E、F和G的7个β链，以及命名为ΑΒ、BC、CD、DE、EF和FG的6个环区域， (b)所述Tn3单体支架以串联形式连接，且 (c)所述重组多聚体支架特异性结合TRAILR2。
2.根据权利要求I所述的多聚体支架，其中所述多聚体支架包含3、4、5、6、7或8个Tn3单体支架。
3.根据权利要求2所述的多聚体支架，其中所有Τη3单体支架以串联形式存在。
4.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中至少一个Τη3单体支架通过接头或通过异源部分直接连接于1、2、3、4、5、6或7个其它Τη3单体支架。
5.根据权利要求4所述的多聚体支架，其中至少2个Τη3单体支架直接连接而无间插在所述Τη3单体支架之间的接头。
6.根据权利要求4所述的多聚体支架，其中至少2个Τη3单体支架通过接头连接。
7.根据权利要求6所述的多聚体支架，其中所述接头包括肽接头。
8.根据权利要求7所述的多聚体支架，其中所述肽接头为柔性肽接头。
9.根据权利要求7所述的多聚体支架，其中所述肽接头包含(GxS)y序列，其中1和7为整数，其中χ=1、2、3或4，并且其中y=l、2、3、4、5、6或7。
10.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架,其中所述多聚体支架对于TRAILR2的结合与TRAIL R2特异性Tn3单体支架的所述结合相比较得到了增强。
11.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中所述多聚体支架对于TRAILR2的结合与TRAIL R2特异性Tn3单体支架的所述结合相比较增强了对所述靶的作用。
12.根据权利要求10所述的多聚体支架，其中对TRAILR2的结合相对于TRAIL R2特异性Tn3单体支架的所述结合的增强为结合亲和力的增强和/或结合亲合力的增强。
13.根据权利要求10所述的多聚体支架，其中对于TRAILR2的结合亲和力和蛋白质稳定性与TRAIL R2特异性Tn3单体支架的所述结合亲和力和蛋白质稳定性相比较得到了增强。
14.根据权利要求10所述的多聚体支架，其中对于TRAILR2的结合亲合力和蛋白质稳定性与TRAIL R2特异性Tn3单体支架的所述结合亲合力和蛋白质稳定性相比较得到了增强。
15.根据权利要求4所述的多聚体支架，其中所述接头包含功能性部分。
16.根据权利要求15所述的多聚体支架，其中所述功能性部分为免疫球蛋白或其片段。
17.根据权利要求16所述的多聚体支架，其中所述免疫球蛋白或其片段选自Fab片段、Fab’片段、Fd片段、Fd’片段、Fv片段、dAb片段、F(ab’)2片段、scFv、双链抗体、线性抗体、全长抗体、Fe区域以及所述部分的两个或更多个的组合。
18.根据权利要求16所述的多聚体支架，其中所述免疫球蛋白或其片段包含IgG的Fe结构域和铰链区。
19.根据权利要求18所述的多聚体支架，其中所述免疫球蛋白或其片段还包含CHl结构域。
20.根据权利要求16所述的多聚体支架，其中所述免疫球蛋白或其片段还包含IgG的Ck结构域或C λ结构域。
21.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中将Τη3单体支架的至少一个融合于异源部分。
22.根据权利要求21所述的多聚体支架，其中所述异源部分包含选自如下物质的组合物蛋白质、肽、蛋白质结构域、接头、药物、毒素、细胞毒素剂、成像剂、放射性核素、放射性化合物、有机聚合物、无机聚合物、聚乙二醇(PEG)、生物素、人血清白蛋白(HSA)、HSA FcRn结合部分、抗体、抗体的结构域、抗体片段、单链抗体、结构域抗体、白蛋白结合结构域、酶、配体、受体、结合肽、非-FnIII支架、附加表位、重组多肽聚合物、细胞因子以及两种或更多种所述部分的组合。
23.根据权利要求22所述的多聚体支架，其中将所述支架缀合于PEG。
24.根据权利要求6所述的多聚体支架，其中超过两个所述Tn3单体支架通过接头连接，并且其中至少I个接头在结构上和/或功能上与另外的接头不同。
25.根据权利要求2所述的多聚体支架，其中以分枝形式连接所述Τη3单体支架。
26.根据权利要求2所述的多聚体支架，其中一些Τη3单体支架以线性串联形式连接并且一些Τη3单体支架以分枝形式连接。
27.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个Τη3单体支架是相同的。
28.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个Τη3单体支架是不同的。
29.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中所述Τη3多聚体支架结合至少一个额外的靶。
30.根据权利要求29所述的多聚体支架，其中所述额外的靶为T细胞抗原。
31.根据权利要求30所述的多聚体支架，其中所述T细胞抗原为CD40L。
32.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中所述多聚体支架为受体激动剂。
33.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个Τη3单体支架结合TRAIL R2上的相同表位。
34.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个Tn3单体支架结合TRAIL R2上的不同表位。
35.根据权利要求34所述的多聚体支架，其中所述不同TRAILR2表位为非重叠表位。
36.根据权利要求34所述的多聚体支架，其中所述不同TRAILR2表位为重叠表位。
37.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个Tn3单体支架的所述β链与SEQ ID NO: I的所述β链具有至少90%的序列同一性。
38.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个Τη3单体支架包含氨基酸序列 IEV (Xab) nALITff (Xbc) JELX1YGI (Xcd) JTIX2L (Xde) nYSI (Xef) JEVSLIC (Xfg) nKX3TFTT其中Xm Xbc> Xcd> Xde> Xef和XFe分别代表存在于AB、BC、CD、DE、EF和FG环中的氨基酸残基，其中X1代表氨基酸残基A或T，其中X2代表氨基酸残基D或G，其中X3代表氨基酸T或G，并且其中所述环的长度η为2与26之间的整数。
39.根据权利要求38所述的多聚体支架，其中所述AB环包含SEQID NO: 35，所述⑶环包含SEQ ID NO: 37且所述EF环包含SEQ ID NO: 39。
40.根据权利要求38所述的多聚体支架，其中所述BC环包含选自SEQID ΝΟ:97、98或168的序列。
41.根据权利要求38所述的多聚体支架，其中所述DE环包含选自SEQID NO: 102,103和179的序列。
42.根据权利要求38所述的多聚体支架，其中所述FG环包含选自SEQID NO: 106,108,109、169或170的序列。
43.根据权利要求38所述的多聚体支架，其中所述BC环包含SEQID NO:97，所述DE环包含 SEQ ID NO: 179 且 FG 环包含 SEQ IDN0:170。
44.根据权利要求43所述的多聚体支架，其中所述支架包含SEQIDNO: 209或204。
45.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中所述支架以IyM或更小的亲和力(Kd)结合TRAIL R2受体。
46.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架,其中所述支架以500nM或更小的亲和力(Kd)结合TRAIL R2受体。
47.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架,其中所述支架以IOOnM或更小的亲和力(Kd)结合TRAIL R2受体。
48.一种编码根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架的分离的核酸分子。
49.一种包含根据权利要求48所述的核酸的表达载体。
50.一种包含根据权利要求49所述的载体的宿主细胞。
51.一种产生重组多聚体支架的方法，包括在其中由所述核酸分子编码的多聚体支架被表达的条件下培养根据权利要求50所述的宿主细胞。
52.一种组合物，其在药学上可接受的赋形剂中包含根据权利要求1-47中任一项所述的重组多聚体支架。
53.一种用于通过施用有效量的根据权利要求52所述的组合物预防、治疗、缓解或管理有此需要的患者的癌症的方法。
54.一种用于利用根据权利要求52所述的组合物对患者的疾病进行诊断或成像的方法。
55.一种诱导表达TRAIL R2的细胞的细胞凋亡的方法，包括将所述细胞与根据权利要求1-47中任一项所述的重组多聚体支架接触。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述癌症选自肺癌、非何杰金氏淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌和多发性骨髓瘤。
57.根据权利要求53所述的方法，其中所述方法还包括额外疗法，其中所述疗法为免疫疗法、生物疗法、化学疗法、辐照疗法或小分子药物疗法。
58.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中所述TRAILR2为人TRAILR2。
59.根据权利要求1-47中任一项所述的多聚体支架，其中所述支架结合TRAILR2并且(a)激活所述TRAILR2受体， (b)模拟TRAIL对TRAILR2受体的结合， (c)促进TRAILR2受体二聚化或寡聚化， (d)诱导细胞凋亡， (e)降低或抑制细胞活力，或 (f)活性(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的组合。
60.一种改变表达TRAIL R2的细胞的活性的方法，包括将所述细胞与根据权利要求1-47中任一项所述的TRAIL R2特异性多聚体支架接触，其中所述多聚体支架结合TRAILR2并且 (a)激活所述TRAILR2受体， (b)模拟TRAIL对TRAILR2受体的结合， (c)促进TRAILR2受体二聚化或寡聚化， (d)诱导细胞凋亡， (e)降低或抑制细胞活力，或 (f)活性(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的组合。
61.根据权利要求23所述的多聚体支架，其中将所述PEG在N端或C端缀合于所述支架。
全文摘要
本发明提供了特异性结合TRAIL受体2(TRAIL R2)(参与细胞凋亡的细胞膜受体)的基于腱糖蛋白-3FnIII结构域的多聚体支架。本发明还提供了具有增强的对于靶的亲和力、增强的稳定性和减小的免疫原性的工程变体。此外，本发明还涉及作为预防剂、治疗剂或诊断剂的工程多价支架以及它们抗由表达TRAIL R2的细胞引起的疾病的用途，特别地涉及抗癌的治疗性用途。
文档编号C07K16/18GK102906112SQ201180018796
公开日2013年1月30日 申请日期2011年4月12日 优先权日2010年4月13日
发明者M·巴卡, T·迪斯泰德, J·斯维斯, D·泰斯 申请人:米迪缪尼有限公司