专利名称：大菱鲆免疫球蛋白单克隆抗体的制备方法
技术领域：
本发明属于鱼类分子免疫学技术领域，具体涉及大菱鲆免疫球蛋白单克隆抗体的制备方法。
背景技术：
鱼类是具有细胞免疫和体液免疫系统的最低等的脊椎动物，免疫球蛋白是机体免疫应答反应的最主要介质。当鱼体受到外来物质刺激后(如病害、疫苗等)，其体内会产生相应的免疫球蛋白。据此，通过对特异性免疫球蛋白的检测，不仅可以早期诊断疾病，对疾病做出预警，也可以实时检测动物接种疫苗后体内抗体的应答反应，为有效的免疫程序制定提供保证。大菱鲆(Scophthalmus maximus)是我国引进的海水养殖名贵鱼种，因其生长快、 肉质鲜嫩等优点，已成为我国北方工厂化养殖的主要种类。然而随着其养殖规模的迅速扩大，养殖密度的不断增加，疾病问题日渐突出。在越来越高的环保和食品健康安全的要求下，以疫苗等为主要代表的新型病害防治手段得到广泛发展。因此，对大菱鲆免疫球蛋白及其抗体的研究在疾病早期检测和疫苗的开发应用中具有重要意义。目前，有关大菱鲆免疫球蛋白及其抗体的研究报道非常有限。相关大菱鲆免疫球蛋白的纯化方法只见一篇报道(魏鉴腾等，2008)，其纯化方法相对繁琐，且其纯化的目的是制备多克隆抗体(多抗)，而非单克隆抗体(单抗)。而单抗制备对免疫球蛋白纯度要求更高，且单抗能更精准的捕获微量的免疫球蛋白，提高检测的灵敏度和准确性，以此来提升大菱鲆病害防治水平，具有重要的理论和现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种大菱鲆免疫球蛋白单克隆抗体的制备方法，针对目前大菱鲆免疫球蛋白纯化方法进行改进，获得纯度更高的免疫球蛋白，进而制备其单抗；并将单抗运用于大菱鲆的病原早期诊断和免疫应答规律的研究。本发明的单克隆抗体的制备方法，包括有大菱鲆血清免疫球蛋白的分离纯化和杂交瘤细胞的制备、筛选步骤，其特征在于，所述的分离纯化是采用盐析法对大菱鲆血清免疫球蛋白进行粗提获得粗体液，再将粗提液透析后过kphadex-200凝胶柱得到大菱鲆血清免疫球蛋白。上述的kphadex-200凝胶柱的规格为80cmX 1. 5cm。上述的杂交瘤细胞的制备步骤是将纯化的大菱鲆血清免疫球蛋白免疫BALB/C小鼠后获得杂交瘤细胞。本发明建立了一种简单、便捷的大菱鲆免疫球蛋白纯化方法，可以获得高纯度的免疫球蛋白；将获得的免疫球蛋白用于制备大菱鲆免疫球蛋白的单克隆抗体，制备出的单抗建立间接酶联免疫吸附实验方法，能够检测多种病原的特异性免疫球蛋白(即抗体)，达到病原早期诊断的目的。并且能够对多种疫苗免疫效果进行评估，为正确的免疫程序制定
3提供数据支持。
图1 大菱鲆免疫球蛋白SDS-PAGE和Western-blot图。其中箭头所示位置为免疫球蛋白的重链(上端)和轻链(下端)，M-marker,1、大菱鲆免疫球蛋白SDS-PAGE ；2、大菱鲆免疫球蛋白western-blot分析图2 间接酶联免疫吸附法检测健康大菱鲆、患鳗弧菌病大菱鲆和经鳗弧菌疫苗免疫的大菱鲆血清特异性抗体水平。
具体实施例方式一、大菱鲆血清免疫球蛋白的分离纯化正常大菱鲆尾静脉采血，室温放置Ih后，4°C过夜，次日离心(5000r/min，30min， 4°C )分离血清，分装并保存于-70°C冰箱待用。盐析法对大菱鲆血清免疫球蛋白进行粗提，将大菱鲆血清以等体积0. 01mol/L(pH =7. 4)磷酸盐缓冲液(PBS)稀释后，在0. 01mol/L(pH = 5. 4)磷酸缓冲液(PB)中4°C透析，离心(3000r/min,30min,4°C )收集沉淀后，将沉淀溶解于0. lmol/L(pH = 5. 4)PB中后继续按上述方法透析，再次离心收集沉淀后并将其溶解于0. lmol/L(pH = 8.6)PB中，过 Sephadex-200 凝胶柱(80cmX 1. 5cm)进一步纯化，以 0. lmol/L(pH = 8. 6)PB 为洗脱缓冲液，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检验，收集纯度高的样品。结果显示，应用该方法所分析得到的免疫球蛋白有2条带，分子量分别是76kD和27kD，代表免疫球蛋白的重链和轻链(图1)，结果与文献报道一致；而且该纯化方法简便、易于操作。二、大菱鲆免疫球蛋白单克隆抗体的制备将纯化的大菱鲆血清IgM免疫BALB/C小鼠，应用细胞工程的方法生产融合的杂交瘤细胞。经过免疫学检测筛选方法，筛选出分泌大菱鲆免疫球蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，具体实施过程如下1.免疫小鼠1)基础免疫将纯化的大菱鲆免疫球蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混勻乳化后作为抗原，免疫剂量为0. anl，皮下注射6周龄BALB/C小鼠；2)加强免疫基础免疫3周后，用将纯化的大菱鲆免疫球蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混勻乳化后作为抗原，加强免疫小鼠，免疫剂量与方法同上；3) 二次加强免疫间隔3周后再次加强免疫一次，方法同上；4)融合前三天超免将纯化的大菱鲆免疫球蛋白作为抗原，腹腔和尾静脉分别注射小鼠进行超免，免疫剂量各为0. Iml02.饲养细胞制备1)脱颈椎处死正常BALB/C小鼠，无菌条件下轻轻剪开腹部皮毛(避免剪破腹膜)，将配备16号针头的注射器吸取5ml RPMI-1640培养基(含10 %新生牛血清和1 % HT) 后注射到小鼠腹膜内，同时轻压小鼠腹腔，然后将培养基吸入注射器内并移出；2)将吸出的腹腔液转移到M孔细胞培养板中，放入二氧化碳培养箱中培养，待用。
3.细胞融合1)脱颈椎处死免疫小鼠，无菌取出脾脏，过100目筛网后用GNK(含葡萄糖、NaCl、 KC1、酚红及磷酸盐)溶液洗涤2次，然后溶于IOmlGNK溶液，吹打形成单细胞悬液；2)取IO5个处于对数生长期的NSO骨髓瘤细胞(由英国国家动物健康研究院惠赠)，IOOOrpm离心lOmin，去上清液后，用40mlGNK溶液重悬；3)将脾细胞悬液和骨髓瘤细胞悬液混合均勻后，IOOOrpm离心lOmin，完全吸除上清液，轻弹离心管底，打散细胞，放入37°C水浴中；加入37°C预热好的聚乙二醇溶液lml，在 Imin内滴加完，然后在37°C水浴中缓慢转动90s ；4)继续加入已经预热到37°C的GNK溶液15ml (开始缓慢滴加，后来逐渐加快速度)，然后继续缓慢滴加GNK溶液至40ml，并在37°C水浴中静置5min ；5) IOOOrpm离心IOmin后，将沉淀的细胞用预热好的RPMI-1640培养基(含10% 新生牛血清和HAT)稀释后，加到96孔含饲养细胞的细胞培养板中；6)将培养板放入37°C、二氧化碳浓度为5%的培养箱中培养，倒置显微镜下观察细胞生长情况，大概5-7天后进行换液，吸出IOOul培养液，更换等量含HAT的培养液。4.筛选细胞融合后10天左右，观察细胞生长状态良好并开始检测筛选，将筛选的阳性杂交瘤细胞转移到M孔细胞培养板中进行扩大培养。检测筛选方法如下1)直接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞以0. 05mol/L(pH = 9. 6)碳酸盐溶液稀释大菱鲆免疫球蛋白至2 μ g/mL,取50 μ L稀释液加入酶标板孔中，置4°C冰箱中过夜包被，次日以 0. Olmol/L(pH = 7. 4)PBST (0. 05% Tween-20)洗涤 3 次，每次 3min ；用 5%猪血清于 37°C封闭lh，封闭结束后以PBST同法洗涤；加入杂交瘤细胞培养上清，每孔加入50μ L，阴性对照为细胞培养基，阳性对照为免疫小鼠血清，于37°C反应15min后以PBST同法洗涤； 然后每孔加入50 μ L羊抗鼠IgG-HRPd 1000稀释)，于37°C反应30min后洗涤；每孔加入新配制的50 μ L显色液TMB (四甲基联苯胺)显色5min后，加入2mol/L硫酸溶液50 μ L 终止反应；结果判定用自动酶标仪读取0D450值(Ρ/Ν彡2. 1时判定为阳性)。2)间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞以0. 05mol/L(pH = 9. 6)碳酸盐溶液稀释牛血清白蛋白(BSA)至2yg/mL，取50yL稀释液加入酶标板孔中，置4°C冰箱中过夜包被， 次日以 0. 01mol/L(pH = 7. 4)PBST(0. 05% Tween-20)洗涤 3 次，每次!3min ；用 5%猪血清于 37°C封闭lh，封闭结束后以PBST同法洗涤；将大菱鲆抗BSA血清作为第一抗体(1 1000 稀释)，每孔加入50yL，于37°C反应15min后以PBST同法洗涤；然后加入杂交瘤细胞培养上清，每孔加入50 μ L，阴性对照为细胞培养基，阳性对照为免疫小鼠血清，于37°C反应 15min后以PBST同法洗涤；然后每孔加入50 μ L羊抗鼠IgG-HRP(l 1000稀释)，于37°C 反应30min后洗涤；每孔加入新配制的50 μ L显色液TMB (四甲基联苯胺)显色5min后，加入2mol/L硫酸溶液50 μ L终止反应；结果判定用自动酶标仪读取0D450值(Ρ/Ν彡2. 1时判定为阳性)。5.克隆筛选获得16个阳性杂交瘤细胞，挑出4个进行克隆并检验，其余冻存。克隆、检验方法如下1)采用有限稀释法对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆将96孔细胞培养板各孔中加入IOOul的饲养细胞；然后把要克隆的阳性杂交瘤细胞孔中的细胞用血球计数板进行计数，用培养液以10倍梯度进行稀释，取出100个杂交瘤细胞；将取出的杂交瘤细胞混勻后，滴加到铺满饲养细胞的96孔板中，每孔加入lOOul，平均每孔含有一个杂交瘤细胞；然后放入二氧化碳培养箱中培养。期间，定期观察细胞生长状况并记录，并通过上述ELISA方法检测各培养孔的上清液，把所得阳性克隆孔的杂交瘤细胞按上述方法再克隆一次，以保证形成单克隆。2)ffestern-bloting法检验所获得的单克隆阳性杂交瘤细胞SDS_PAGE分离所提纯的大菱鲆免疫球蛋白，将电泳凝胶转印到硝酸纤维素膜(孔径0. 22um)上，转印完毕将硝酸纤维素膜用脱脂奶粉封闭lh，PBST洗涤后将硝酸纤维素膜置于获得的单克隆杂交瘤细胞培养上清中缓慢摇动lh，同法洗涤后，将硝酸纤维素膜置于羊抗鼠IgG-HRPd 1000 稀释)慢摇动lh，同法洗涤后，将硝酸纤维素膜放入HRP-DAB底物显色液中，至颜色清晰为止，然后将硝酸纤维素膜用去离子水冲洗干净后，置于滤纸间干燥，暗处保存。结果显示，该单抗与分子量为76KD的大菱鲆免疫球蛋白的重链发生特异性反应，显示为紫褐色条带(图 1)。6.冻存用滴管吹打混勻生长旺盛、形态良好的杂交瘤细胞孔，将其转移到离心管中 1200rpm离心7min，去上清，加冻存液(灭菌的小牛血清、RPMI-1640培养基和二甲基亚砜， 其体积比为45% 45% 10%)，使细胞终密度为IO6个/ml，然后转移到冻存管中。将冻存管放入小盒内，放入-20°C冰箱Ih后，转移到-80°C冰箱中过夜，再浸入液氮中长期保存。三、本发明研制的大菱鲆免疫球蛋白单抗的应用应用本发明研制的单抗建立间接酶联免疫吸附实验方法，能够检测多种病原的特异性免疫球蛋白(即抗体)，达到病原早期诊断的目的；同时，能够对多种疫苗免疫效果进行评估，为正确的免疫程序制定提供数据支持。1.取三种大菱鲆的血清健康大菱鲆血清、患鳗弧菌病大菱鲆(主要表现为腹部膨大，有腹水)、经鳗弧菌疫苗免疫过的大菱鲆血清。2.应用本发明研制的单抗建立间接ELISA方法以0. 05mol/L(pH = 9. 6)碳酸盐溶液稀释福尔马林灭活的鳗弧菌至107cfu/mL，取50 μ L稀释液加入酶标板孔中，置4°C冰箱中过夜包被，次日以 0. 01mol/L(pH = 7. 4)PBST(0. 05% Tween-20)洗涤 3 次，每次!3min ； 用5%猪血清于37°C封闭lh，封闭结束后以PBST同法洗涤；每孔加入大菱鲆血清O倍比稀释)50 μ L，于37°C反应30min后以PBST同法洗涤；然后加入本发明研制的大菱鲆免疫球蛋白单抗(1 5000稀释)作为第一抗体，每孔加入50 μ L，阴性对照为PBS，于37°C反应 30min后以PBST同法洗涤；然后每孔加入50 μ L羊抗鼠IgG-HRPd 1000稀释)作为第二抗体，于37°C反应30min后洗涤；每孔加入新配制的50 μ L显色液TMB (四甲基联苯胺) 显色5min后，加入2mol/L硫酸溶液50 μ L终止反应；结果判定用自动酶标仪读取0D450值 (Ρ/Ν彡2. 1时判定为阳性)。3.结果1)各组大菱鲆血清从10女22-10女28按照2倍比稀释后检测其特异性抗体水平， 结果发现免疫组、患病组大菱鲆抗体水平均高于健康组(图幻。这表明大菱鲆感染鳗弧菌病后，体内会产生针对鳗弧菌的特异性抗体。在大菱鲆感染鳗弧菌的早期，可以通过检测特异性抗体的产生，判断大菱鲆是否感染鳗弧菌病(以此类推，可以检验其他细菌性疾病、病毒性疾病、寄生虫性疾病等)，使得本发明制备的单抗能够检测多种病原的特异性免疫球蛋白(即抗体)，达到病原早期诊断的目的。 2)经鳗弧菌疫苗免疫后的大菱鲆，其血清特异性抗体水平明显升高，表明该疫苗已经发挥了一定的免疫效果(以此类推，可以检验其他疫苗免疫后的特异性抗体)，从而使本发明制备的单抗能够对多种疫苗免疫效果进行评估，为正确的免疫程序制定提供数据支持。
权利要求
1.一种大菱鲆免疫球蛋白单克隆抗体的制备方法，包括有大菱鲆血清免疫球蛋白的分离纯化和杂交瘤细胞的制备、筛选步骤，其特征在于，所述的分离纯化是采用盐析法对大菱鲆血清免疫球蛋白进行粗提获得粗提液，再将粗提液透析后过kphadex-200凝胶柱得到大菱鲆血清免疫球蛋白。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的kphadex-200凝胶柱的规格为 80cmX 1. 5cm0
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述杂交瘤细胞的制备步骤是将纯化的大菱鲆血清免疫球蛋白免疫BALB/C小鼠后获得杂交瘤细胞。
全文摘要
本发明涉及一种大菱鲆免疫球蛋白单克隆抗体的制备方法，包括有大菱鲆血清免疫球蛋白的分离纯化和杂交瘤细胞的制备、筛选步骤，其特征在于，所述的分离纯化是采用盐析法对大菱鲆血清免疫球蛋白进行粗提获得粗体液，再将粗提液透析后过Sephadex-200凝胶柱得到大菱鲆血清免疫球蛋白。本发明建立了一种简单、便捷的大菱鲆免疫球蛋白纯化方法，可以获得高纯度的免疫球蛋白；将获得的免疫球蛋白用于制备大菱鲆免疫球蛋白的单克隆抗体，制备出的单抗建立间接酶联免疫吸附实验方法，能够检测多种病原的特异性免疫球蛋白，达到病原早期诊断的目的。并且能够对多种疫苗免疫效果进行评估，为正确的免疫程序制定提供数据支持。
文档编号C07K1/14GK102399287SQ20111037357
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月22日 优先权日2011年11月22日
发明者丁福红, 张改平, 李青梅, 柴书军, 洪磊, 王蔚芳, 雷霁霖 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所