专利名称：广谱型流感疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及广谱型流感疫苗及其制备方法。
背景技术：
流感是由流感病毒引发的呼吸道传染性疾病，是到目前为止仍然对人类公共安全带来巨大威胁的疾病之一，人类历史上曾出现三次世界性大流感，导致5000万至1亿人死亡，超过两次世界大战死亡人数的总和。流感病毒的主要特点是病毒株变异快、疫情传播速度快，危害性大。在自然界中， 人和其它动物均是流感病毒的宿主，而发生于不同宿主的病毒株重组现象使新的流感病毒株不断地出现，给人类预防和控制流感疫情带来严峻的挑战。到目前为止，预防性流感疫苗是控制流感病毒引发疫情的最佳方式，针对流感病毒变异快、会发生抗原漂移或抗原突变等特点，世界卫生组织在全球建立了流感疫情监控网络，应用现代流行病学和生物技术手段，分析在下一个流感季节流行的病毒株，并以此为基础，确定在全球的不同区域的疫苗生产用毒株，用于预防性疫苗的生产。流感病毒株具有高度变异性，在不同的时间或不同的地点流行的流感病毒株血清型也存在较大的差异，因此，世界卫生组织根据流感病毒流行学调查和预测，不断更新病毒疫苗株，以预防流感的流行和蔓延。但是流感流行病学调查和预测具有不确定性，而且相对于流感的快速爆发和流行，用流行的病毒株研制生产疫苗有滞后效应等不利因素，因而不能有效地实现对流感的预防和控制。传统流感疫苗生产技术路线采用鸡胚培养法，而要在短时间内提供大量鸡胚、生产出满足健康人群大规模免疫接种的流感疫苗客观上存在很大的困难，这种矛盾在大流感爆发期间特别明显。因此，传统流感疫苗生产技术不利于在短时间内生产出大量流感疫苗， 不能及时的在健康人群中建立有效的免疫屏障，控制流感的大规模流行和蔓延。因此，研制对不同血清型的流感病毒均有预防保护效果的疫苗——广谱型流感疫苗成为全球疫苗研究领域的热点。在甲型流感病毒粒子和病毒感染的膜上表达了三种类型的跨膜蛋白(Krystyna Mozdzanowska et al,Vaccine. 2003(21) :2616-2627)红细胞凝集素和神经氨酸酶是分别具有大约510个和420个氨基酸的糖蛋白，相比之下，第三个跨膜蛋白为基质蛋白2 (M2)，它包含的胞外结构域(M2e)在人类的流感病毒株中是高度保守的。利用M2对甲型流感病毒感染的广泛的保护性免疫已有相关研究(Frace et al, (1999)Vaccine 17 =2237-44 ；Okuda et al, (2001)Vaccinel9 :3681-91) M2是97个氨基酸的非糖基化跨膜蛋白(Lamb et al, (1981)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 78 :4170-4 ；Lamb et al，(1985)Cell 40:627-33)。它形成同型四聚体，在病毒颗粒的膜上以低密度表达，但在被感染的细胞的质膜上以高密度表达。M2四聚体表现出pH诱导的质子运输活性，这似乎利于RNP复合物融合后从病毒膜上的释放，防止红细胞凝集素在成熟前受酸诱导的构象变化(Steinhauer et al, (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11525-9 ；Pinto et al, (1992)Cell 69:517-28)。在 23 个氨基酸序列的]\Ce 中，N-端的 9个氨基酸是完全保守的，在它靠近膜的15个氨基酸的部分中仅显示出相对低程度的结构多样性。在人类分离株HlNl，H2N2, H3N2和H5W亚型中，在7个位置出现了两个可以相互替换的氨基酸，但这些分离株的大部分实际上具有同样的序列。M2e特异性单克隆抗体14C2在体外不能防止病毒感染，但在掺入培养基或琼脂覆盖层中时能降低病毒的产量，减小噬菌斑的大小。表明抗体介导的病毒生长限制在体内和体外是通过不同机制进行的。使用不同类型的疫苗结构和接种形式已经测试了主动诱导的M2特异性免疫的保护效力，原因是能够导致病毒生长和死亡率的减少。Merck公司开发出预防流感的化学偶联物，如US2004/0223976A1和CN1756562A利用流感病毒中高度保守的，具有预防保护效果的抗原片段Μ^^ΠΗΑΟ蛋白质与载体蛋白OMP 偶联，目前该药物处于I期临床阶段。Acambis 公司开发出 M2e_HBc VLPsJn US 7361352B2 和 CN1913920A，同样利用流感病毒WMk片段，与乙肝核心抗原通过化学偶联形成抗流感病毒的嵌合体分子颗粒，目前该药物也处于I期临床阶段。HA在病毒成熟的过程中，裂解为HA1(冠状部分)和A2(茎状部分)。在生理状态下，冠状的A1暴露在病毒粒子表面，能被宿主的免疫系统识别并产生抗体，但其氨基酸变异程度很高，不同血清型病毒诱导产生的抗体没有交叉保护效果，这也就是传统流感病毒疫苗的缺点。A2部分被A1包裹，在正常的生理状态下不被机体免疫系统所识别，其只在病毒粒子和细胞融合的过程中暴露，由包裹状态转变为伸展状态，对病毒核酸最终进入宿主细胞起到关键的作用。经过基因序列比对分析，在A2部分中介导病毒和细胞融合的肽段(l-56aa)保守程度高，在甲型流感(Hmi)、季节性流感和禽流感中该序列同源性高达 90%。因此，HA2序列的保守肽段是研制广谱型流感疫苗的热点(Sui J，Hwang WC, Perez S， et al :Nat Struct Mol Biol. 2009Mar ； 16 (3) :265-73 ；Ekiert DC,Bhabha G,Elsliger MA et al :Science. 2009Apr 10 ；324(5924) :246-51)。目前全球流感形势严峻，新的流感病毒株如禽流感病毒(H5N1)和甲型流感病毒 (HlNl)不断出现，而且存在病毒重组产生新的、高致病性二代病毒的危险，已有的疫苗对新出现的病毒没有预防保护效果。因此，急需采用全新技术路线，研制广谱型的、对甲型 (HlNl)流感、禽流感(H5W)、该两种病毒重组产生的二代病毒和季节性流感病毒都具有预防保护效果的流感疫苗，彻底控制、消除流感的危害。
发明内容
本发明的目的在于提供一种广谱型流感疫苗及其制备方法。根据流感病毒最新研究结果，利用流感病毒中高度保守、具有预防保护效果的抗原片段Mk或撤218_72与载体蛋白P64K化学偶联，开发出广谱型的流感疫苗，能够有效的应对各型流感病毒，由该偶联物制备的广谱型疫苗易于大规模生产制备，且有效周期长，可以大量储备。克服了传统流感疫苗研制、生产技术路线的不足，从而实现对各种流感病毒引发的疫情及时、有效地控制。本发明的技术方案如下本发明的目的是提供一种预防流感的偶联物，所述的偶联物是由流感病毒中高度保守、具有预防保护效果的抗原片段Mk及其衍生的多肽或撤218_72蛋白质与载体蛋白共价连接而成。本发明一方面提供了一种M2e_载体蛋白偶联物，该偶联物是由甲型流感Hmi病毒M2蛋白质的胞外结构域(M2e)或其衍生的多肽与载体蛋白化学偶联而成。其中，所述的Mk或其衍生的多肽序列如SEQ ID NO 2所示SLLTEvETpTRX1EffEX2RX3SDSSDC[SEQ ID NO:2]其中，X1为苏氨酸、异亮氨酸或丝氨酸；X2为丝氨酸、天冬氨酸或半胱氨酸；X3为半胱氨酸、丙氨酸或丝氨酸。其中，所述的M2e或其衍生的多肽序列优选为SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列SLLTEVETPTRSEWECRCSDSSDC[SEQ ID NO :1]。其中，所述的载体蛋白选自脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K，破伤风类毒素，乙肝核心抗原，匙孔血蓝蛋白，轮状病毒衣壳蛋白，和牛或人乳头瘤病毒VLP的Ll蛋白的任意一种，优选为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K ；所述P64K的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 5所示；编码P64K的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 6所示。 本发明一方面提供了一种HA218_72-载体蛋白偶联物，该偶联物是由禽流感H5W病毒的HA218_72多肽与载体蛋白化学偶联而成。其中，所述的H/^18_72多肽具有SEQ ID NO 3所述的序列MVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFC[SEQ ID NO:3]。其中，所述的载体蛋白选自脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K，破伤风类毒素，乙肝核心抗原，匙孔血蓝蛋白，轮状病毒衣壳蛋白，和牛或人乳头瘤病毒VLP的Ll蛋白的任意一种；所述的载体蛋白优选为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K ；所述P64K的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 5所示；编码P64K的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 6所示。本发明所述的Mk及其衍生的多肽或HA218_72多肽与载体蛋白是通过硫醚键共价连接的。本发明所述的M2e是通过固相合成方法制备的。本发明所述的H/^18_72是将经基因工程菌表达而来；所述HA218_72编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 4所示；所述基因工程菌优选为大肠杆菌Ecoli. BL21。本发明一方面提供了 M2e_载体蛋白偶联物的制备方法，先将载体蛋白用活化剂活化，再与适当比例WMk或其衍生的多肽混合，反应得到偶联物；所述的Mk与载体蛋白的比例为(10-20) 1，优选为(12-18) 1，更优选为 15 1 ；所述偶联反应的pH值为6. 5-7. 5，优选为6. 8-7. 2 ；
所述偶联反应的时间为18-36小吋，优选为M小时；所述的活化齐[J为 SMCC (Succinimidyト4-(N-maleimidomethyl) cydohexane-l-carboxylate), MB S、m-maieimidobenzoyl-N-hyaroxysuccinimide ester), sulfo-MBC(m-maleimidoDenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester)的任思一 种，优选为SMCC。本发明一方面提供了 HA218_72-载体蛋白偶联物的制备方法，先将载体蛋白用活化 剂活化，再与适当比例的H/^18-72混合，反应得到偶联物；所述的H/^18_72与载体蛋白的比例为(10-20) 1，优选为(12-16) 1，更优选为 15 1 ；所述偶联反应的pH值为为6. 5-7. 5，优选为6. 8-7. 2 ；所述偶联反应的时间为18-36小吋，优选为M小时；所述的活化剂为SMCC，MBS, suIfo-MBS的任意ー种，优选为SMCC。本发明一方面提供了一种广谱型流感疫苗，所述的疫苗含有任意ー种M2e或其衍 生的多肽与载体蛋白的偶联物及相应的佐剂。本发明一方面提供了一种广谱型流感疫苗，所述的疫苗含有所HA218_72_载体蛋白 偶联物及相应的佐剂。本发明一方面提供了一种广谱型流感疫苗，所述的疫苗含有Mh或其衍生的多肽 与载体蛋白偶联物的任意ー种和HA218_72-载体蛋白偶联物及相应的佐剂。本发明的广谱型流感疫苗的毒副作用小，安全性高，耐受性好，能够有效预防甲型 H1N1，禽流感H5W流感病毒和其他病毒亚型的感染。用本发明的疫苗免疫小鼠，能够诱导 小鼠产生高水平的抗体，井能保护免疫小鼠对病毒的致死剂量攻击。
图1为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳2为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K的反相色谱图谱图3为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K的肽谱(胰蛋白酶)图4为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K的电泳图谱图5为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K的质谱分析图谱图6为Mh的反相高效液相色谱图谱图7为Mh的质谱分析图谱图8为M2e_P64K偶联物的SDS凝胶电泳9为M2e_P64K偶联物的凝胶色谱10为HA2(18_72)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果图11为HA2(18d的载体构建图12为H/^18_72的Mono Q纯化过程图谱图13为H/^18_72的SOURCE纯化过程图谱图 14 为 H/^18_72 的 SDS-PAGE 图谱图15为H/^18_72的反相高效液相色谱 16 为 H/^18_72-P64K 的 SDS-PAGE 图谱
图17为HA218_72-P64K的凝胶色谱18为M&-P64K偶联物的免疫原性分析抗体效价19为M&-P64K偶联物的免疫原性分析抗体亚型鉴定20为M&-P64K偶联物的免疫原性分析血清交叉反应图21为H/^18_72-P64K偶联物的免疫原性分析抗体效价图
实施例本发明的实施方案通过下列实施例举例说明。然而，应当理解，本发明的实施方案不限于这些实施例的特定细节，因为对于本领域的普通技术人员来说，其其他的变化是已知的，或根据直接公开的内容和附属的权利要求是显而易见的。因此，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。本文引用的参考文献以其全文通过引用并入本文。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1、脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)的制备1、脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)编码基因的克隆根据GenBank Accession No. X77920. 1的脑膜炎奈瑟氏菌的序列，采用Primer5. 0 软件设计引物，上游引物5-CATGCCATGGCTTTAGTTGAATTGAA-3，下游引物5-CCGGAATTCTTA TTTTTTCTTTTGCGGAG-3，其中下划线部分分别为NcoI和EcoRI的酶切位点。将脑膜炎奈瑟氏菌CMCC四336(购自中国医学细菌保藏中心，简称CMCC)于100°C条件下煮沸lOmin，吸取 3 μ 1作为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为3 μ 1模板，10XPCR缓冲液5 μ 1，IOmmol/ L dNTPl μ 1，Pyrobest高保真DNA聚合酶(上海生工产品)1 μ 1，终浓度为0. 5 μ mol/L的上下游引物各0. 5 μ 1，加超纯水至50 μ 1。PCR反应条件为先94°C预变性5min ；然后94°C 变性45s，50°C退火45s，72°C延伸^iiin ；共30个循环，最后72°C延伸IOmin。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。其中，泳道1为DL2000DNA分子量标准， 泳道2为P64K编码基因的PCR扩增产物。结果表明，扩增得到ISOObp左右的P64K的编码基因。对上述获得的P64K的编码基因进行测序，测序结果表明，其核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO :6所示，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO :5所示。2、载体和工程菌的构建回收上述目的片段，将回收的PCR产物和pET28a载体分别用NcoI和EcoRI进行双酶切，产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收酶切片段，将酶切产物与载体pET28a 的酶切产物以1 3的摩尔比进行混合，经T4DNA连接酶室温过夜连接，连接产物用CaCl2 法转化JM109感受态细胞，12小时后，挑取单克隆，用菌落PCR法筛选阳性克隆，得到表达 P64K的大肠杆菌工程菌。3、工程菌株大规模培养、脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)的纯化和检测将上述步骤2获得的表达P64K的大肠杆菌工程菌经三级培养放大，最后转至500L 的肉汤培养基中，发酵罐参数设置为搅拌速度350-400rpm，温度35-37°C，溶氧控制在 30-40 %，培养36-48小时后，终止培养。将培养液经连续高速离心进行固液分离以收集菌体，将收集到的菌体经高压勻浆后，离心去除菌体碎片，在上清液中加入固体硫酸铵，依次进行疏水层析、阴离子交换层析(Q-sepharose FF GE)和凝胶过滤(s印hadex s200GE)，得到 P64K 的原液。按照《中国人民共和国药典》2005年版第三部要求和质量标准对上述获得的P64K 原液进行纯度、残留杂质和结构鉴别，具体的检测结果如图1-5所示。其中，图2为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)的反相高效液相色谱图，检测波长为观此！!!，结果如图中所示只有一个峰，其色谱保留时间为7. 71分钟，色谱纯度为100% ；图3为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)肽谱(胰蛋白酶)，结果显示，上述获得的脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)与 P64K标准品(古巴分子免疫中心提供)的谱图完全一致；图4为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)的电泳图谱，P64K表示上述获得的由大肠杆菌工程菌表达的脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白(P64K)，LMWP表示低分子量蛋白标准品(GE公司提供)，在电泳谱图上，上述获得的 P64K只有一条带，纯度为100%;图5为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K的质谱分析图，分子量为61923. 7Da，与氨基酸序列推算的理论分子量一致。实施例2、M2e肽的制备l、iCe肽的固相合成以]\Ce肽序列 SLLTEVETPTRSETOCRCSDSSDC[SEQ ID NO :1]C末端的氨基酸Cys 为起始反应物，将其上的NH2用Fmoc保护，与载体iTrityl chloride resin (也可为Rink Amide resin或Wang resin)反应，摩尔比为1 1. 5，以DCM或DMF为反应溶剂，碱性条件下混合， 反应2小时左右；用碱性溶剂哌啶脱去连接在载体上第一个氨基酸氨基上的保护基Fmoc， 用DMF冲洗，去除过量的氨基酸，Fmoc等小分子物质；再加入活化剂DIC/H0BT混合物，以活化Cys N端的自由氨基，15分钟活化完毕后，加入第二个氨基酸(见SEQ ID N0:1)，依次循环，完成Mk肽上所有氨基酸的连接。合成完毕后，利用三氟乙酸切除载体Trityl chloride resin,以及M2e肽侧链上的保护基团，以得到完整的无保护基的M2e肽链。2、M2e肽的纯化和结构确证合成完毕后，利用制备高效液相色谱法纯化Mk肽，固定相为0. 1 %的CF3COOH/ H2O,流动相为0. 1 %的CF3C00H/CH3CN，具体的检测结果如图6-7所示。图6为Mk肽的反相高效液相色谱图，检测波长为280nm，结果显示，色谱保留时间为22. 53& η，色谱纯度为 96. 52%。图7 SiCe肽的质谱分析图，质谱分子量为沈70. 7Da，与氨基酸序列推算的理论
分子量一致。实施例3、M2e肽-P64K偶联物的制备1、P64K 的活化以 SMCC(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cydohexane-1-carboxylate)为活化剂，将摩尔比为1 20的P64K SMCC在pH 7. 2的磷酸盐缓冲液里混合，室温搅拌2 小时，加入适量甘氨酸终止反应，然后用超滤杯(MW:30KDa)超滤活化的P64K，以除去未反应的SMCC和过量的甘氨酸。2、偶联物的制备与纯化活化的P64K在已知浓度的情况下与M2e以摩尔比1 15的比例在pH6. 5，4°C的条件下反应Mh，用巯基乙醇终止反应。用超滤杯(MW:30KDa)纯化制得的偶联物，除去未参加反应的Mk和巯基乙醇等。实施例4、Μ2Θ-Ρ64Κ偶联物的结构分析 SDS-PAGE检测载体蛋白P64K与Mk的偶联度，如图8所示，泳道4为标准Marker，泳道3为M2e-P64K偶联物。利用凝胶色谱SuperdeX200，根据被检测分子的大小差异分离不同组分，分离条件流速:0. 5ml/min ；时间:55min ；检测波长:280nm ；温度室温；流动相磷酸盐缓冲液 pH6. 5。得到M2e-P64K的凝胶色谱图如图9所示，红色曲线为P64K，蓝色曲线为P64K-M& 偶联物。根据如下表的方法计算分子量P64K与M2e的偶联比例
分子量(KDa)P64k(KDa)M2(KDa)M2偶联数量P64k69. 25P64k-M2 (条带 1)93. 37569. 2524. 1259. 0P64k-M2 (条带 2)189. 03138. 550. 539. 4 由上表可以得出，P64K与M2e的偶联比例为1 9，即1个P64K分子可以偶联9 个]\Ce分子。实施例5、HA218_72多肽的制备1、HA218_72表达载体的构建根据大肠杆菌的密码子偏性，人工合成编码成熟的H/^18_72多肽的全长DNA序列， 其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。以上述合成的重组序列为模板，采用I^rimer 5. 0软件设计引物，上游引物5’GCC GGATCCGATGACGATGACAAAATGGTGGACGGCTGGTACGGC3，下游引物5，GCACGATCCGCTCGAGGCAGTTG TTAAACTCGCGGCCCACGGCC3’，下划线分别为BamHI和BioI酶切位点。采用PCR的方法，扩增 H/^18_72 基因。PCR 反应体系为5 μ LlO XPCR 缓冲液，4 μ L 2. 5mmol/L dNTP，Pyrobest 高保真DNA聚合酶0. 5 μ L，两条引物终浓度为0. 5 μ mol/L,模板0. 5 μ L，超纯水H2O补充反应体系至50 μ L0 PCR反应条件为95°C预变性5min后进入PCR循环。PCR反应参数为94°C变性45s，55 °C退火45s，72 °C延伸45s ；30个循环后，72°C延伸IOmin。将PCR扩增产物进行 1. 5%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。将PCR回收产物与pET28a载体分别进行BamHlAhoI双酶切，经1. 5 %琼脂糖凝胶电泳，结果如图10所示。其中，泳道1为上述步骤1的PCR产物经BamHIAhoI双酶切的酶切产物，切胶回收酶切片段。PCR酶切产物与pET28a酶切产物按1 3比例经T4DNA连接酶连接过夜，CaCl2法转化ToplO感受态。37°C培养12小时后，挑选单克隆，用菌落PCR法筛选阳性克隆。2、H/^18_72 小量表达将测序结果正确的表达载体？讨28￡1-撤218_72用CaCl2法转化Ecoli. BL21感受态细胞。如图11所示。挑选单菌落接种于5ml LB培养基中(卡那霉素60 μ g/ml)，37°C培养过夜。将过夜菌按1 100接种至IOml LB培养基中(卡那霉素60yg/ml)，37°C摇菌至0D_ =0. 4-1. 0，留取Iml培养物后，加入IPTG至终浓度lmmol/L，37°C诱导过夜。取Iml样品， 离心，收集菌体，超声破碎，然后4°C，12000rpm，离心lOmin。10% SDS-PAGE检测上清和沉淀中HA218_72的表达状况。
3、HA218_72的纯化和检测挑取高表达菌株单菌落至5mL LLB培养基中培养过夜作为种子。将种子按1 100 接种到2 X YT培养基中培养池，加入IPTG至终浓度为lmmol/L诱导表达Mi后离心收集菌体。每克湿重的菌体加入5mL缓冲液A (20m mmol/L Tris，pH 6. 5)重悬，超声破碎20min后离心取上清液经0. 22 μ m过滤后进行Mono Q离子交换层析。使用缓冲液B(20mmol/L Tris, 500mmol/L NaCl,pH 6. 5)进行阶段洗脱，先用20%的缓冲液B洗杂蛋白，再用30%的缓冲液B洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，见图12。通过kphadex G25将上一步纯化产物更换缓冲液至缓冲液C(5%乙腈，0.05%三氟乙酸)中进行SOURCE反相层析，使用缓冲液D(80%乙腈，0. 05%三氟乙酸)进行阶段洗脱，首先用25%的缓冲液D洗杂蛋白，接着用35%的缓冲液D洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，见图13。将收集到的目的蛋白冷冻干燥后置-20°C保存。 纯化产物的SDS-PAGE结果如图14所示。使用HPLC检测目的蛋白的纯度，色谱柱为ZORBAX 300SB-C8，溶液A为含0. 1 %三氟乙酸的超纯水，溶液B为含0. 三氟乙酸和90%乙腈的超纯水，洗脱的梯度过程为0至 100%的溶液B用时30min。检测结果显示目的蛋白的纯度在95. 7% (图15)。实施例6、HA218_72-P64K偶联物的制备1、P64K 的活化以 SMCC(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cydohexane-1-carboxylate)为活化剂，将摩尔比为1 20的P64K SMCC在pH 7. 2的磷酸盐缓冲液里混合，室温搅拌2 小时，加入适量甘氨酸终止反应，然后用超滤杯(MW:30KDa)超滤活化的P64K，以除去未反应的SMCC和过量的甘氨酸。2、偶联物的制备与纯化活化的P64K在已知浓度的情况下与M2e以摩尔比1 15的比例在pH 6. 5，4°C的条件下反应过夜，用巯基乙醇终止反应。用超滤杯(MW:30KDa)纯化制得的偶联物，除去未参加反应的Mk和巯基乙醇等。实施例7、HA218_72-P64K偶联物的结构表征SDS-PAGE检测载体蛋白P64K与HA218_72的偶联程度，如图16所示，泳道1为分子量标准Marker，泳道4为HA218_72_P64K偶联物。利用凝胶色谱SUperdeX200，根据被检测分子的大小差异分离不同组分。分离条件为流速:0. 5ml/min ；时间:55min ；检测波长:280nm ；温度室温；流动相磷酸盐缓冲液 PH6. 5。检测结果如图17所示，蓝色曲线为P64K ；红色曲线为Η/^18_72_Ρ64Κ偶联物。根据如下表的方法计算分子量Ρ64Κ与Η/^18_72的偶联比例
权利要求
1.一种HA218_72-载体蛋白偶联物，是由禽流感H5m病毒HA218_72多肽与载体蛋白化学偶联而成。
2.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述的撤218_72多肽具有SEQID NO 3 所述的序列。
3.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述的载体蛋白选自脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K，破伤风类毒素，乙肝核心抗原，匙孔血蓝蛋白，轮状病毒衣壳蛋白，和牛或人乳头瘤病毒VLP的Ll蛋白的任意一种；优选为脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白P64K，所述P64K的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 5所示。
4.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述的HA218_72多肽与载体蛋白通过硫醚键共价连接。
5.根据权利要求4所述的偶联物，其特征在于，所述的HA218_72多肽是经基因工程菌表达而来；所述HA218_72多肽编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 4所示；所述基因工程菌优选为大肠杆菌Ecoli. BL21。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的偶联物的制备方法，是先将载体蛋白用活化剂活化，再与适当比例的H/^18-72多肽混合，反应得到偶联物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的HA218_72多肽与载体蛋白的比例为 (10-20) 1，优选为(12-16) 1，更优选为 15 1 ；所述偶联反应的PH值为为6. 5-7. 5，优选为6. 8-7. 2 ；所述偶联反应的时间为18-36小时，优选为M小时；所述的活化剂为SMCC，MBS, suIfo-MBS的任意一种，优选为SMCC。
8.一种广谱型流感疫苗，其特征在于，所述的疫苗含有权利要求1中所述的偶联物和相应的佐剂。
全文摘要
本发明公开了广谱型流感疫苗及其制备方法。该疫苗包含由流感病毒中高度保守、具有预防保护效果的抗原片段M2e或HA218-72与载体蛋白化学偶联而成的偶联物。由该偶联物制备的广谱型疫苗易于大规模生产制备，且有效周期长，可以大量储备。克服了传统流感疫苗研制、生产技术路线的不足，从而实现对各种流感病毒引发的疫情及时、有效地控制。
文档编号C07K14/11GK102397559SQ20111036266
公开日2012年4月4日 申请日期2010年6月11日 优先权日2010年6月11日
发明者刘方杰, 孙宇石, 张琪, 李先钟, 杨思仪, 王鑫, 白先宏, 程虹, 胡品良, 阚伟 申请人:北京精益泰翔技术发展有限公司