专利名称：S-腺苷-l-甲硫氨酸对甲苯磺酸硫酸双盐的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物工程的生化分离领域，更具体地说，本发明涉及一种S-腺苷-L-甲硫氨酸对甲苯磺酸硫酸双盐的制备方法。
背景技术：
S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM, SAMe 或 AdoMet)是甲硫氨酸的有机四价硫形式(金属锍)的磺酰化合物，被称为“活性甲硫氨酸”，是广泛存在于生物体内的一种重要代谢中间体，1952年首先由Cantoni发现。SAM是双手性物质，具有2种异构体(R，S) -SAM和(S，S) -SAM,只有(S，S) -SAM具有生物活性。在生物体内，SAM是由L-甲硫氨酸(L-Met)和三磷酸腺苷(ATP)经 SAM 合成酶(S-adenosylmethionine synthetase) 催化合成。由于SAM含有一个能激活相邻碳原子的亲核攻击反应的高能锍原子，因而具有转甲基、转硫基、转氨丙基等作用。SAM参与了体内40多种生化反应，与蛋白质、核酸、神经递质、磷脂质和维生素的合成密切相关，并连接多胺和谷胱甘肽的转化。在欧洲，SAM已作为处方药广泛用于肝病、抑郁症、关节炎等疾病的治疗；在美国，已经成为一种畅销的保健品。 我国有众多的肝炎、关节炎以及抑郁症患者，SAM的需求量也将不断增长，产品的市场开发前景广阔。SAM分子由于高能锍离子的存在，表现出极端的不稳定性。无论是溶液或是干燥状态，室温或高于室温，中性或碱性条件下，均能生成不同的降解产物。SAM的失活反应可按照 3种不同的机理进行，最主要的失活反应是通过氨基酸链上的羧基氧对Y-碳原子进行分子内亲核攻击，从而裂解形成5’-甲硫腺苷(5’-methylthi0aden0Sine，MTA)和高丝氨酸内酯(homoserine)，随后内酯水解；其次是(S，S)_SAM自发消旋为非生物活性的(R，S)_SAM。 此外，SAM进行水解，生成腺嘌呤(adenine)和S-戊糖甲硫氨酸(S-pentosylmethionine)。SAM硫酸盐和SAM盐酸盐在干燥、低温条件下，稳定性仍较差，因此只能被用于一般生化研究。US3954726,US4028183证实SAM的对甲苯磺酸硫酸双盐的稳定性比单纯的SAM 盐酸盐、硫酸盐有很大的提高，在45°C干燥条件下，前者6个月后基本没有损失，而后两者 6个月后全部损失；因此，临床上使用的SAM盐主要是SAM对甲苯磺酸硫酸双盐。目前有许多关于SAM双盐制备以及通过添加物来提高稳定性的报道。US39547^、US4057686虽然均能够制得较纯的SAM双盐，但由于需要价格较高的反应物，不适合工业化生产。EPA0141914 虽然提供了一种适合工业化生产的SAM双盐制备方法，但其破碎用的乙酸乙酯有机溶剂不易回收，且需要对废菌丝体进行干燥，避免其上残留的有机溶剂挥发。此外，树脂的处理能力有限，相同处理量需要的树脂量较大，洗脱液需要经过另一种树脂处理，以吸附其中的杂质，步骤复杂。EPA1091001采用的破碎方式很环保，但其对设备要求严格。其选用的树脂有较高的交换容量，但其除杂能力有限，洗脱后需要选用树脂脱色。Cm907996其破碎需要用有机溶剂，回收困难；离子交换过程洗脱步骤复杂，耗水量大；需要过阴离子交换柱脱色浓缩；洗脱液产品浓度低，浓缩12倍后的浓度类似于本专利未浓缩的浓度。姚进孝，等人，“热水提取酿酒酵母中S-腺苷-L-甲硫氨酸的研究，生物加工过程，2008,6 (1)，74 77”，采用热水法直接提取酿酒酵母胞内产物S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)， 并对影响SAM抽提的反应条件进行了优化，得出的最佳实验条件为每30g湿菌体加入热水 100mL、硫酸浓度0. 25mol/L、搅拌转速160r/min，反应温度70 76°C、反应时间lOmin。采用该方法SAM的抽提率可达90%以上。但是，SAM是一种热不稳定性物质，当溶液温度大于 60°C时，SAM的降解速率迅速增大。当反应时间超过30min时，SAM严重降解，SAM的抽提率降低到50%以下。尤其是随着处理量增大，受热不均勻程度增加，升温和降温速度减小，导致菌体大量降解，SAM的抽提率降低，造成较大的SAM损失。因此，为降低SAM降解率，减小 SAM的损失，SAM提取过程要求严格控制反应温度和反应时间，并要求系统具有较高的升温及降温速度，对设备和操作要求较高，成本较高，该方法仅限于实验室使用，不适于工业应用。目前，需要开发一种适合工业化生产的、低损耗、低成本、高收率、高纯度的SAM对甲苯磺酸硫酸双盐的制备技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种S-腺苷-L-甲硫氨酸对甲苯磺酸硫酸双盐的制备方法。该方法用于制备SAM对甲苯磺酸硫酸双盐，处理量大，纯度高，收率高，成本低廉，并适于工业化生产。为此，本发明提供了 1. 一种S-腺苷-L-甲硫氨酸对甲苯磺酸硫酸双盐的制备方法，包括步骤A，收集菌体；步骤B，提取SAM，制得SAM萃取液； 步骤C，对SAM萃取液进行超滤，制得SAM滤液；步骤D，采用离子交换法对SAM滤液进行离子交换处理，制得SAM洗脱液；步骤E，对SAM洗脱液进行沉淀处理，制得SAM沉淀；步骤F，制备SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液；步骤G，干燥SAM对甲苯磺酸硫酸双盐；其中，步骤B采用酸热法对步骤A所收集的菌体进行破碎及萃取，反应温度为 30 60°C，反应时间控制在0. 5 池。步骤B的反应温度优选为45 55°C。在本发明的一个实施例中，在制备SAM的发酵过程中，采用酿酒酵母高密度发酵， 通过补加前体L-甲硫氨酸，使所得到的发酵液具有较高的富含SAM的菌体含量。步骤A，在 4°C条件下，以6000rpm的转速将发酵液离心处理lOmin，收集菌体。根据本发明方法，步骤B的反应过程中均质机的转速控制在300 lOOOOrpm。步骤B中所述酸为硫酸溶液，其浓度为0. 1 0. 5M，用量为2 5L/kg湿菌体。采用冷水将细胞破碎液降温，并在4°C条件下，以6000rpm转速离心处理lOmin，收集上清液，得到SAM萃取液，SAM萃取液收率为85% 90%。在本发明的一个实施例中，步骤C采用超滤膜对SAM萃取液进行超滤处理，以除去蛋白质等杂质。所述超滤膜为截留分子量为6000 10000的超滤膜。超滤步骤损失很少， SAM滤液收率大于98%。根据本发明方法，步骤D包括用离子交换树脂处理SAM滤液，使SAM吸附于离子交换树脂表面，然后用去离子水洗脱杂质，再用洗脱剂洗脱SAM，其中，所述离子交换树脂为大孔弱酸性离子交换树脂。所述离子交换树脂的交换容量为90 120g SAM/L树脂。根据本发明方法，离子交换处理过程中通过15% 20%的NaOH将pH控制在4 7。该离子交换树脂对杂质吸附量少，除杂过程简单。在本发明的一个实施例中，步骤D中所述SAM滤液的进料浓度为4 10g/L，进料速度为1 4BV/h (BV为柱体积)，进料量为12 22. 5BV。所述去离子水的流速为1 4BV/ h，用量为4 6BV。所述洗脱剂为硫酸溶液，其浓度为0. 05 0. 25M，流速为1 4BV/h。 所制得的洗脱液中SAM浓度为22 35g/L，SAM洗脱液回收率为93 96%。在本发明的另一个实施例中，步骤E将相当于洗脱液体积6 10倍的丙酮加入 SAM洗脱液进行沉淀处理，静止陈化Mh，滤去上清液，制得SAM沉淀。根据本发明方法，步骤F采用对甲苯磺酸/硫酸溶液将SAM沉淀溶解，制得SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液，其中SAM/对甲苯磺酸/硫酸的比例为1 1 1.5 1 3 3。 所述对甲苯磺酸/硫酸溶液的浓度为0. 5M 2M。在本发明的一个实施例中，步骤G采用冷冻干燥或者真空干燥法，将SAM对甲苯磺酸硫酸双盐干燥，制得纯度为96 98wt%的SAM对甲苯磺酸硫酸双盐，产品为白色粉末。本发明在30 60°C条件下，采用酸热法进行细胞破碎和SAM萃取，萃取过程对系统升温和降温速度要求不高，菌体处理量大，细胞破碎率和SAM提取率高，且所制得的萃取液中不含残留有机溶剂，使本发明所选树脂实现了对SAM较大的吸附容量和较强的吸附专一性。根据本发明方法所制得的洗脱液所含的SAM与硫酸根、对甲苯磺酸的配比可调控为符合成盐的比例，且杂质含量少、SAM浓度高，从而可以省略脱色除杂以及浓缩步骤，大大简化了分离过程。沉淀用的丙酮进行回收后可重复使用。本发明工艺路线简单，处理量大，产品回收率高达75 % 80 %，产品中活性成分(S，S) -SAM所占比例大于90 %，产品纯度高达 96 98%，相应指标符合药典要求，且生产成本低，可实现工业化生产。
具体实施例方式下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。实施例实施例1 (1)在制备SAM的发酵过程中，采用酿酒酵母高密度发酵，通过补加前体L-甲硫氨酸，使所得到的发酵液具有较高的富含SAM的菌体含量。发酵结束后，在4°C条件下，以 6000rpm的转速将30L发酵液离心处理lOmin，得到约IOkg湿菌体。(2)取8kg步骤(1)中所制得的湿菌体，加入24L50°C、0. IM H2SO4溶液，在50°C 条件下，均质处理lh，均质器转速为500rpm。菌体破碎后用冷水降温，并在4°C条件下以 6000rpm的转速离心处理IOmin去除菌体碎片，得到SAM萃取液，其产量、浓度及收率见表 1。(3)采用截留分子量为10000的超滤膜对步骤( 所制得的SAM萃取液进行超滤处理，去除蛋白质类杂质，制得SAM滤液。(4)用15 %的NaOH溶液将步骤(3)所制得的SAM滤液的pH调节至5，送入柱体积约为1.9L的离子交换柱进行离子交换处理，其树脂的交换容量为110g/L树脂，SAM的进料浓度为7. 2g/L，进料速度为1. 5BV/h，进料量为15. 3BV ；进料结束后用6BV的去离子水洗脱杂质，去离子水的流速为4BV/h ；最后用0. 15M的H2SO4溶液作洗脱剂洗脱离子交换树脂表面所吸附的SAM，H2SO4溶液的流速为2BV/h，得到SAM洗脱液，其产量及浓度见表1。(5)加入相当于步骤⑷所制得的SAM洗脱液7倍体积的丙酮对步骤⑷所制得的SAM洗脱液进行沉淀处理，静止陈化Mh，滤去上清液，收集SAM沉淀。(6)采用浓度为IM的对甲苯磺酸/硫酸溶液溶解步骤(5)中所制得的SAM沉淀， 制得SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液，其SAM/对甲苯磺酸/硫酸的比例为1 1 2。(7)将步骤(6)中所制得的浓缩SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液进行冷冻干燥，得到白色粉末状SAM对甲苯磺酸硫酸双盐，其纯度、产量及SAM的总回收率见表1。实施例2 实施例2与实施例1不同的是(2)取Ikg步骤(1)中所制得的湿菌体，加入5L30°C、0· 2M的H2SO4溶液，在30°C 条件下，均质处理池，均质器转速为300rpm，结果见表1。(3)采用截留分子量为6000的超滤膜对步骤( 所制得的SAM萃取液进行超滤处理。 (4)用20 %的NaOH溶液将步骤(3)所制得的SAM滤液的pH调节至7，送入柱体积约为0. 3L的离子交换柱进行离子交换处理，其树脂的交换容量为90g/L树脂，SAM的进料浓度为4. Og/L，进料速度为4. OBV/h，进料量为22. 5BV ；去离子水的用量为5BV，流速为IBV/ h ；硫酸溶液的浓度为0. 05M，流速为lBV/h，结果见表1。(5)加入相当于步骤(4)所制得的SAM洗脱液6倍体积的丙酮对步骤(4)所制得的SAM洗脱液进行沉淀处理。(6)采用浓度为0.5M的对甲苯磺酸/硫酸溶液溶解步骤(5)中所制得的SAM沉淀，制得SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液，其SAM/对甲苯磺酸/硫酸的比例为1 1 1.5。(7)将步骤(6)中所制得的浓缩SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液进行真空干燥，结果见表1。实施例3 实施例3与实施例1不同的是(2)取IOkg步骤⑴中所制得的湿菌体，加入20L60°C、0. 5M的溶液，在60°C 条件下，均质处理0.证，均质器转速为600rpm，结果见表1。(3)采用截留分子量为6000的超滤膜对步骤( 所制得的SAM萃取液进行超滤处理。(4)用20 %的NaOH溶液将步骤(3)所制得的SAM滤液的pH调节至4，送入柱体积约为2. IL的离子交换柱进行离子交换处理，其树脂的交换容量为120g/L树脂，SAM的进料浓度为10. Og/L，进料速度为1. OBV/h，进料量为12. OBV ；去离子水的用量为4BV，流速为 2BV/h ；硫酸溶液的浓度为0. 25M，流速为4BV/h，结果见表1。(5)加入相当于步骤⑷所制得的SAM洗脱液8倍体积的丙酮对步骤⑷所制得的SAM洗脱液进行沉淀处理。(6)采用浓度为2. OM的对甲苯磺酸/硫酸溶液溶解步骤(5)中所制得的SAM沉
6淀，制得SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液，其SAM/对甲苯磺酸/硫酸的比例为1 3 3。(7)将步骤(6)中所制得的浓缩SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液进行真空干燥，结果见表1。实施例4 实施例4与实施例1不同的是(2)取5kg步骤(1)中所制得的湿菌体，加入20L45°C、0. 2M H2SO4溶液，在45°C 条件下，均质处理池，均质器转速为500rpm。菌体破碎后用冷水降温，并在4°C条件下以 6000rpm的转速离心处理IOmin去除菌体碎片，结果见表1。(3)采用截留分子量为10000的超滤膜对步骤( 所制得的SAM萃取液进行超滤处理，去除蛋白质类杂质，制得SAM滤液。(4)用20 %的NaOH溶液将步骤(3)所制得的SAM滤液的pH调节至6，送入柱体积约为1. 3L的离子交换柱进行离子交换处理，其树脂的交换容量为100g/L树脂，SAM的进料浓度为5. 8g/L，进料速度为2BV/h，进料量为17. 3BV ；进料结束后用6BV的去离子水洗脱杂质，去离子水的流速为:3BV/h ；最后用0. IM的H2SO4溶液作洗脱剂洗脱离子交换树脂表面所吸附的SAM，H2SO4溶液的流速为1. 5BV/h,结果见表1。(5)加入相当于步骤(4)所制得的SAM洗脱液6倍体积的丙酮对步骤(4)所制得的SAM洗脱液进行沉淀处理，静止陈化Mh，滤去上清液，收集SAM沉淀。(6)采用浓度为IM的对甲苯磺酸/硫酸溶液溶解步骤(5)中所制得的SAM沉淀， 制得SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液，其SAM/对甲苯磺酸/硫酸的比例为1 2 2。(7)将步骤(6)中所制得的浓缩SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液进行冷冻干燥，结果见表1。实施例5:(2)取7kg步骤(1)中所制得的湿菌体，加入17L55°C、0. 3M H2SO4溶液，在55°C 条件下，均质处理lh，均质器转速为400rpm。菌体破碎后用冷水降温，并在4°C条件下以 6000rpm的转速离心处理IOmin去除菌体碎片，结果见表1。(3)采用截留分子量为6000的超滤膜对步骤( 所制得的SAM萃取液进行超滤处理，去除蛋白质类杂质，制得SAM滤液。(4)用15 %的NaOH溶液将步骤(3)所制得的SAM滤液的pH调节至5，送入柱体积约为1. 6L的离子交换柱进行离子交换处理，其树脂的交换容量为112g/L树脂，SAM的进料浓度为8. 5g/L，进料速度为2. 5BV/h，进料量为13. 2BV ；进料结束后用5BV的去离子水洗脱杂质，去离子水的流速为3BV/h ；最后用0. 2M的H2SO4溶液作洗脱剂洗脱离子交换树脂表面所吸附的SAM，H2SO4溶液的流速为2. 5BV/h,结果见表1。(5)加入相当于步骤(4)所制得的SAM洗脱液7倍体积的丙酮对步骤(4)所制得的SAM洗脱液进行沉淀处理，静止陈化Mh，滤去上清液，收集SAM沉淀。(6)采用浓度为1.5M的对甲苯磺酸/硫酸溶液溶解步骤(5)中所制得的SAM沉淀，制得SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液，其SAM/对甲苯磺酸/硫酸的比例为1 2 3。(7)将步骤(6)中所制得的浓缩SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液进行冷冻干燥，结果见表1。对比例1
对比例1与实施例1不同的是(2)取Ikg步骤(1)中所制得的湿菌体，采用500ml、50%的乙酸乙酯水溶液处理 40min,再加入2BV (1000ml)的0. 4mol/L硫酸溶液处理90min，然后对菌体进行破碎及离心处理。其他反应条件与实施例1相同，结果见表1。以对比例1步骤(2)所获得的萃取液制备与实施例1相同配比、相同质量及纯度的SAM对甲苯磺酸硫酸双盐产品，相同树脂的用量需增加50wt%。从上述实施例和对比例及表1可以看出，根据本发明方法进行细胞破碎和SAM萃取，由于过程中没有使用乙酸乙酯类有机溶剂，所获得的SAM萃取液中没有残留有机溶剂， 离子交换过程中不存在有机溶剂对于扩散的不良影响，树脂对目标产物SAM具有较大的吸附容量和较强的吸附专一性，由此树脂的单位处理量和树脂利用率都有较大提高，目标产品的收率和纯度也有较大提高，且制备成本降低。对比例2:对比例2与实施例1不同的是(2)取Ikg步骤(1)中所制得的湿菌体，采用3L70°C、0. IM H2SO4溶液，在70°C条件下，均质处理30min，其他反应条件与实施例1相同，结果见表1。从上述实施例和对比例及表1可以看出，在70°C条件下提取SAM，由于处理量较大，菌体受热不均勻，系统升温和降温不够迅速，即使反应时间为30min，也会造成大量SAM 降解，从而降低SAM萃取液收率，并最终降低SAM的总回收率；根据本发明方法提取SAM， 由于反应温度较低，菌体受热较均勻，对系统升温和降温速度要求不高，不会造成SAM的降解，即使反应时间延长至3h，处理量增大到10kg，仍能获得较高的细胞破碎率和SAM提取率，从而获得较高的SAM总回收率。表 权利要求
1.一种S-腺苷-L-甲硫氨酸对甲苯磺酸硫酸双盐的制备方法，包括步骤A，收集菌体；步骤B，提取SAM，制得SAM萃取液；步骤C，对SAM萃取液进行超滤，制得SAM滤液；步骤D，采用离子交换法对SAM滤液进行离子交换处理，制得SAM洗脱液；步骤E，对SAM洗脱液进行沉淀处理，制得SAM沉淀；步骤F，制备SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液；步骤G，干燥SAM对甲苯磺酸硫酸双盐；其中，步骤B采用酸热法对步骤A所收集的菌体进行破碎及萃取，反应温度为30 600C，反应时间控制在0. 5 汕。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤B的反应温度为45 55°C。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤B中所述酸为硫酸溶液，其浓度为 0. 1 0. 5M，用量为2 5L/kg湿菌体。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤D包括用离子交换树脂处理SAM滤液，使SAM吸附于离子交换树脂表面，然后用去离子水洗脱杂质，再用洗脱剂洗脱SAM，其中，所述离子交换树脂为大孔弱酸性离子交换树脂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述离子交换树脂的交换容量为90 120g SAM/L 树脂。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤D中所述SAM滤液的进料浓度为4 10g/L，进料速度为1 4BV/h，进料量为12 22. 5BV。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤D中所述去离子水的流速为1 4BV/ h，用量为4 6BV。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤D中所述洗脱剂为硫酸溶液，其浓度为0. 05 0. 25M,流速为1 4BV/h0
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤F采用对甲苯磺酸/硫酸溶液将 SAM沉淀溶解，制得SAM对甲苯磺酸硫酸双盐溶液，其中SAM/对甲苯磺酸/硫酸的比例为 1 1 1. 5 1 3 3。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述对甲苯磺酸/硫酸溶液的浓度为 0. 5M 2M。
全文摘要
本发明公开了一种S-腺苷-L-甲硫氨酸对甲苯磺酸硫酸双盐的制备方法。该方法包括将经菌体收集、酸热法细胞破碎、提取和分离纯化制得的S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)进行沉淀，调控硫酸根与对甲苯磺酸根比例，并经干燥制得高纯度SAM对甲苯磺酸硫酸双盐。本发明工艺路线简单，处理量大，产品回收率高为75％～80％，产品中活性成分所占比例大于90％，产品纯度高为96～98％，相应指标符合药典要求，且生产成本低，可实现工业化生产。
文档编号C07H1/00GK102321136SQ201110277200
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月19日 优先权日2011年9月19日
发明者姚进孝, 孙龙, 李晓楠, 王峥, 王杰鹏, 谭天伟 申请人:北京化工大学