专利名称：纳他霉素片状晶体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种从菌丝体中制备纳他霉素片状晶体的方法。
背景技术：
纳他霉素(Natamycin)又称匹马霉素(Pimaricin)是一种多烯大环内酯类抗生素，它能够抑制酵母菌和霉菌的生长，且不作用于人体肠道内的正常菌群。自1996年起我国食品添加剂委员会就对纳他霉素进行了应用方面的跟踪研究与评价，2011年正式出台了纳他霉素的国家标准，作为食品防霉剂用于奶酪、糕点、肉肠等食品的加工过程中。纳他霉素分子式为C33H47N013 ；分子量为665. 75道尔顿；是两性化合物，等电点为 6. 5。纳他霉素由链霉菌发酵产生，发酵液经液固分离后，收集菌丝体，通过添加有机溶媒和调节PH的方法，最终可以得到纳他霉素的晶体。纳他霉素的晶习有片状与针状两种， 它们都属于α-纳他霉素晶系。在纳他霉素的分离纯化过程中，纳他霉素的不同晶习会影响纳他霉素晶体的过滤速度和干燥时间。针状晶习易于聚结成团，在聚结时又易于包裹杂质而影响纯度，同时增加过滤、洗涤及干燥的难度。采用中国专利CN101062934A公布的提取方法制得的纳他霉素晶体是短针状的或无定形的，不利于纳他霉素晶体的过滤及干燥，过滤和干燥时间都较长。
发明内容
本发明的目的是提供一种纳他霉素片状晶体的制备方法，它可制得均一的纳他霉素片状晶体，从而降低后续晶体洗涤与干燥的难度，缩短晶体的过滤和干燥时间。本发明技术方案是这样构成的一种纳他霉素片状晶体的制备方法，其特征在于 它包括以下步骤a、取纳他霉素菌丝体加入甲醇与水的混合液中；所述的甲醇与水的混合液中，甲醇与水的体积比为60-90 40-10 ；每IL甲醇与水的混合液添加90_110g纳他霉素菌丝体；b、用碱性物质均勻搅拌调节步骤a获得的溶液的pH值至10-12，使纳他霉素溶解于混合溶液中；C、将步骤b获得的溶液进行液固分离，收集滤液得到纳他霉素的提取液；d、浓缩步骤c获得的纳他霉素的提取液至纳他霉素含量在18 ^mg/ml之间，并絮凝去除在此过程中析出的不溶物，得到纳他霉素精提取液；e、分两阶段酸化步骤d获得的纳他霉素精提取液第一阶段一边搅拌纳他霉素精提取液一边缓慢滴加酸，使纳他霉素精提取液的PH 值逐步降低到8-9，在pH值不再回升的情况下，再搅拌1小时以上；第二阶段继续一边搅拌纳他霉素精提取液一边缓慢滴加酸，使纳他霉素精提取液的pH值逐步降低到6-7，在pH值不再回升的情况下，再搅拌3小时以上，得到片状的纳他霉素晶体的结晶液；f、将步骤e获得的纳他霉素晶体的结晶液进行液固分离，然后真空干燥得到片状纳他霉素晶体。本发明的制备原理说明如下本发明的申请人通过研究发现纳他霉素提取液中甲醇的含量对晶习有很大的影响，并且在纳他霉素的结晶过程中养晶工艺可以改善片状晶体的颗粒分布，提高纳他霉素晶体的纯度。根据以上两点，本发明采用一定比例的甲醇与水的混合液从纳他霉素菌丝体中提取并纯化纳他霉素，然后通过结晶和养晶工艺，分阶段酸化纳他霉素精提取液，从而制备获得片状的纯度较高的纳他霉素晶体。分阶段酸化纳他霉素精提取液的目的在于在第一阶段，通过滴加酸使纳他霉素精提取液的PH值缓慢而有控制的下降，即缓慢而有控制的降低纳他霉素的溶解度，防止纳他霉素爆发成核的现象出现；此时结晶与溶解趋向平衡，利于晶体的长大，但此时溶解度较大，直接过滤的话收率低，所以平稳后继续调节PH到第二阶段，此时达到纳他霉素的等电点，溶解度最小，收率高。如果直接调到等电点，则纳他霉素快速结晶，得到的晶体粒度不均一且包裹杂质。第二阶段继续缓慢而有控制地调节pH值至6 7的目的在于使纳他霉素的析出主要发生在已形成的晶核的表面，由此得到的纳他霉素片状晶体颗粒较大、粒度分布较均勻，纯度较高。较之现有技术而言，本发明的优点在于本发明以纳他霉素培养物的菌丝体为对象，通过控制提取液中甲醇与水的比例以及纳他霉素的结晶过程，从而可制得均一的纳他霉素片状晶体，降低后续晶体过滤与干燥的难度，缩短晶体的过滤和干燥时间，便于工业化的生产控制。
图1是实施例1所得片状晶体的显微照相晶体形貌图。图2是实施例4所得晶体的显微照相晶体形貌图。图3是对比实验组的组9所得晶体的显微照相晶体形貌图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
、实施例及说明书附图对本发明内容进行详细说明一具体实施例方式本发明具体实施方式
提供了一种纳他霉素片状晶体的制备方法，其特征在于它包括以下步骤a、取纳他霉素菌丝体加入甲醇与水的混合液中；所述的甲醇与水的混合液中，甲醇与水的体积比为60-90 40-10 ；每IL甲醇与水的混合液添加90_110g纳他霉素菌丝体；本步骤中所述的纳他霉素菌丝体为纳他霉素发酵液通过液固分离技术得到的湿菌丝体或干燥菌丝体，优选水分含量的干燥菌丝体。当然，也可采用湿菌丝体，如果湿菌丝体的含水量较高，则最好预先测定一下湿菌丝体的水分含量，这样在制备甲醇与水的混合液时可适当相应减少水的比例。所述的甲醇与水的体积比优选为73 27，每IL甲醇与水的混合液优选添加IOOg纳他霉素菌丝体。b、用碱性物质均勻搅拌调节步骤a获得的溶液的pH值至10-12，使纳他霉素溶解于混合溶液中；本步骤所述的碱性物质优选为氢氧化钠或氨水等，为工业上常用的调节溶液至碱性的物质。C、将步骤b获得的溶液进行液固分离，收集滤液得到纳他霉素的提取液；本步骤所述的液固分离方法可采用在抗生素提取过程中常用的液固分离方法，如板框过滤、重力离心、抽滤、错流过滤等，其目的在于去除菌渣，收集滤液以得到纳他霉素的提取液。d、浓缩步骤c获得的纳他霉素的提取液至纳他霉素含量在18 ^mg/ml之间，并絮凝去除在此过程中析出的不溶物，得到纳他霉素精提取液；本步骤所述的浓缩方法可采用常用的真空浓缩法。e、分两阶段酸化步骤d获得的纳他霉素精提取液第一阶段一边搅拌纳他霉素精提取液一边缓慢滴加酸，使纳他霉素精提取液的PH 值逐步降低到8-9(最优值依据纳他霉素的浓度而定，如当纳他霉素的浓度为22mg/ml时， PH值是8. 6)，在pH值不再回升的情况下，再搅拌1小时以上(优选1小时)，使纳他霉素的成核与晶体生长达到平衡；第二阶段继续一边搅拌纳他霉素精提取液一边缓慢滴加酸，使纳他霉素精提取液的pH值逐步降低到6-7，在pH值不再回升的情况下，再搅拌3小时以上(优选3-5小时)， 得到片状的纳他霉素晶体的结晶液。本步骤的酸化调节过程使用的酸为工业上常用的酸，如盐酸、硫酸等。本步骤中搅拌为常规的勻速搅拌方法，如磁力搅拌、机械搅拌等，搅拌的目的一方面在于使结晶液混合均勻，避免局部PH过低引起纳他霉素爆发成核，另一方面可以使纳他霉素的晶体充分悬浮于结晶液中，避免晶体粘结包裹杂质。f、将步骤e获得的纳他霉素晶体的结晶液进行液固分离，然后真空干燥得到片状纳他霉素晶体。本步骤中所述的结晶液的液固分离选用任意常规的固液分离方法皆可，如抽滤、 离心过滤等。本步骤经液固分离得到的纳他霉素晶体，可用50%乙醇-水(V V)溶液洗涤3次，于50°C、-0. 09MI^条件下真空干燥至恒重，即可得到白色微带淡黄色的片状纳他霉素晶体，纯度约90%。二、具体实施例实施例1取纳他霉素的干燥菌丝体100g，其中纳他霉素含量为11. 2% (w/w)，加入IL甲醇与水的混合液(甲醇与水的体积比为75 25)，搅拌使菌丝体充分悬浮。用lOmol/L的NaOH 调节PH值至11. 35后搅拌1小时。抽滤分离菌渣，收集滤液，得到黄棕色的纳他霉素提取液。浓缩纳他霉素的提取液至纳他霉素的含量为22. 6mg/ml，并絮凝去除在此过程中析出的不溶物，得到纳他霉素的精提取液。随后一边搅拌一边缓慢滴加lOmol/L的HC1，使纳他霉素精提取液的PH值逐步降低至8. 65，在pH值不再回升的情况下，再搅拌1小时。接着继续一边搅拌一边缓慢滴加lOmol/L的HC1，使纳他霉素精提取液的pH值逐步降低到6. 61， 在PH值不再回升的情况下，再搅拌4小时。之后抽滤结晶液，得到片状纳他霉素晶体，用 50%乙醇-水溶液洗涤晶体3次后，于50°C、-0. 09MPa条件下真空干燥至恒重，即得到白色微带淡黄色的片状纳他霉素晶体7. llg，纯度92. 1%。将晶体涂在载波片上，用Olympus VANOX-S型显微镜在100倍下显微照相得晶体形貌如图1所示，晶习为片状，较厚，大小均一，没有包裹杂质。实施例2取纳他霉素的干燥菌丝体90g,其中纳他霉素含量为12. 1% (w/V),加入IL甲醇与水的混合液(甲醇与水的体积比为60 40)，搅拌使菌丝体充分悬浮。用lOmol/L的NaOH 调节PH值至10后搅拌1. 5小时。抽滤分离菌渣，收集滤液，得到黄棕色的纳他霉素提取液。浓缩纳他霉素的提取液至纳他霉素的含量为18mg/ml，并絮凝去除在此过程中析出的不溶物，得到纳他霉素的精提取液。随后一边搅拌一边缓慢滴加lOmol/L的HC1，使纳他霉素精提取液的PH值逐步降低至8，在pH值不再回升的情况下，再搅拌1. 5小时。接着继续一边搅拌一边缓慢滴加lOmol/L的HC1，使纳他霉素精提取液的pH值逐步降低到6，在pH 值不再回升的情况下，再搅拌3小时。之后抽滤结晶液，得到片状纳他霉素晶体，用50%乙醇-水溶液洗涤晶体3次后，于50°C、-0. 09MPa条件下真空干燥至恒重，即得到白色微带淡黄色的片状纳他霉素晶体^g，纯度M』％。显微镜观察下的片状晶体形状同实施例1。实施例3取纳他霉素的干燥菌丝体110g，其中纳他霉素含量为10.3% (w/V),加入IL甲醇与水的混合液(甲醇与水的体积比为90 10)，搅拌使菌丝体充分悬浮。用lOmol/L的NaOH 调节PH值至12后搅拌1小时。抽滤分离菌渣，收集滤液，得到黄棕色的纳他霉素提取液。 浓缩纳他霉素的提取液至纳他霉素的含量为^mg/ml，并絮凝去除在此过程中析出的不溶物，得到纳他霉素的精提取液。随后一边搅拌一边缓慢滴加lOmol/L的HC1，使纳他霉素精提取液的PH值逐步降低至9，在pH值不再回升的情况下，再搅拌2小时。接着继续一边搅拌一边缓慢滴加lOmol/L的HC1，使纳他霉素精提取液的pH值逐步降低到7，在pH值不再回升的情况下，再搅拌5小时。之后抽滤结晶液，得到片状纳他霉素晶体，用50%乙醇-水溶液洗涤晶体3次后，于50°C、-0. 09MPa条件下真空干燥至恒重，即得到白色微带淡黄色的片状纳他霉素晶体7. 27g，纯度90. 3%0显微镜观察下的片状晶体形状同实施例1。实施例4 (对照组)如同实施例1的方法，仅将分阶段酸化的步骤改为在纳他霉素精提取液中直接滴加lOmol/L的HCl调节pH值至6. 5。之后抽滤、洗涤晶体后真空干燥至恒重，得到聚结并包有杂质的纳他霉素片状晶体7. 51g，纯度85.5%。按实施例1中显微镜照相的方法得到晶体形貌如图2所示，晶体大小不均一,聚结并包裹杂质，形貌较实施例1差。通过实施例1-3与实施例4的对比说明纳他霉素的结晶过程中，采用分阶段酸化纳他霉素精提取液的养晶工艺可以改善片状晶体的颗粒分布，提高纳他霉素晶体的纯度。对比实验组如实施例1方法，仅改变甲醇与水的混合溶液中甲醇与水的比例，分组提取菌丝体中的纳他霉素，制得的纳他霉素晶体的结晶液的过滤时间(液固分离)与干燥时间如表 1所示表1不同比例混合溶液过滤时间与干燥时间对比
权利要求
1.一种纳他霉素片状晶体的制备方法，其特征在于它包括以下步骤a、取纳他霉素菌丝体加入甲醇与水的混合液中；所述的甲醇与水的混合液中，甲醇与水的体积比为60-90 40-10 ；每IL甲醇与水的混合液添加90_110g纳他霉素菌丝体；b、用碱性物质均勻搅拌调节步骤a获得的溶液的pH值至10-12；c、将步骤b获得的溶液进行液固分离，收集滤液得到纳他霉素的提取液；d、浓缩步骤c获得的纳他霉素的提取液至纳他霉素含量在18 ^mg/ml之间，并絮凝去除在此过程中析出的不溶物，得到纳他霉素精提取液；e、分两阶段酸化步骤d获得的纳他霉素精提取液第一阶段一边搅拌纳他霉素精提取液一边缓慢滴加酸，使纳他霉素精提取液的PH值逐步降低到8-9，在pH值不再回升的情况下，再搅拌1小时以上；第二阶段继续一边搅拌纳他霉素精提取液一边缓慢滴加酸，使纳他霉素精提取液的PH 值逐步降低到6-7，在pH值不再回升的情况下，再搅拌3小时以上，得到片状的纳他霉素晶体的结晶液；f、将步骤e获得的纳他霉素晶体的结晶液进行液固分离，然后真空干燥得到片状纳他霉素晶体。
2.根据权利要求1所述的纳他霉素片状晶体的制备方法，其特征在于步骤a所述的纳他霉素菌丝体为水分含量< 5%的干燥菌丝体。
3.根据权利要求1所述的纳他霉素片状晶体的制备方法，其特征在于步骤a所述的甲醇与水的体积比为73 27，每IL甲醇与水的混合液添加IOOg纳他霉素菌丝体。
4.根据权利要求1所述的纳他霉素片状晶体的制备方法，其特征在于步骤e中，第一阶段，在PH值不再回升的情况下，再搅拌1小时；第二阶段，在pH值不再回升的情况下，再搅拌3-5小时。
全文摘要
本发明涉及一种纳他霉素片状晶体的制备方法，它包括以下步骤①取纳他霉素菌丝体加入体积比为60-90∶40-10的甲醇与水的混合液中；②用碱性物质调节pH值至10-12；③液固分离，收集滤液得纳他霉素提取液；④浓缩提取液至纳他霉素含量在18～26mg/ml之间，絮凝去除不溶物，得纳他霉素精提取液；⑤分两阶段酸化纳他霉素精提取液先缓慢滴加酸，使pH值降到8-9后再搅拌1小时以上；接着继续缓慢滴加酸，使pH值降到6-7后再搅拌3小时以上，得片状的纳他霉素晶体的结晶液；⑥液固分离，真空干燥得片状纳他霉素晶体。本发明可制得均一的纳他霉素片状晶体，降低后续晶体洗涤与干燥的难度，缩短晶体的过滤和干燥时间。
文档编号C07H17/08GK102286044SQ20111024248
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月22日 优先权日2011年8月22日
发明者姜献民, 李俊辉, 赖潭平 申请人:浦城绿康生化有限公司