专利名称：结合血小板生成素受体的肽和化合物的利记博彩app
结合血小板生成素受体的肽和化合物本申请是以下申请的分案申请申请日2004年8月13日；申请号 200480031452. 0 (PCT/US2004/026422)；发明名称同上。相关申请的相互参照本申请要求2003年8月观号提交的申请60/498，740的优先权。 发明领域本发明提供了结合并激活血小板生成素受体(c-mpl或TP0-R)或用作TPO激动剂的肽和化合物。本发明可应用于生物化学和医疗化学领域，具体地说提供TPO激动剂用于治疗人类疾病。
背景技术：
巨核细胞是骨髓来源的细胞，负责生产循环血的血小板。尽管在大多数物种中它们占少于0.25%的骨髓细胞，其容积是典型骨髓细胞的10倍以上。参见Kuter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :11104-11108 (1994)。巨核细胞进行称为核内有丝分裂的过程，在该过程中它们复制它们的核但是没有进行细胞分裂，因此产生了多倍体细胞。为响应血小板计数的下降，核内有丝分裂速率增加，形成更高多倍体的巨核细胞，巨核细胞数可以增至 3倍。参见Harker, J. Clin. Invest. ,47 :458-465(1968)。相反的，为响应血小板计数的提高，核内有丝分裂速率下降，形成较低多倍体的巨核细胞，巨核细胞数可减少50%。循环血小板的数量调控核内有丝分裂速率和骨髓巨核细胞数量的确切生理学反馈机制还不清楚。现在认为涉及调节该反馈回路的循环血小板生成因子是血小板生成素 (TPO)。更具体的是，已经显示TPO是涉及血小板减少的情况中的主要体液调控因子。参见，例如，Metcalf，Nature，369 :519-520(1994)。几项研究显示，TPO增加血小板计数，增加血小板大小，促进同位素掺入接受动物的血小板。具体地说，TPO被认为通过某些途径影响巨核细胞生成(1)它增加巨核细胞的尺寸和数量；(2)它以多倍体形式增加巨核细胞中的 DNA含量；(3)它增加巨核细胞的核内有丝分裂；(4)它促进巨核细胞的成熟；(5)它增加骨髓中小乙酰胆碱酯酶阳性细胞形式的前体细胞的百分比。因为血小板是凝血必需的，当它们的数量非常低时，患者有死于灾难性出血的严重风险，TPO在诊断和治疗各种血液疾病(例如主要由于血小板缺陷的疾病)中具有潜在的有价值应用。正在进行的TPO临床试验已表明可安全地给予患者ΤΡ0。另外，近来的研究也为治疗血小板减少中TPO疗法的有效性预测(projection)提供了基础，尤其是在治疗癌症或淋巴瘤中由化疗、放疗或骨髓移植导致的血小板减少。参见例如McDonald，Am. J. Ped. Hematology/Oncology, 14 :8-21 (1992)。已克隆并鉴定编码TPO的基因，参见Kuter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,91 11104-11108(1994) ；Barley 等，Cell 77:1117-1124(1994) ；Kaushansky 等，Nature 369 568-571(1994) ；Wendling 等，Nature，369 :571-574(1994)；和 Sauvage 等，Nature 369 533-538(1994)。血小板生成素是至少具有两种形式的糖蛋白，表观分子量为和 31kDa，N末端氨基酸序列相同。参见Bartley等，Cel 1，77 1117-1124 (1994)。血小板生成素显示出具有两个明显不同的区域，被潜在的Arg-Arg切割位点分开。氨基端区域在人和小鼠中高度保守，并和促红细胞生成素、干扰素_a和干扰素_b有某些同源性。羧基末端区域显示出很大的种族差异。已描述了人TP0-R(也称为c-mpl)的DNA序列和其编码的肽序列。参见Vigon等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :5640-5644 (1992)。TPO-R 是血细胞生成素生长因子受体家族的成员，该家族特征为胞外结构域的共有结构方案，包括N末端部分中4个保守的C残基和临近跨膜区的 WSXWS 基序(SEQ ID NO :1)。参见 Bazan，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 6934-6938(1990)。该受体在血细胞生成中起着功能性作用的证据包括，观察到它的表达在小鼠中限于脾、骨髓或胚胎肝脏(参见Souyri等，Cell 63 1137-1147 (1990))，在人中限于巨核细胞、血小板和CD34+细胞(参见Methia等，Blood 82 1395-1401 (1993)) 而且， 使CD34+细胞暴露于合成的mpl RNA反义寡核苷酸显著抑制巨核细胞集落的出现，而不影响红细胞系或髓细胞系集落的形成。某些研究者推测该受体作为同型二聚体发挥功能，类似于G-CSF和促红细胞生成素的受体的情况。可获得TPO-R克隆基因促进了寻找该重要受体的激动剂。可获得重组受体蛋白使受体-配体相互作用的研究可在各种随机和半随机肽多样性产生系统中进行。这些系统包括美国专利5，270，170和5，338，665中描述的“质粒上的肽”系统；1991年6月20日提交的美国专利申请07/718，577、1990年6月20日提交的美国专利申请07/541，108和Cwirla 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 :6378-6382(1990)中描述的“噬菌体上的肽”；1994 年 9 月2日提交的美国专利申请08/300，262和PCT WO 95/11992中描述的“核糖体”系统，前一申请为基于1993年10月四日提交的美国专利申请08/144，775的部分继续申请；1993年 11月12日提交的美国专利申请08/146，886、1992年9月16日提交的07/946，239和1991 年9月18日提交的07/762，522中描述的“编码合成文库”系统；以及美国专利5，143，854、 1990年12月13日公开的PCT专利申请90/15070、1990年12月6日公开的美国专利申请 07/624，120、Fodor 等，Science，251 :767-773 0/1991)、Dower 等，Ann. Rep. Med. Chem. ,26 271-180(1991)和1991年12月6日提交的美国专利申请07/805，727中描述的“极大规模固定化聚合物合成”系统；上述每个专利申请和出版物通过引用结合到本文中。患血小板减少的患者中血小板水平恢复缓慢是严重的问题，迫切需要找到能加速血小板再生的血液生长因子激动剂。本发明提供这种激动剂。发明概述本发明部分涉及新的意外发现，即定义的低分子量肽和肽模拟物具有强的TPO-R 结合特性，并可激活TP0-R。因此，该肽和肽模拟物可在治疗由TPO介导的疾病(例如由化疗、放疗或骨髓输入导致的血小板减少)中用于治疗目的，在研究造血机制中用于诊断目的以及用于体外扩增巨核细胞和定向祖细胞。适合于治疗或诊断目的的肽和肽模拟物的IC5tl是约2mM或更低，IC5tl由以下实施例3中说明的结合亲合力试验来测定，其中较低的IC5tl对应于和TPO-R的结合亲合力较强。 对于药用目的，肽和肽模拟物的IC5tl优选不超过约100 μ Μ,更优选不超过500ηΜ。在优选的实施方案中，肽或肽模拟物的分子量是约250至约8，000道尔顿。如果本发明的肽寡聚化、 二聚化和/或用本文描述的亲水性聚合物衍生化，这种肽的分子量会显著增大，可在约500 至约120，000道尔顿的范围内的任何地方，更优选约8，000到约80，000道尔顿。
在用于诊断目的时，本发明的肽和肽模拟物优选用可检测标记标记，因此，没有这种标记的肽和肽模拟物作为制备标记肽和肽模拟物的中间体。符合分子量和TPO-R结合亲合力的既定标准的肽包含9个或更多的氨基酸，其中氨基酸是天然的或是合成的(非天然的)氨基酸。因此，优选的肽和肽模拟物包括的化合物及其生理可接受的盐具有(1)小于约5000道尔顿的分子量，(2)用IC5tl表示的TPO结合亲合性不超过约100 μ Μ, 其中肽的0个至所有一C (0) NH-键已被选自以下的键置换-CH20C (0) NR-键、膦酸酯键、-CH2S (0) 2NR—键、-CH2NR-键、一C (0) NR6-键和一NHC (0) NH-键，其中 R 是氢或低级烷基，R6是低级烷基，另外其中所述肽或肽模拟物的N端选自-NRR1基团、-NRC (0) R基团、-NRC (0) OR 基团、-NRS (0) 2R基团、-NHC (0) NHR基团、琥珀酰亚胺基团、苄氧基羰基-NH—基团和在苯环上含有1-3个取代基的苄氧基羰基-NH-基团，所述取代基选自低级烷基、低级烷氧基、 氯和溴，其中R和R1独立选自氢和低级烷基，再另外其中所述肽或肽模拟物的C端具有式一C(O)R2,其中R2选自羟基、低级烷氧基和-NR3R4,其中R3和R4独立选自氢和低级烷基，其中-NR3R4的氮原子可任选为肽N端的胺基，使得形成环肽。在相关的实施方案中，本发明涉及标记的肽或肽模拟物，它们包括共价结合了可检测标记的上述肽或肽模拟物。在一个实施方案中，核心肽化合物包含氨基酸序列(SEQ ID NO 2)X9X8GX1X2X3X4X5X6X7其中X9 为 A、C、E、G、I、L、M、P、R、Q、S、T 或 V ;X8 为 A、C、D、E、K、L、Q、R、S、T 或 V ； \为β-(2-萘基)丙氨酸残基(本文称为“2-Nal”)。更优选X9S A或I A8为D、E或K。 另外 & 为 C、L、M、P、Q、V ；X2 为 F、K、L、N、Q、R、S、T 或 V ；X3 为 C、F、I、L、M、R、S、V 或 W ；X4 为任何20种遗传编码的L-氨基酸；X5为A、D、E、G、K、M、Q、R、S、Τ、V或Y ；X7为C、G、I、K、 L、M、N、R 或 V。特别优选的肽包含氨基酸序列(SEQ ID NO 3) 1 E G P T L R Q(2-Nal)L AAR A0在另一个实施方案中，本发明的肽化合物优选二聚化或寡聚化，以增加化合物的亲合力和/或活力。优选的二聚化肽化合物的实例包括但不限于
权利要求
1.一种结合血小板生成素受体的化合物，所述化合物具有(1)小于8000道尔顿的分子量，(2)用IC5tl表示的对血小板生成素受体的结合亲合性不超过100μ M，其中所述化合物由以下氨基酸序列组成X9X8GX1X2X3X4X5X6X7其中 X9 为 Α、C、E、G、I、L、Μ、P、R、Q、S、T 或 V ；X8 为 Α、C、D、Ε、K、L、Q、R、S、T 或 V ；X1 为 C、L、Μ、P、Q、V ；X2 为 F、K、L、N、Q、R、S、T 或 V ；X3 为 C、F、I、L、M、R、S、V 或 W ；X4 为任何 20 种遗传编码的 L-氨基酸；X5 为 A、D、E、G、K、M、Q、R、S、Τ、V 或 Y ；X7 为 C、G、I、K、L、Μ、N、 R或VA6为β-(2-萘基)丙氨酸。
2.权利要求1的化合物，其中所述氨基酸序列为二聚化的。
3.一种化合物在制备激活细胞中血小板生成素受体的药物中的用途，所述化合物的分子量小于8000道尔顿，所述化合物由以下的氨基酸序列组成X9X8GX1X2X3X4X5X6X7其中 X9 为 Α、C、E、G、I、L、Μ、P、R、Q、S、T 或 V ；X8 为 Α、C、D、Ε、K、L、Q、R、S、T 或 V ；X1 为 C、L、Μ、P、Q、V ；X2 为 F、K、L、N、Q、R、S、T 或 V ；X3 为 C、F、I、L、M、R、S、V 或 W ；X4 为任何 20 种遗传编码的 L-氨基酸；X5 为 A、D、E、G、K、M、Q、R、S、Τ、V 或 Y ；X7 为 C、G、I、K、L、Μ、N、 R或VA6为β-(2-萘基)丙氨酸。
4.权利要求3的用途，其中所述氨基酸序列为二聚化的。
全文摘要
公开了结合并激活血小板生成素受体(c-mpl或TPO-R)或用作TPO激动剂的肽和化合物。
文档编号C07KGK102241742SQ20111013419
公开日2011年11月16日 申请日期2004年8月13日 优先权日2003年8月28日
发明者B·R·麦唐纳德, E·J·尤尔科, J·K·维斯 申请人:奥索-麦克尼尔药品公司