专利名称：一种从山核桃外果皮中提取核桃酮及制备核桃酮标准品的方法
一种从山核桃外果皮中提取核桃酮及制备核桃酮标准品的
方法
背景技术：
本发明属于天然产物分离纯化领域，具体涉及一种从山核桃外果皮中提取核桃酮及制备核桃酮标准品的方法。
背景技术：
山核桃(Carya cathayensis Sarg.)为山核桃属植物，共有17个种2个变种。我国山核桃主产于浙、皖交界的天目山区，分布于浙江省临安的昌化、于潜，淳安的临岐、唐村，安吉的孝丰，桐庐的分水；安徽省的宁国，歙县，旌德，绩溪等县。此外，20世纪90年代， 在安徽省大别山区的金寨县发现连片数千亩的野生山核桃。长期以来，我国的山核桃综合开发力度不够，技术落后，资源利用率较低，基本以山核桃仁产品为主。其实，山核桃全身是宝，木材、树皮、枝叶、雄花序、种蒲(外果皮)、核壳等含丰富生物活性物质，有着非常广阔的开发利用前景。现代研究结果表明，胡桃科植物含丰富生物活性物质，有抗肿瘤、抑菌、化感、杀虫、消炎、抗辐射、抗脂质过氧化、降血糖的作用，另外，其色素也具很好的稳定性。长期以来，山核桃外果皮一直作为废弃物被堆放在路边、溪旁，不仅资源浪费，而且严重污染环境。就环境被污染情况一直对山核桃生产产区造成负面影响。外果皮被雨水或河水浸出的汁液，对鱼虾有毒杀作用，同时，碱化了土壤，对周围环境及生态产生严重破坏。近年来研究发现核桃酮(Regiolone)对癌细胞HL-60，Hela, HepG2体外毒性作用明显，又能抑制脂多糖(LPS)和γ -干扰(IFN- γ )诱导的RAW264. 7大鼠巨噬细胞NO的生成，是一种极有开发价值的具有抗癌活性的天然产物。专利CN 101328114A公开了一种从核桃青皮中提取核桃酮的方法，该方法取原料干粉5kg，通过水或95 %乙醇提取，经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂萃取，以石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮为洗脱剂，进行普通硅胶柱层析分离，再以石油醚_乙酸乙酯或石油醚_丙酮进行结晶和重结晶得到200mg核桃酮粗品。可以看出，该方法得率相当于 40 μ g粗品/g干粉，纯度欠缺、产率较低，结晶和重结晶操作时间长，受温度湿度影响较大， 而核桃酮有一定吸湿性，所以，实际应用时，该法不可取。再者，核桃皮与山核桃外果皮在原料、组成上存在差异。
发明内容
本发明提供一种从山核桃外果皮中提取核桃酮及制备核桃酮标准品的方法。本发明方法工艺简单，方法可靠，核桃酮的收率高，稳定性好，纯度高，可以达到98%以上。为实现上述目的本发明采用的技术方案如下一种从山核桃外果皮中提取核桃酮的方法，其特征在于，具体包括以下步骤(1)山核桃采收后，剥离山核桃外果皮，并将其阴干，45-55°C真空干燥，粉碎，过 55-65目筛，备用；(2)原料粉中加10-20%氨水，拌勻至湿润；
(3)将相当于原料粉重量8-12倍的95%乙醇加入到湿润状原料粉中，50°C -80°C 热回流提取2-4次，每次1-1. 5h，提取液离心分离，合并上清液，减压浓缩至浸膏状；(4)浸膏用1-3%盐酸溶解，调节酸水液的pH = 2-4 ；酸水液用等体积氯仿萃取， 取氯仿层，用2-4% NaOH溶液静置提取，取上层碱液，用10-20%盐酸调pH = 7_9，静置，下层氯仿层即核桃酮样品液。利用权利要求1提取的核桃酮制备核桃酮标准品的方法，其特征在于具体步骤如下(1)制备型薄层层析将权利要求1所述的核桃酮样品液浓缩后，制备薄层层析，刮下核桃酮所在部位的硅胶，然后索氏抽提，真空干燥得核桃酮粗品，制备薄层层析所用的展开剂氯仿、甲醇、氨水的混合液，其各组分的体积比为氯仿甲醇氨水= (62-68) (0.8-1.2) 1，索氏抽提温度 80°C _100°C ；(2) C18反相柱层析将C18硅胶用甲醇充分浸泡脱气后，重力沉降法装柱，用甲醇充分洗出杂质后，再用20-40%乙腈水溶液平衡，将步骤(1)所述的核桃酮粗品溶解于甲醇后上柱，并用20-40%乙腈洗脱，层析过程在常温常压下进行，其中，核桃酮粗品与甲醇的质量体积(g/ml)比为 1 (20-40)；(3)洗脱液精制处理分段收集核桃酮粗品洗脱液，将HPLC检测纯度大于95%的流份合并，氮吹去净溶剂，即得核桃酮标准品。所述的制备核桃酮标准品的方法，其特征在于所述步骤(3)中HPLC检测纯度的流动相为乙腈水溶液，其中乙腈与水的体积比=15 85，检测波长258-261nm，柱温 24-26 "C。所述的制备核桃酮标准品的方法，其特征在于步骤(1)制备薄层层析所用的硅胶板为制备型GF254硅胶板。与现有技术相比，本发明的优点在于(1)利用山核桃外果皮为原料提取核桃酮，资源丰富，可以起到废物利用的效果；(2)提取分离工艺简单，萃取溶剂为氯仿，易于回收；方法可靠，利用制备薄层层析和C18反相柱层析，采用适宜展开剂和洗脱剂，最大限度选择性的将核桃酮析出。(3)核桃酮的收率高，稳定性好，得率为350μ g/g。(4)核桃酮的纯度高，纯度可以达到98%以上。终产品稳定性好。本发明以山核桃外果皮为原料，为综合利用山核桃资源提供理论和实际应用依据，本发明在工业化实施后，将对促进山核桃产业发展、对山核桃资源深度开发等方面具有积极意义。
具体实施例方式现以实验室实施为例，非限定实施例叙述如下将阴干的山核桃外果皮，50°C真空干燥，粉碎，过60目筛(孔径0.25mm)。取600g 原料粉中加入浓度为10-20%的氨水，拌勻至湿润，再加入6kg95%的乙醇，50°C _80°C下热回流提取4次，每次1. 5h，提取液离心(3500r/min，15min)，合并上清液，减压浓缩至浸膏状。浸膏用300mL 1-3%盐酸溶解，得酸水液(调pH = 2-4)；酸水液用300mL氯仿萃取，取下层氯仿层，用300mL 2-4% NaOH提取静置，取上层碱水液，用10-20%盐酸调pH = 7-9,静置，下层氯仿层即样品液。样品液浓缩至2mL，采用制备型GF254硅胶板，微量移液器移取2μ L样品液点于薄板近底端处，电吹风吹干。将点好样的薄板放在密闭展缸中，上行展开，电吹风吹干。以氯仿甲醇氨水的体积比为65 1 1的混合液为展开剂展开，用碘蒸气显色，刮下核桃酮所在部位的硅胶，80°C-100°C索氏抽提，真空干燥为红色核桃酮粗品。将Cw硅胶用甲醇(色谱级)充分浸泡脱气后，重力沉降法装成500X25mm的柱。用甲醇充分洗出杂质后，再用20%乙腈水溶液平衡。将经制备薄层层析初步纯化的粗品，溶解于aiil甲醇后上柱，并用20-40%乙腈洗脱，层析过程在常温常压下进行。收集核桃酮粗品洗脱液，20ml/份，收集30份，待HPLC测定各段流份纯度。分段收集核桃酮粗品洗脱液，将 HPLC检测(流动相条件为乙腈水=15 85(V V)为流动相；检测波长260nm ；柱温 250C )，纯度大于95%的19 25号流份合并，氮吹去净溶剂，即得核桃酮标准品，测得纯度为 98. 1%，产率为 350μ g/g。
权利要求
1.一种从山核桃外果皮中提取核桃酮的方法，其特征在于，具体包括以下步骤(1)山核桃采收后，剥离山核桃外果皮，并将其阴干，45-55°C真空干燥，粉碎，过55-65 目筛，备用；(2)原料粉中加10-20%氨水，拌勻至湿润；(3)将相当于原料粉重量8-12倍的95%乙醇加入到湿润状原料粉中，50°C-80°C热回流提取2-4次，每次1-1. 5h，提取液离心分离，合并上清液，减压浓缩至浸膏状；(4)浸膏用1-3%盐酸溶解，调节酸水液的pH= 2-4 ；酸水液用等体积氯仿萃取，取氯仿层，用2-4% NaOH溶液静置提取，取上层碱液，用10-20%盐酸调pH = 7_9，静置，下层氯仿层即核桃酮样品液。
2.利用权利要求1提取的核桃酮制备核桃酮标准品的方法，其特征在于该纯化方法包括制备薄层层析、C18反相柱层析、洗脱液处理等步骤(1)制备型薄层层析将权利要求1所述的核桃酮样品液浓缩后，制备薄层层析， 刮下核桃酮所在部位的硅胶，然后索氏抽提，真空干燥得核桃酮粗品，制备薄层层析所用的展开剂氯仿、甲醇、氨水的混合液，其各组分的体积比为氯仿甲醇氨水= (62-68) (0.8-1.2) 1，索氏抽提温度 80°C _100°C ；(2)C18反相柱层析将C18硅胶用甲醇充分浸泡脱气后，重力沉降法装柱，用甲醇充分洗出杂质后，再用20-40%乙腈水溶液平衡，将步骤(1)所述的核桃酮粗品溶解于甲醇后上柱，并用20-40%乙腈洗脱，层析过程在常温常压下进行；(3)洗脱液处理精制分段收集核桃酮粗品洗脱液，将HPLC检测纯度大于95%的流份合并，氮吹去净溶剂，即得核桃酮标准品。
3.根据权利要求2所述的制备核桃酮标准品的方法，其特征在于所述步骤(3) 中HPLC检测纯度的流动相为乙腈水溶液，其中乙腈与水的体积比=15 85，检测波长 258-26 lnm，柱温 24-26 °C。
4.根据权利要求2所述的制备核桃酮标准品的方法，其特征在于步骤(1)制备薄层层析所用的硅胶板为制备型GF254硅胶板。
全文摘要
本发明提供了一种从山核桃外果皮中提取核桃酮及制备核桃酮标准品的方法。首先将山核桃外果皮粉碎，用氨水湿润，再加入95％乙醇溶液，热回流提取，提取物再用氯仿萃取，得核桃酮样品液，再对样品液浓缩后，采用制备薄层层析纯化得到核桃酮粗品，用C18反相柱层析进一步纯化粗品，分段收集核桃酮粗品洗脱液，将HPLC检测纯度大于95％的流份合并，氮吹去净溶剂，即得核桃酮标准品。本发明方法，提取工艺简单，核桃酮的收率高，纯度高，以山核桃外果皮为原料，为综合利用山核桃资源提供理论和实际应用依据，具有变废为宝的效果。
文档编号C07C45/78GK102219664SQ20111010475
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月26日 优先权日2011年4月26日
发明者丁之恩, 屈晓清, 王敏丽, 王晓燕 申请人:安徽农业大学