专利名称：离子交换法制备高纯度的酪蛋白糖巨肽的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及酪蛋白糖巨肽的分离纯化方法，尤其是ー种利用大孔强碱苯性烯系阴离子交换树脂分离纯化酪蛋白糖巨肽，且利用喷雾干燥制备成品。
背景技术：
酪蛋白巨肽(CaseinGlycomacropeptide, CGMP)是ー种由凝乳酶(或胃蛋白酶)水解酪蛋白中K -casein的Phel05_Metl06的肽键得到的具有64个氨基酸残基的短肽，具有多种生物活性，例如抑制细菌和病毒对宿主的毒害，调节胃肠道，预防肠道疾病，抗血栓 和降低血压等功能，并且具有较高的溶解性和热稳定性、以及良好的乳化性和凝胶性等等。目前关于CGMP的制备一直是人们关注的话题，很多方法被尝试用来制备和生产CGMP，但大多数方法并不能应用于エ业化生产中。Tanimoto (1991年)用高温热处理的方法使杂蛋白变性、沉淀生产糖巨肽。但该方法需要长时间高温处理，耗能量较多。Etzel (2001年)、袁永俊等利用凝胶层析法分离纯化CGMP。但凝胶层析填料价格昂贵，不适合エ业エ业化生产。Saito T等于1991年报道了一种冷こ醇沉淀的技术方法生产CGMP，但该方法需要大量的冷こ醇，能耗多。2002年美国Holst申请的专利技术中分别采用20kDa和5kDa的膜对新鲜干酪甜乳清进行截留，制备酪蛋白糖巨肽，但是膜分离技术在制备CGMP时也存在不足之处，如膜的清洗需要消耗大量的能量和水，同时对于目标溶液中杂蛋白等含量较多吋，其分离效果和膜的污染等问题更加突出。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种适合エ业化分离纯化酪蛋白糖巨肽的方法，本方法提供的离子交换树脂能够较好的分离纯化酪蛋白糖巨肽，且成本低，分离效果好。能够应用于酪蛋白糖巨肽的エ业化生产中。本发明实现目的的技术方案如下I、本发明中由大孔强碱苯性烯系阴离子交换树脂来分离纯化酪蛋白被糖巨肽，离子交換树脂价格便宜，降低エ业化生产成本。2、本发明中分离纯化的酪蛋白糖巨肽的离子交换树脂对酪蛋白糖巨肽的吸附量高，解析附容易。对其他杂蛋白等的吸附量少。通过215nm和280nm吸光度计算酪蛋白糖巨肽的纯度，用该种离子交换树脂分离的酪蛋白糖巨肽的纯度在90%以上，酪蛋白糖巨肽的回收率在80%以上。较高的酪蛋白糖巨肽纯度和回收率充分证明了本发明分离纯化酪蛋白糖巨肽的方法具有较好的纯化效果。离子交換树脂较低的价格，节约生产成本，给酪蛋白糖巨肽的エ业化生产带来好处。
下面结合附图和实施方式对本专利进ー步说明。图I为本发明分离纯化中酪蛋白糖巨肽洗脱结果曲线图2为本发明分离纯化洗脱结果中酪蛋白糖巨肽特征组分唾液酸验证图；图3为本发明分离纯化酪蛋白糖巨肽电泳纯度鉴定结果图；其中图2，从左到右分别为第27mL 90mL洗脱液的浓缩液；第93mL 138mL洗脱液的浓缩液；第141mL 207mL洗脱液的浓缩液 ’第2IOmL 267mL洗脱液合并浓缩液；第270mL 327mL洗脱液合并浓缩液。阴性空白対照。其中图3为收集液电泳检测结果图，从左到右依次为，maker,第143mL, 149mL,155mL, 161mL, 167mL, 173mL, 179mL, 185mL, 191mL, CGMP 标品
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明进ー步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。实例I酪蛋白糖巨肽的分离纯化方法，步骤如下(I)配置干酪素水溶液，调整其pH为酶解的pH，酶解得到酶解液，沉淀杂蛋白离心得到上清液，经中空纤维等浓缩；(2)向步骤(I)中得到的浓缩液通过离子交换树脂D280进行吸附，对吸附酪蛋白糖巨肽的离子交換树脂以不同浓度的NaCl溶液进行洗脱，各浓度NaCl溶液的洗脱体积为1BV。(3)收集目标洗脱液，经中空纤维浓缩除盐后，经喷雾干燥得到酪蛋白糖巨肽产品，保存。实例2酪蛋白糖巨肽的制备方法，步骤如下(I)配置干酪素水溶液，调整其pH为酶解的pH，酶解得到酶解液，沉淀杂蛋白离心得到上清液，经中空纤维等浓缩；(2)向步骤(I)中得到的浓缩液通过离子交换树脂D296进行吸附，对吸附酪蛋白糖巨肽的离子交換树脂以不同浓度的NaCl溶液进行洗脱，各浓度NaCl溶液的洗脱体积为1BV。(3)收集目标洗脱液，经中空纤维浓缩除盐后，经喷雾干燥得到酪蛋白糖巨肽产品，保存。说明1、发明中应用到的干酪素的来源(甘肃干酪素总厂购买)2、分离用离子交换树脂不是特制产品，可以从任何离子交换树脂生产公司购买3、喷雾干燥机，中空纤维等可以从任何公司购买。为验证本发明中絮凝剂在酪蛋白糖巨肽分离纯化中的效果，特进行如下验证试验:验证试验I :离子交换树脂分离纯化酪蛋白糖巨肽的洗脱效果鉴定试验參见张惟杰，糖复合物生化研究技木，pp. 455-456中所述的间苯ニ酚-盐酸法进行酪蛋白糖巨肽的特性组分-唾液酸鉴定，以唾液酸含量的变化来表征酪蛋白糖巨肽的变化。具体试验如下2%间苯ニ酚溶液，O. lmol/1硫酸铜的水溶液O. 25ml，浓盐酸80mL，カロ水至IOOml混均置室温，4h后储于4°C，此工作液呈黄色或緑色；对洗脱的收集液根据图I的洗脱曲线，分成5组，对每一组的收集液进行超滤除盐。分别除盐后溶液2ml，加间苯ニ酚试剂工作液2ml ;试管加盖于100°C沸水浴15min，快速冷却；加醋酸正丁醇酯-正丁醇(85 14)細1，振荡提取后在37で下水浴151^11，取上层有机相，测定其在58011111波长下的吸光度；以水为阴性对照，结果见图1，图2。图2经间苯ニ酚-盐酸法检测,只有收集的第141mL 207mL洗脱液的浓缩液上层有机相显为蓝紫色，此为唾液酸特征颜色，说明离子交換后洗脱液中含有CGMP。验证试验2 :离子交換分离纯化后目标洗脱峰中的酪蛋白糖巨肽纯度鉴定取10 μ L目标溶液，通过分离胶浓度为15%的SDS-PAGE电泳，检测目标峰中酪蛋白糖巨肽的纯度，结果见图3。參见郭尧君.蛋白质电泳实验技术(1999版)ρρ92-118·中SDS-PAGE电泳检测蛋白质的纯度方法，检测目标峰中酪蛋白糖巨肽纯度。结果见图3。 试验结果表明本发明中提供的离子交换树脂及分离纯化方法在酪蛋白糖巨肽的分离纯化中能起到较好的分离纯化效果。
权利要求
1.一种酪蛋白糖巨肽分离纯化方法，其特征在于在分离纯化CGMP中，利用离子交换树脂等分离纯化酪蛋白糖巨肽。
2.根据权利要求I所述的离子交换树脂，其特征在于离子交换树脂为大孔强碱苯性烯系阴离子交换树脂。
3.根据权利要求I所述的分离纯化方法，其特征包括利用盐溶液，改变PH等对酪蛋白糖巨肽进行解析附洗脱。
4.根据权利要求3所述的分离纯化方法，其特征包括利用不同浓度盐溶液的梯度洗脱，线性洗脱等。利用梯度改变PH或线性改变pH等的洗脱。
5.一种去权利要求I所述的酪蛋白糖巨肽的分离纯化方法，其特征在于分离纯化步骤如下 含CGMP的目标溶液，调整pH为5 9，利用相同pH的缓冲液平衡离子交换树脂，上样，上样体积为1/20 1/4柱床体积(BV)，上样流速为0. 2 4BV/h。洗脱采用线性洗脱或梯度洗脱。收集含目标成分的洗脱液，过中空纤维除盐，喷雾干燥制备产品。
6.根据权利要求5所述的酪蛋白糖巨肽的分离纯化方法，其特征在于应用喷雾干燥制备酪蛋白糖巨肽，喷干条件为进风温度100 250°C，鼓风为40 80m3/h，进料蠕动泵流速为25 125rpm。
全文摘要
本发明涉及一种分离纯化酪蛋白糖巨肽的方法，由离子交换树脂对酪蛋白糖巨肽进一步提纯，精制的方法。本发明提供的用于酪蛋白糖巨肽分离的离子交换树脂价格便宜，对酪蛋白糖巨肽的吸附量高，且易于解吸附。运用该离子交换树脂进行分离时，洗脱步骤少，洗脱的酪蛋白糖巨肽纯度高。树脂较低廉的价格，节约了工业化生产成本。较高的吸附量，易于解析附，洗脱酪蛋白糖巨肽纯度高使工业化能保证在获得较高纯度的情况下，提高了产品得率，给酪蛋白糖巨肽的工业化生产带来好处。
文档编号C07K14/47GK102746392SQ20111010159
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月22日 优先权日2011年4月22日
发明者王艳萍, 赵运星 申请人:天津科技大学