专利名称：一种桶形α芋螺多肽Bt1.3及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种桶形α芋螺多肽Btl. 3及其应用。
背景技术：
神经性疼痛是一种由中枢或外周神经系统原发性病变或功能障碍而引起的疼痛综合症。神经性疼痛的典型症状包括感觉异常、痛觉过敏和痛觉超敏等。目前许多重大疾病(如癌症、艾滋病、创伤性神经损伤、麻疯病、硬化症、带状疱疹)均可导致神经系统功能的损伤而引发神经性疼痛，临床上常用的药物主要有抗惊厥药(如莱提西酞、奥卡西平)、 阿片类药(如吗啡等)和各种抗抑郁药的联用，但是由于毒副作用以及长期用药带来的耐受性、成瘾性等问题，治疗效果不佳。因此，开发新一代高活性、低耐受和非成瘾的镇痛药物十分必要。最新研究表明神经元型亚型nAChRs α 9 α 10，α 7及α 3 β 2与镇痛相关，是发展无致瘾慢性镇痛药物的理想靶点。α -芋螺毒素(a -CTX)是最早从芋螺毒腺管中纯化出的一类多肽，属于A超家族， 一般由9-18个氨基酸组成，含有2对二硫键，框架结构为CCXmCXnC (C代表半胱氨酸，X代表非半胱氨酸，m和η表示非半胱氨酸的数量)，根据m和η的不同，α-CTX被划分为α 3/5、 α 4/3、α 4/6、α 4/7等亚家族。其中α 3/5，如α -MI，主要作用于脊椎动物的肌肉型乙酰胆碱受体，其他亚型则大多选择性地作用于脊椎动物的神经型乙酰胆碱受体的不同亚型(如 α 3 β 2、α 9 β 10等)。在镇痛活性研究方面，目前发现RglA、Vcl. 1、MII三种α -芋螺多肽具有较好的镇痛活性(Callaghan B et al. J Neurosci, 2008 ；28 :10943-10951 ；Young T et al. Brain Res. 2008 ；1229 :118-124.)，可以减轻由于创伤、炎症、或神经性损伤引起的疼痛。α芋螺多肽RglA、Vcl. 1的镇痛作用靶点可能是乙酰胆碱受体α 9 α 10亚型(Vincler et al.PNAS. 2006，103 06) ,17880-17884)，而MII的作用靶点是乙酰胆碱受体α3β2亚型(Young Y，et al. Brain Res.，2008，1229 :118-124)。作用于外周神经系统，可以采用多肽皮下、肌肉或腹腔等给药方式，方便应用。Vcl. 1镇痛靶点的最新研究表明，Vcl. 1是通过GABAB介导的N型钙通道的抑制而发挥镇痛作用(Klimis H et al. PAIN 2011,152 259466)，但也有可能与目前未发现的机制相关。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种桶形α芋螺多肽Btl. 3。本发明提供的多肽，其氨基酸序列为序列表中的序列2。所述多肽的编码基因也是本发明保护的范围。所述多肽的编码基因为如下⑴或(2)或(3)的DNA分子(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能多肽的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能多肽的DNA分子。 上述严格条件可为在6 X SSC, 0. 5 % SDS的溶液中，在68°C下杂交，然后用2 X SSC, 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。所述多肽的二硫键的连接方式为Cysl-Cys3和Cys2-Cys4 ；从所述多肽的氨基端开始的Cys按顺序分别记作Cysl、Cys2、Cys3、Cys4。所述的多肽在制备镇痛的产品中的应用也是本发明保护的范围。所述产品为药品。利用α芋螺毒素信号肽的保守区及3’ RACE克隆方法，从中国南海西沙群岛海域的桶形芋螺(Conus betulinus)毒腺管中克隆获得一条新的α 4/7型芋螺多肽Btl. 3基因 (图1)，NCBI序列比对分析表明该芋螺多肽具有全新的氨基酸组成，与目前报道的α型芋螺多肽在氨基酸组成上具有显著差异。利用Fmoc-固相肽合成法合成了 Btl. 3线性肽(RKCCSNPACNRYNPAIC)，然后在 NH4HCO3缓冲液中一步折叠，产物形成2个峰(第I峰和第II峰，图2Α)。一般天然α芋螺毒素的二硫键连接方式主要为“C1-C3，C2-C4”，呈球状结构，在反相HPLC分析中出峰较早。 为进一步证实Btl. 3折叠I峰的二硫键排列方式，合成了 Cl及C3位半胱氨酸带有侧链保护基 Acm (乙酰胺)的线性肽(RKC (Acm) CSNPAC (Acm)NRYNPAIC)。第一步在 pH 7. 7 的 0. IM Tris-HCl缓冲液氧化约2 后形成含一对二硫键(C2-C4)的产物(图2B_b)，纯化该产物并在碘溶液中脱去Acm得到二硫键排布为(C1-C3，C2-C4)的产物III峰(图2B_c)。然后将一步折叠获得的产物I峰(图2A)与二硫键已知的两步法产物III峰共同进样，结果表明二者保留时间一致(图2B-d)。证实Btl. 3 一步折叠I峰的二硫键排列方式为“C1-C3， C2-C4”。质谱测定其荷质比“M+1”为1907. 87，与理论计算值相符(理论值为1907.81)。然后，用大鼠坐骨神经半切模型(PSL)测定Btl. 3-1的镇痛活性，结果表明 Btl. 3-1具有很强的镇痛活性，肌肉注射很低剂量的Btl. 3(0. 3nmol/只)即可使大鼠痛阈提高约沈.7%，与同剂量Vcl. 1的镇痛活性相当。在一定剂量范围内，该肽的镇痛效果呈现剂量依赖性(图3)。此外，对Btl. 3的作用靶点进行了研究。将大鼠乙酰胆碱受体α3β2和α3β4 亚型表达在非洲爪蟾卵母细胞上，用双电极电压钳测定Btl. 3-1对亚型乙酰胆碱激发电流的抑制作用，结果表明Btl. 3可特异性地作用于α 3 β 2亚型，IOOOnM的Btl. 3-1即可抑制大鼠神经元α 3 β 2亚型乙酰胆碱激发电流约65. 3%，而对α 3 β 4亚型作用弱(图4)。本发明的实验证明，本发明合成的Btl. 3多肽，具有很强的镇痛活性，此且其可特异性地作用于α3β2亚基。
图1为Btl. 3前体肽cDNA序列和预测的翻译产物，下划线所示为信号肽序列，阴影部分为成熟肽序列。图2为合成Btl. 3的检测图，图2A为Btl. 3 —步氧化折叠产物HPLC分析；a)线性肽；b) —步折叠产物I和II ； c)纯化后的产物I。
图2B为Btl. 3两步折叠产物III及与一步折叠产物I共进样HPLC分析；a)线性肽；b)第一步折叠产物；C)第二步折叠产物III ；d)折叠产物I与III的混合样品。图3为Bt 1. 3-1给药后1. 5h痛阈值变化，柱状图表示PNL大鼠肌肉注射生理盐水、Vcl. 1及不同剂量Btl. 3，1. 5h后的平均痛阈值提高率(％)。图4为Btl. 3对不同神经型nAChR的作用效果，a) -c)分别为10nM、50nM及IOOOnM Btl. 3对大鼠α 3 β 2亚型ACh激发电流的抑制效果。d) IOOOnM Btl. 3对大鼠α 3 β 4亚型ACh激发电流的抑制效果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、α -芋螺多肽Btl. 3的合成一、α -芋螺多肽Btl. 3的基因克隆l、cDNA 的合成从中国南海西沙群岛海域采集的活体桶形芋螺(Conus betulinus)作为样本材料。采用iTrizol法提取芋螺毒腺管总RNA。使用大连TaKaRa公司3，Fu 11-RACE试剂盒 (3’ -Full RACE Core Set Ver 2. 0)进行cDNA的合成，具体方法如下先按比例添加下列组分
权利要求
1.一种多肽，其氨基酸序列为序列表中的序列2。
2.权利要求1所述多肽的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述多肽的编码基因为如下(1)或 (2)或(3)的DNA分子(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能多肽的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能多肽的DNA分子。
4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽的二硫键的连接方式为Cysl-Cys3和Cys2-Cys4 ；从所述多肽的氨基端开始的Cys按顺序分别记作Cysl、Cys2、Cys3、Cys4。
5.权利要求1所述的多肽在制备具有镇痛功能的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述产品为药品。
全文摘要
本发明公开了一种桶形α芋螺多肽Bt1.3及其应用。本发明提供了一种桶形α芋螺多肽Bt1.3，其氨基酸序列为序列表中的序列2；所述多肽的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。所述多肽的二硫键的连接方式为Cys1-Cys3和Cys2-Cys4；从所述多肽的氨基端开始的Cys按顺序分别记作Cys1、Cys2、Cys3、Cys4。本发明的实验证明，利用Fmoc-固相肽合成法合成了Bt1.3线性肽(RKCCSNPACNRYNPAIC)，然后在NH4HCO3缓冲液中一步折叠，得到Bt1.3多肽，镇痛实验表明，本发明的α型芋螺多肽在大鼠坐骨神经半切模型中表现出很强的镇痛活性。
文档编号C07K7/08GK102190708SQ201110086538
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月7日 优先权日2011年3月30日
发明者付超, 刘娜, 刘珠果, 孙婷, 戴秋云, 胡洁 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所