专利名称：一种利用聚酰胺树脂分离纯化黄连生物碱的方法
技术领域：
本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种利用聚酰胺树脂分离纯化黄连生物碱的方法。
背景技术：
黄连是我国最常用的中药之一，是一味古老的抗菌药，临床上长期以来用于解热镇痛、抗肠道细菌感染。近年来发现黄连还有抗心律失常、降血脂、降血糖、抗癌，抗血小板聚集等药理作用。黄连主要活性成分是小檗碱，巴马汀，黄连碱，表小檗碱，非洲防己碱，药根碱，Groenlandcine和木兰花碱等异喹啉类生物碱类。研究表明这些生物碱具有抗菌、抗炎、降血糖、抗癌等活性。目前分离黄连生物碱的工艺主要是针对于小檗碱，申请号为CN96105233. 3的专利公开了一种从黄连中分离盐酸小檗碱的工艺，但黄连中其他生物碱的含量也很高，活性很好，只针对小檗碱的分离造成一定的资源浪费。传统方法分离黄连生物碱单体一般是黄连粗提物先经过各种溶剂萃取，萃取所得的浸膏再用各种柱色谱法反复层析和重结晶，过程繁琐，浪费时间，且由于黄连生物碱的极性很大，死吸附严重，造成样品的严重损失，更不利于工业生产。如杨异卉等(黑龙江医药， 2009,22 :480-481.)介绍了一种从黄连中分离小檗碱、黄连碱、巴马汀的方法，即黄连提取后所得的浸膏先酸水溶解后过滤，再碱化，再经过氯仿、正丁醇萃取，正丁醇萃取后在经过硅胶柱色谱，重结晶等。在该方法中2kg的黄连得17g的正丁醇萃取物，其中15g的萃取物经分离后只得21mg小檗碱，Ilmg黄连碱，6mg巴马汀，说明该方法损失很严重。也有方法(Journal ofPaharmacy and Pharmacology, 2005, 57 :367-374.)先经萃取,再经过反复 Dia-ion, MCI和ODS等柱层析，最后重结晶得到小檗碱、黄连碱、巴马汀、表小檗碱、药根碱和Groenlandicine等6个生物碱单体，该方法同样操作繁琐，浪费时间，经济效益低。^ffi(separation and purification technology, 2011, 76 :428-431.)的方法相对传统方法，大大提高效率，但由于采用逆流分离时，每次逆流的样品载样量很少，很难扩大应用，经济效益不高，而且仪器设备昂贵，所以用逆流分离黄连生物碱对于推广工业化也有一定的局限。聚酰胺树脂是作为常用的分离材料，它具有设备简单，能重复利用，耗能低，适用范围广等特点，已广泛用于中药和食品领域，特别是对酚类，黄酮类化合物的分离，而其在分离黄连生物碱方面的使用还未见报道。
发明内容
本发明公开了一种用聚酰胺树脂从黄连中一步分离得到小檗碱、巴马汀、黄连碱、 药根碱、非洲防己碱、Groenlandcine和木兰花碱等黄连的7个主要生物碱的方法，该方法操作简单，新颖，适合工业化生产。上述的目的通过以下的技术方案实现黄连粗提物浸膏用聚酰胺拌样后上聚酰胺柱，用二氯甲烷或二氯甲烷-甲醇的混合溶剂梯度洗脱，用薄层层析检验流份，合并相同流份，干燥，即得。高效液相检测所得化合物纯度。聚酰胺柱色谱的洗脱系统常用甲醇-水，乙醇-水或乙腈-水等含水系统，在本发明中，当采用这些含水系统洗脱时，黄连各生物碱在柱子上保留时间很短，达不到分离效果，本发明采用二氯甲烷-甲醇这个非水系统作为洗脱剂时，能达到很好的分离效果。黄连粗浸膏优选下列方法制备黄连粉碎后用0-100%的甲醇或乙醇的酸溶液超声或者回流提取，提取剂中的酸优选浓度为0. 5 % -1 %的盐酸或硫酸，黄连粉末与提取剂的重量体积比优选1 2-1 8。其中聚酰胺树脂的粒径优选80-400目。柱体聚酰胺树脂的重量优选为黄连粗浸膏重量的10-35倍。采用梯度洗脱时，二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，二氯甲烷和甲醇体积比为的 1 0-20 1。本发明优选采用梯度洗脱，二氯甲烷和甲醇的体积比为1 0-20 1。用二氯甲烷洗脱同样能达到很好的分离效果，但分离时间长。薄层层析检验流份时的薄层条件检测小檗碱，巴马汀，黄连碱时展开剂为乙酸乙酯二氯甲烷甲醇二乙胺(10 10 1.5 1)；检测非洲防己碱，药根碱，木兰花碱和Groenlandcine时展开剂为二氯甲烷甲醇二乙胺QO 3 1)；紫外灯下检测， 与各化合物标准品对照。高效液相色谱检测化合物纯度的条件Welch Ultimate XB-C18柱 (250nmX4. 6nmID,5ym)；检测波长:265nm ；流速1. OmL/min ；柱温-.25V ；进样量:10μ 1。 流动相0. 05%的三氟乙酸水溶液(A)，乙腈⑶；洗脱梯度0min :20% B ;20min :20% B ； 25min 23% B ；50min 25% B。本发明的有益效果目前采用聚酰胺树脂分离黄连生物碱尚属首次研究，此外从黄连中一步分离得到小檗碱，巴马汀，黄连碱，非洲防己碱，药根碱，木兰花碱，Groenlandcine等七个生物碱更是没有报道。由于聚酰胺树脂价格经济，能多次使用，使用的洗脱剂安全，低毒，也可重复利用，提高了安全性和经济效益。并且本发明工艺操作简单，样品损失少，提高了分离效率，降低了生产成本。可以实现从实验室小量制备到扩大的工业化生产。
具体实施例方式实施例1取30g黄连，加入重量体积比为5倍量的含0. 5%盐酸的70%乙醇超声提取三次， 每次一小时，合并提取液，用旋转蒸发仪减压回收乙醇后得粗浸膏。取1. 5g的粗浸膏用甲醇溶解后再用1倍量的100-200目的聚酰胺伴样，挥干溶剂后上样。取为粗浸膏量25倍量的100-200目的聚酰胺用二氯甲烷湿法装于直径为2cm的柱子中，得到40cm高的柱层， 再用二氯甲烷-甲醇系统进行加压梯度洗脱先用二氯甲烷冲洗聚酰胺树脂25BV(柱体积)，再用二氯甲烷-甲醇(100 1)冲洗8BV，二氯甲烷-甲醇(50 1)冲洗12BV，二氯甲烧-甲醇(30 1)冲洗:3BV，洗脱流速为5mL/min，用薄层方法检验流份，检测小檗碱，巴马汀，黄连碱时展开剂为乙酸乙酯二氯甲烷甲醇二乙胺(10 10 1.5 1)；检测非洲防己碱，药根碱，木兰花碱和Groenlandcine时展开剂为二氯甲烷甲醇二乙胺 (20 3 1)；对照标准品，合并相同流份。依次分离得到107.7%ig巴马汀，3^.98mg小檗碱，30. 02mg黄连碱，32. 54mg非洲防己碱，24. 32mg药根碱，8. 88mg木兰花碱和12. 75mg Groenlandcine。经高效液相色谱检测纯度Welch Ultimate XB-C18 柱 Q50nmX4. 6nmID， 5μπι)；检测波长265nm;流速1.0mL/min;柱温25°C ；进样量10 μ 1。流动相0.06% 的三氟乙酸水溶液(A)，乙腈(B)；洗脱梯度0min 20 % B ；20min 20 % B ；25min 23 % B ；50min :25 % B。得巴马汀纯度为87.观％，小檗碱纯度为87. 70 %，黄连碱纯度为 87. 12%，非洲防己碱纯度为90. 01%，药根碱纯度为95. 56%，木兰花碱纯度为82. 39%和 Groenlandcine 纯度为 77. 50%。实施例2取30g黄连，加入重量体积比为5倍量的含盐酸的甲醇回流提取三次，每次一小时，合并提取液，用旋转蒸发仪减压回收乙醇后得粗浸膏。取1. 5g的粗浸膏用甲醇溶解后再用0.8倍量的100-200目的聚酰胺伴样，挥干溶剂后上样。取为粗浸膏量20倍量的 100-200目的聚酰胺用二氯甲烷湿法装于直径为2cm的柱子中，得到31cm高的柱层，再用二氯甲烷进行洗83 BV，洗脱流速为5mL/min，用薄层方法检验流份，薄层条件同实例1，合并相同流份。依次分离得到112. Olmg巴马汀，341. 22mg小檗碱，23. 02mg黄连碱，35. 35mg非洲防己碱，26. 02mg药根碱，11. 02mg木兰花碱和15. 3Img Groenlandcine。所得化合物纯度经高效液相检测，高效液相条件同实例1，得巴马汀纯度为87. 87%，小檗碱纯度为86. 31%, 黄连碱纯度为89. 42%，非洲防己碱纯度为90. 56%，药根碱纯度为96. 02%，木兰花碱纯度为 78. 57%和 Groenlandcine 纯度为 73. 20%。
权利要求
1.一种分离黄连生物碱的方法，包括黄连粗浸膏用聚酰胺拌样后上聚酰胺柱，用二氯甲烷洗脱或用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂梯度洗脱，用薄层层析检验流份，合并相同流份，干燥，即得。
2.权利要求1的方法，其中黄连粗浸膏由下列方法制备黄连粉碎后用0-100%的甲醇或乙醇的酸溶液超声或者回流提取，提取液中的酸为浓度为0. 5 % -1 %的盐酸或硫酸，黄连粉末与提取剂的重量体积比为1 2-1 8。。
3.权利要求1的方法，其中聚酰胺树脂的粒径为80-400目。
4.权利要求1的方法，其中柱体聚酰胺树脂的重量为黄连粗浸膏重量的10-35倍。
5.权利要求1的方法，其中洗脱是采用二氯甲烷洗脱。
6.权利要求1的方法，其中洗脱采用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂梯度洗脱，二氯甲烷和甲醇的体积比为1 0-20 1。
全文摘要
本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种利用聚酰胺树脂分离纯化黄连生物碱的方法。其特征是黄连粗浸膏用聚酰胺拌样后上聚酰胺柱，用二氯甲烷洗脱或用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂梯度洗脱，用薄层层析检验流份，合并相同流份，干燥，即可分离得到小檗碱、巴马汀、黄连碱、非洲防己碱、药根碱、木兰花碱、Groenlandcine等七个生物碱。本发明工艺操作简单，样品损失少，提高了分离效率，降低了生产成本。
文档编号C07D491/147GK102174050SQ20111005345
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月7日 优先权日2011年3月7日
发明者孔令义, 杨新苗, 汪俊松, 罗俊, 罗建光 申请人:中国药科大学