专利名称：一类半程电荷匹配两亲性自组装短肽及其用作纳米止血材料及疏水性药物载体的利记博彩app
技术领域：
本发明属于纳米医学材料领域，具体涉及一类半程电荷匹配两亲性自组装短肽及其在作为疏水性药物载体和止血材料方面的应用。
背景技术：
肽分子自组装技术是当今生物纳米技术当中的一朵奇葩，它已成为分子生物学、 化学、医学、材料学和工程技术等学科的交汇点，是创造新物质和产生新功能的重要手段。 短肽自组装后的纳米尺寸材料在生产生活中具有广泛的潜在用途，并已成功应用于纳米生物领域特别是细胞工程、组织工程、药物控释、再生药物、膜蛋白及能源工程等。临床上有很多疗效虽好但因溶解度的问题而受到使用限制的药物，两亲性自组装短肽材料可以通过与疏水性药物相互作用提高药物的水溶性，有望成为一种新型的疏水性药物载体材料。手术中常见的实质性脏器出血是临床上面临的一大难题，如果用常用止血材料按照常用止血方式有时对出血情况很难控制，而且有的止血药物需要较高的操作技术，止血时间较长，存在不良反应或者并发症，甚至威胁至生命。国内外已有短肽材料与出血点处的血液相互作用快速自组装成纳米纤维水凝胶而起到止血作用的报道，但目前现有技术公开的能自组装形成纳米级水凝胶支架材料的自组装短肽在结构上多具有全程电荷匹配的特点，即使是近两年报道出现了半程电荷匹配的两亲性短肽，但也是仅限于有限的一两条肽序列，本发明设计出了一类半程电荷匹配两亲性短肽，它们的肽链结构与已报道的半程电荷匹配两亲性短肽不同(Ruan LP, Zhang HY, Luo HL, et al. Proc Natl Acad Sci U SA. 2009,106(13) 5105-5110;赵晓军，阮丽萍，张航与，罗涵琳.一种半程电荷匹配九肽及其应用.专利号 CN 100543033C)。
发明内容
本发明的目的在于提供一类半程电荷匹配两亲性自组装短肽，该类短肽自组装后形成纳米纤维网状分枝结构，以增加氨基酸构建的自组装短肽种类，促进自组装短肽的应用。本发明的目的通过以下技术方案实现一类半程电荷匹配两亲性自组装短肽，其氨基酸序列的通式如下Ac-Pro-X1-Phe-X2-Phe-X3-Phe-Glu-Pro-NH2Ac为乙酰化N端，NH2*氨基化C端，其中Xp &为极性不带电荷氨基酸，X3为带正电荷的氨基酸，Xp X2 J3全为L型氨基酸，X1J2为相同或不同氨基酸均可。优选地，所述极性不带电荷氨基酸为Thr、Ser, Cys或Asn。优选地，所述带正电荷的氨基酸为Arg或His。其自组装原理是短肽分子间通过非共价键相互作用自发组合形成一种结构明确、 构造稳定、具有某种理化性能的分子聚集体或超分子结构，带电荷氨基酸的引入是为了产生电荷匹配形成反平行缠绕。本发明所述的短肽可采用固相多肽合成方法进行合成和生产以Fmoc保护的氨基酸为原料，Rink Amide-MBHA Resin (瑞克酰胺-MBHA树脂)为载体，20%哌啶/DMF溶液为脱保护剂，HBTU为肽键缩合剂，50%醋酐/吡啶(V V)溶液为氨基末端的乙酰化溶剂， 按已知序列从C端到N端的顺序依次偶联合成，氨基末端乙酰化。合成结束取下反应瓶，用甲醇冲洗树脂8次，除去DMF。氮气吹干后用TFA强酸裂解液将合成多肽从树脂上裂解下来，同时脱去所有保护基团。反应结束后收集溶有合成肽的裂解液，然后减压过滤，收集滤液，用冷乙醚沉淀溶解在滤液中的多肽，即得合成肽的粗品。合成肽粗品经高压液相反相层析柱分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后，得到目标合成短肽。本发明所述的半程电荷匹配两亲性自组装短肽应用于疏水性药物载体材料和纳米止血材料中。短肽自组装过程中与疏水性物质相互作用，可提高疏水性物质的水溶性，从而能够成为一种新型的疏水性药物载体。实验还表明将两亲性短肽的冻干粉末或不同质量体积比的肽水溶液作用于受损伤动物软组织切面后，立即形成为水凝胶，封闭出血口，起到快速止血和伤口护理的效果，而且短肽组成为天然氨基酸，在体内易于降解，产物无免疫原性，组织相容性好，因此通过添加药学上可接受的稳定剂或赋形剂可将短肽材料制备成一种适于临床上使用的纳米止血药物。本发明具有以下有益之处1、提供了一类结构新颖的半程电荷匹配两亲性短肽，丰富了自组装短肽纳米材料的种类，所述的两亲性短肽既可作为疏水性药物的载体材料而提高其水溶性，又可通过自组装形成纳米级纤维屏障，作为出血创面的纳米止血材料，能起到快速止血和伤口护理的效果。2、本发明所述的两亲性自组装短肽材料生产工艺简单可行、成本相对较低，其应用不仅能丰富现有的纳米医药材料种类，而且对人类生命健康具有重要意义。
图1是本发明所述的半程电荷匹配两亲性短肽①样品的高效液相(HPLC)色谱图， 结果显示它的纯度>95%。图2是本发明所述的半程电荷匹配两亲性短肽①样品的质谱(MS)图，结果显示它的分子量为1195. 7，这与它的理论值(1195. 3)非常相近。图3是本发明所述的半程电荷匹配两亲性短肽①样品的三维分子结构模型示意图，采用的是MDL ISIS Draw 2. 5软件基于能量最低原则绘制。图4是本发明所述的半程电荷匹配两亲性短肽①样品在25°C下的圆二色(⑶)光谱图。图5是本发明所述的半程电荷匹配两亲性短肽①样品经过超声后25°C下的圆二色光谱图。图6是本发明所述的半程电荷匹配两亲性短肽①样品超纯水溶液在原子力显微镜下的形貌图。图7是本发明所述的半程电荷匹配两亲性短肽①样品与疏水性药物模型芘超声后在原子力显微镜下的形貌图。
图8是本发明所述的半程电荷匹配两亲性短肽①样品超纯水溶液的透射电镜图。 用超纯水将其配制成为0. 3mg/ml，采用磷钨酸负染法制备样品，图中显示的形貌与原子力显微镜下所观察到的形态结构相吻合。图9是0. 4mg/ml的芘水溶液于磁力搅拌器上搅拌三天后在原子力显微镜下观看到的形貌图。图10是本发明所述的半程电荷匹配两亲性短肽①样品用于SD大鼠肝切面的止血实验图。将1 % (w/v)肽水液注入伤口表面，立即形成一透明的凝胶状物质，封闭出血口，达到迅速止血的目的。
具体实施例方式为了更好的理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明，实施例是对本发明的更进一步的解释，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。实施例1当&为Thr，X2为Asn，X3为Arg时，序列如下① CH3CO-Pro-Thr-Phe-Asn-Phe-Arg-Phe-Glu-Pro-NH2自组装短肽①的合成1、材料Fmoc-Pro-OH (N-芴甲氧羰基-脯氨酸)、Fmoc-Thr (tBu) -0H (芴甲氧羰基 _0_ 叔丁基-苏氨酸)、Fmoc-Phe-OH (N-芴甲氧羰基-苯丙氨酸)、Fmoc-Asn (Trt) -OH (芴甲氧羰基-N-三苯甲基-天冬酰胺)、Fmoc-Glu (OtBu) -OH(芴甲氧羰基_0_叔丁基-谷氨酸)、 Fmoc-Arg (pbf) -OH (N-芴甲氧羰酰基-2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-精氨酸)、Rink Amide-MBHA Resin (树脂)、HBTU(0-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT(1-羟基苯并三氮唑)购自上海吉尔生化有限公司。哌啶、醋酸酐、DMF(N、 N- 二甲基甲酰胺)、TFA(三氟乙酸)、NMM(N-甲基吗啉)、乙醚、甲醇和DCM( 二氯甲烷)购自天津市富宇精细化工有限公司。2、制备方法采用Fmoc (芴甲氧羰基)保护的固相合成法，其工艺步骤如下(1)称取 20g 0. 5mmol/g 的 Rink Amide-MBHA Resin 于肽合成器皿中，取 200ml DMF溶涨树脂30min，然后抽滤，再取用300ml DMF洗涤树脂，分三次进行，每次的洗涤时间为anin，抽滤干洗涤液后向肽合成器中加入100ml20%哌啶/DMF(V V)震荡反应30min， 反应结束后，再抽滤出反应液，再用400ml DMF分四次洗涤树脂，洗毕后取少量树脂做茚三酮检测试验，树脂呈阳性，向肽合成器皿中加入以下原料
Fmoc -Pro-OH
13.49g 15.16g 5.40g 4.39ml 160ml
HBTU
HOBT
NMM
DMF
上所述原料加完后，震荡反应30min，反应结束后，用300ml DMF分四次洗涤树脂， 每次洗涤时间2分钟，取少许树脂做茚三酮试验检测，树脂呈阴性。(2)向肽合成器皿中加入5ml 20%哌啶/DMF (V V)震荡反应30min，反应结束后抽滤出反应液，再用40ml DMF分四次洗涤树脂，洗毕取少许树脂做茚三酮试验检测，结果树脂呈阳性，向反应器皿中加入以下原料
权利要求
1.一类半程电荷匹配两亲性自组装短肽，其特征在于，其氨基酸序列的通式如下 Ac-Pro-X1-Phe-X2-Phe-X3-Phe-Glu-Pro-NH2其中W为极性不带电荷氨基酸，&为带正电荷的氨基酸，X1^2J3全为L型氨基酸。
2.根据权利要求1所述短肽，其特征在于，所述极性不带电荷氨基酸为Thr、Ser,Cys 或 Asn0
3.根据权利要求1或2所述短肽，其特征在于，所述带正电荷的氨基酸为Arg或His。
4.权利要求1 3任意一项中所述短肽在作为疏水性药物载体材料中的应用。
5.权利要求1 3任意一项中所述短肽在作为纳米止血材料中的应用。
全文摘要
本发明公开了一类半程电荷匹配两亲性自组装短肽，其特征在于，其氨基酸序列的通式如下Ac-Pro-X1-Phe-X2-Phe-X3-Phe-Glu-Pro-NH2，其中X1、X2为极性不带电荷氨基酸，X3为带正电荷的氨基酸，X1、X2、X3全为L型氨基酸。本发明所述的半程电荷匹配两亲性短肽既可作为疏水性药物的载体材料而提高其水溶性，又可通过自组装形成纳米级纤维屏障，作为出血创面的纳米止血材料。本发明所述的一类半程电荷匹配两亲性自组装短肽纳米材料生产工艺简单可行、成本相对较低，其应用不仅能丰富现有的纳米医药材料种类，而且对人类生命健康具有重要的现实意义。
文档编号C07K7/06GK102199195SQ20111005306
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月7日 优先权日2011年3月7日
发明者何道航, 唐丽丽 申请人:华南理工大学