专利名称：抗体制备方法及所得抗体和抗体库的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及筛选和/或制备感兴趣蛋白质的特异性抗体的方法。本发明具体涉及一种高通量、低成本和高成功率的方法，其可用于在蛋白质组规模预测感兴趣蛋白质的表位，制备其特异性抗体，以及筛选和检测所产生的抗体。
背景技术：
基因组技术的发展，在基因的层面上为生物功能的研究、疾病的诊断和治疗、以及药物的开发等领域提供了大量的基础信息。但是对于大多数的生物体系来说，单纯的基因信息并不足以阐明其作用机制。此外，如果要利用这些信息以及作用机制来实现应用的目的，如对病理状况进行鉴定和分析、对药物的作用机制及效果进行验证和判断，则需要更进一步地在蛋白质的层面上获取更多的信息，例如分析和研究各种蛋白质的结构、功能、表达、定位、修饰、以及相互作用等性质。对蛋白质各种性质的鉴定需要借助很多的技术手段，如质谱、层析、电泳、芯片以及各种标记技术等，这其中的很多技术手段都需要通过抗原抗体的相互作用来实现。此外，抗原抗体相互作用本身也是非常重要的技术手段，其可以广泛地应用于科研、医疗以及药物开发等各个领域，例如治疗性抗体药物的开发等。随着蛋白质研究的深入进展，对各种抗体乃至抗体库的需求也日益增加，例如需要针对某物种蛋白组中所有蛋白制备其特异性抗体库，或者针对某一特定类别的蛋白如激酶、G蛋白受体等制备其特异性抗体等等。但是目前已知的仅仅是针对几千种蛋白的有限抗体，而且其特异性也满足不了很多技术手段的需要。因此，能够针对任何感兴趣蛋白快速、高效且大量地制备高度特异的抗体将具有十分重要的意义。目前常用的获取抗体方法包括杂交瘤技术、重组抗体技术、各种分子展示技术，以及将上述这些技术与高通量的方法结合的技术等。抗体的制备，通常主要是通过天然或重组蛋白或其片段来免疫动物，使动物体内产生能够特异地识别和结合所述蛋白的抗体。然后根据需要再使用各种技术手段从动物的细胞中获取抗体，如单克隆抗体或者多克隆抗体等。单克隆抗体的获取通常需要借助杂交瘤技术，该方法在免疫动物后，需要取动物细胞进行融合以获得产生抗体的杂交瘤，再进行克隆建株以产生抗体，随后再对抗体进行纯化和鉴定。根据需要可以再进一步确定其抗原表位。这种产生单克隆抗体的杂交瘤技术最早应用于鼠模型(K6hler和Milstein，Nature vol. 256，1975)，如今已广泛的应用于各种动物模型，其详细过程可参见各种教科书和操作手册的介绍(如 Bazin,“Rat hybridomas andrat monoclonal antibodies”,CRCPress, 1990 ;Goding,“Monoclonal antibodies !principles and practice，，, 3rd edition,Academic Press,1996 ;Shepherd 和 Dean “Monoclonal antibodies，，Oxford UniversityPreSS，2000等)。此方法虽然目前仍广泛应用于抗体制备，但其也具有很多缺点，如制备周期很长、制备技术非常复杂、不能够完全识别表位、以及成本高昂等缺点，而且这种方法也并不能应用于所有的蛋白质，例如对于很多免疫原性低或者具有毒性的抗原来说，这种方法就不适用(SinclairNR (et al，2004)B cel 1/antibody to lerance to our own antigens.Front Biosci 9 :3019-3028)。此外，为获得具有特异性的单克隆抗体，目前常用的是将化学合成的肽片段偶联至载体蛋白，然后免疫小鼠。此方法一次得到针对同一蛋白质单一表位的抗体，而由于肽片段本身免疫原性的差异，这种策略的整体成功率不高。特别是对于同源性很高的蛋白，筛选出来的肽的免疫原性很差，很难刺激小鼠机体产生强免疫反应。另一常用策略是采用全长蛋白质或者蛋白 质片段制备免疫原，部分解决了上述问题，但却又存在蛋白表达整体成功率不高的缺陷(一般表达纯化体系为30-70% ) (Thorsten Kohl, ChristianSchmidt,Stefan ffiemann, Annemarie Poustka and Ulrike Korf. Drew, 2003)。对于在所用动物中具有高同源性的蛋白质片段，动物免疫应答一般较弱，制备单克隆抗体的成功率较低(Sinclair NR et al, 2004, Automated productionof recombinant human proteins asresource for proteome research ProteomeScience 2008,6 :4 ;Sinclair NR(2004)Bcell/antibody tolerance to our ownantigens. Front Biosci 9:3019-3028)。重组抗体技术可以与各种分子展示技术相结合，从而针对多种抗原来产生对靶具有高度亲和力的抗体，并且可以同步确定抗原表位，因而常用于药物开发中(ChristineRothe,Stefanie Urlinger,Makiko Yamashita et al. TheHuman Combinatorial AntibodyLibrary HuCAL GOLD Combines Diversification of All Six CDRs According to theN atural Immune System witha Novel Display Method for Efficient Selection ofHigh-Affinity Antibodies. J. Mol. Biol. (2008) 376，1182—1200，2007)。但重组抗体技术的操作复杂，成本高昂，产量较低，而且还经常存在非特异性结合，从而限制了其大规模的应用 ° (Levitan, B. Stochastic modeling and optimization of phage display. J. Mol.Biol. 277,893-916 (1998). Bradbury et al，2004)为提高免疫和筛选效率，可以将上述技术与高通量的方法相结合，例如采用多种免疫原同时免疫并使用芯片技术进行筛选的高通量策略，如CN200510026873. 0所述。但这种免疫策略需要大量高免疫原性的免疫原，这对于难以进行表达和提纯的蛋白质或者对于免疫原性很低的蛋白质来说，也是很难实现的。另外传统的多免疫原同时免疫的方法只能在产生抗体后根据需要再通过特定技术如表位定位(epitope mapping)来被动地确定该抗体所针对的表位(参见GlennE. Morris,“Methods in Molecular Biology Epitope MappingProtocoIs^,Humana Press,1996)。所述表位有时也并非感兴趣蛋白质所特有的，通常也可在同物种的很多其它蛋白质中出现，因而所产生的抗体的特异性较低。为解决上面提到的各种问题，需要新的抗体制备和筛选方法，从而能够针对所有蛋白质高效、快速、低成本的制备和筛选出高度特异的抗体。发明概述本发明提供了一种制备感兴趣的蛋白质的抗体的方法，该方法包括(a)预测和/或选择位于感兴趣的蛋白质表面的肽片段；(b)合成或表达一或多个所述肽片段；(c)利用步骤(b)的产物免疫动物，任选组合佐剂进行免疫；(d)用来自步骤(C)的经免疫的动物的淋巴细胞来获得抗体；(e)用步骤(a)的肽片段和/或天然构象的所述感兴趣的蛋白质筛选步骤(d)中所获得的抗体，得到所述感兴趣的蛋白质的抗体库。在一个实施方案中，本发明的方法可通过如下方法预测或选择所述步骤(a)中的肽片段(i)根据感兴趣的蛋白质的序列，通过计算如下参数来确定表面肽，所述参数选自溶剂可接近性、无序指数、蛋白-蛋白相互作用的结构域预测、或以上任意组合；(ii)将步骤(i)所确定的表面肽与感兴趣的蛋白质所来源物种的蛋白质组进行序列比对，筛选出所述感兴趣的蛋白质的特异性肽片段；和(iii)将步骤(i)所确定的表面肽与其他物种的同源蛋白质进行序列比对，筛选出所述感兴趣的蛋白质的保守序列。 在一个实施方案中，本发明方法步骤(a)中所述肽片段是感兴趣的蛋白质的线性表面身份肽和/或构象型表面身份结构域。在一个实施方案中，所述身份肽具有如下特点长度是6-12个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、不位于跨膜区、而位于无序区域。在另一个实施方案中，所述身份结构域是长度为100-500个氨基酸的、预期具有3维结构的序列特异性蛋白质片段。在一个实施方案中，本发明方法步骤(b)通过与增强免疫原性和/或增加拷贝数的蛋白质的融合蛋白的形式重组表达所述一或多个肽片段。在一个实施方案中，所述增强免疫原性和/或增加拷贝数的蛋白质是病毒样颗粒蛋白质载体。在一个实施方案中，所述病毒样颗粒蛋白质载体为乙肝病毒核衣壳(roc)蛋白。在一个实施方案中，所述一或多个肽片段插入到HBC蛋白的环、N端或C端，例如插入位点位于HBC蛋白的第77和第82位氨基酸残基之间。在一个实施方案中，通过接头连接的2-10个肽片段插入到HBC蛋白中。所述接头可以是(GGGGS)n，其中n为任意整数，例如1、2、3或4。在一个实施方案中，本发明所述方法步骤(b)中一或多个肽片段进一步与免疫增强载体蛋白偶联。在一个实施方案中，所述免疫增强载体蛋白为匙孔血蓝蛋白(KLH)。在一个实施方案中，本发明所述方法步骤(b)中的一或多个肽片段是化学合成的。在一个实施方案中，本发明方法步骤(C)所述的免疫任选组合佐剂进行，例如佐剂选自弗氏完全佐剂、铝、CpG、或其任意组合。在一个实施方案中，本发明方法步骤(C)的免疫在多位点进行，例如在选自以下位点的至少2个位点进行颈背部、尾根、后足掌、后侧腹股沟、前腿腋窝、后腿肌肉。在一个实施方案中，进行多次免疫，时间间隔为2-14，例如3-4天。在一个实施方案中，本发明方法步骤(C)的免疫包含如下步骤(A).首次免疫，在颈背部、尾根、后足掌、后侧腹股沟以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及弗氏完全佐剂进行免疫；并在后腿肌肉使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫；(B).第二次免疫，在颈背部、后侧腹股沟以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及弗氏完全佐剂进行免疫；并在后腿肌肉使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫；(C).第三次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫；和(D).第四次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫。在一个实施方案中，在第一天进行首次免疫，在第5天进行第二次免疫，在第8天进行第三次免疫，在第11天进行第四次免疫。
本发明方法步骤(d)可以通过至少一种选自如下方法来获得抗体(1)将来自步骤(C)经免疫的动物的淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞并表达从而获得抗体；(2)从来自步骤(C)经免疫的动物的淋巴细胞中分离出抗原特异性B细胞，再利用PCR来克隆和表达抗体基因从而获得抗体；或者(3)从来自步骤(C)经免疫的动物的淋巴细胞中分离出mRNA ，然后通过噬菌体展示、或核糖体展示、或酵母展示、或细菌展示、或杆状病毒展示、或哺乳细胞展示、或mRNA展示来获得抗体。在一个实施方案中，本发明的方法获得主要包含单一 IgG亚型的抗体。在一个实施方案中，本发明方法步骤(e)的抗体库是针对一个物种所有感兴趣蛋白质的抗体库。在另一个实施方案中，本发明方法步骤(e)的抗体库是包含了针对一种感兴趣的蛋白质的所有表位的抗体的抗体库。在一个实施方案中，本发明方法步骤(e)通过亲和力排序筛选步骤(d)中所获得的抗体。本发明的方法还可以进一步包括筛选功能性抗体或检测性抗体的步骤(f)。例如，所述检测性抗体通过Western印迹、IP、IF、IHC、流式细胞计数、ELISA或其任意组合进行筛选；所述功能性抗体通过可阻断或中和测定来进行筛选。在另一方面，本发明提供了确定感兴趣的蛋白质的表位的方法，所述方法包括用上述步骤(a)中所预测和/或筛选的肽片段构建检测抗原来对所产生的抗体进行筛选以确定表位的步骤。
图I :多克隆位点设计图示与核苷酸序列。图2 :人造HBc图示。图3 :H载体结构图。图4 4A1抗体Western结果验证。C2C12细胞以含蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA缓冲液(50mM Tris pH7. 4,150mM NaCl, 1% Triton-X-100，I %脱氧胆酸钠 0. 1% SDS 裂解液)裂解，SDS-PAGE电泳，然后转移至PVDF膜，加入I 5稀释的单克隆抗体细胞株的培养上清，以 ECL Plus (Amersham)检测。WB western 印迹。图5 :4A1抗体IF验证数据。5X IO3个BHK细胞接种到细胞载玻片上于37 °C培养过夜，冰甲醇(_20°C )固定15min，lXPBS洗涤2X3min，l% BSA室温封闭Ih后，加入单克隆抗体细胞株培养上清I : I室温孵育I小时，洗涤，加入二抗抗小鼠Dylight549 (Abcam) I 400和DAPI I 4000室温孵育lh，洗涤，荧光显微镜(Olympus)镜检拍照。图6 :针对GPRl 16蛋白获得的抗体1A6的Western结果验证。WB western印迹。图7 :针对Aofl蛋白获得的抗体2F1的Western结果验证。WB western印迹。发明详述除非另有说明，所有技术和科学术语都具有本领域技术人员常见的含义。所有专利，专利申请，公开出版物，GenBank序列，网站以及其他公开材料均全文援引加入本文，除非另有说明。本发明提供了一种制备感兴趣的蛋白质的抗体的方法，其能够高效、快速、低成本地制备所述蛋白质的高度特异性抗体，进而建立覆盖感兴趣的蛋白质表面表位的表位库以及针对所有表位的抗体库。本发明还提供了明确抗体所针对的特定表位的方法。本发明提供了一种制备感兴趣的蛋白质的抗体的方法，所述方法包括(a)预测和/或选择位于感兴趣的蛋白质表面的肽片段；(b)合成或表达一或多个所述肽片段；(C)利用步骤(b)的产物免疫动物，任选组合佐剂进行免疫；(d)用来自步骤(C)的经免疫的动物的淋巴细胞来获得抗体；(e)用步骤(a)的肽片段和/或天然构象的所述感兴趣的蛋白质筛选步骤(d)中所获得的抗体，得到针对所述感兴趣的蛋白质的抗体库。如本文所用，术语“感兴趣的蛋白质”是指任意的天然蛋白质，或者是经可变剪接(alternative splicing)而得到的天然蛋白质的同种型,或者是天然蛋白质的突变型,或者上述各种蛋白质的任意组合。本文所述“可变剪接”是指在同一个mRNA前体中，通过不同剪接方式(即通过不同剪接位点组合外显子)而产生不同的mRNA剪接异构体的过程。通过可变剪接所获得的蛋白质产物互为同种型，其可能会表现出不同功能和结构特性，或者在相同细胞中由于表达水平不同而导致不同表型。本文所述“突变型”是指天然蛋白质通过一或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加所获得的突变蛋白质。本文所用术语“肽片段”是指所述感兴趣的蛋白质中连续或者非连续的氨基酸序列，其可以是连续的线性多肽，也可以是构成结构域构象的非连续多肽的组合。在本发明的一个实施方案中，通过如下方法预测或选择所述步骤(a)中的肽片段(i)根据感兴趣的蛋白质的序列，通过计算如下参数来确定表面肽，所述参数选自 溶剂可接近性、无序指数、蛋白-蛋白相互作用的结构域预测、或以上任意组合；(ii)将步骤
(i)所确定的表面肽与感兴趣的蛋白质所来源物种的蛋白质组进行序列比对，筛选出所述感兴趣的蛋白质的特异性肽片段；和(iii)将步骤(i)所确定的表面肽与其他物种的同源蛋白质进行序列比对，筛选出所述感兴趣的蛋白质的保守序列。在一个实施方案中，步骤(a)中所述肽片段是感兴趣的蛋白质的线性表面身份肽和/或构象型表面身份结构域。本文所用术语“表面肽”是指位于天然蛋白质表面的线性肽片段和/或位于蛋白质表面构成结构域构象的非连续多肽的组合。本文所用术语“身份肽(signaturepeptide) ”是指与同物种蛋白质组中的其它蛋白质的序列相比较,感兴趣的蛋白质所独有的线性连续肽序列。本文所用术语“身份结构域(signature domain) ”是指与同物种蛋白质组中的其它蛋白质的结构域相比较，感兴趣的蛋白质所独有的结构域。本文所用术语“表面身份肽”和“表面身份结构域”分别是指位于蛋白质天然构象表面的“身份肽”和“身份结构域”。本文所用术语“溶剂可接近性”是代表蛋白内氨基酸暴露于构像蛋白表面程度的一个指标(参见 Bent Petersen, Thomas Nordahl Petersen, PernilleAndersen MortenNielsen and Claus Lundegaard. A generic method for assignment of reliabilityscores applied to solvent accessibility predictions. BMCStructuralBiology 2009，
9:51)0本文所用术语“无序指数”是代表氨基酸复杂程度的一个参数(参见PredragRadivoj ac，Lilia M. Iakoucheva, Christopher J. Oldfield, ZoranObradovic，VladimirN. Uversky, and A. Keith Dunker. Intrinsic Disorder andFunctional Proteomics.Biophysical Journal Volume 92，1439-1456(2007))。
本文所用术语“蛋白-蛋白相互作用的结构域预测”是指在蛋白与蛋白相互作用时，一些结构域在相互作用中扮演关键作用，通过分析蛋白氨基酸组成，可以预测两个蛋白以何种方式结合，较经典的软件如Autodock。(参见Bin Liu, Xiaolong Wang,Lei Lin, Buzhou Tang, Qiwen Dong and Xuanffang. Prediction of protein bindingsites in protein structures using hiddenMarkov support vector machine. BMCBioinformatics2009,10 :381)。
本文所用术语“蛋白质组”是指由某物种的基因组、或者某种细胞或组织所表达的所有蛋白质的集合。本发明所述的序列比对可通过本领域已知的各种方法进行，例如使用各种常用软件或者在线服务来进行，例如由NCBI所提供的BLASP等。本发明所述的预测和/或选择是指首先基于生物信息学的方法，针对特定的蛋白质，通过二级结构预测、同基因组比较、同源蛋白质结构预测来定义出具有蛋白质特异性且对该蛋白质具有较高覆盖范围的身份肽和/或身份结构域以作为潜在的表位。此类生物信息学的方法已广泛的应用于蛋白结构、功能以及相互作用的预测，如 Berglund L 等人(参见 Protein Science, 17 :606-613, 2008)介绍了针对整个人蛋白质组进行蛋白组层面的特异性表位筛选的方法，其中基于8、10、12氨基酸残基的滑动窗(sliding window)序列比对,用启发式(heuristic)方法来针对整个人蛋白质组预测每个人类蛋白质的序列一致性，基于此方法可对90%的人蛋白质找出至少一个特异性表位。Anderson HP 等人(参见 Protein Science, 15 :2558-2567, 2006)介绍了利用蛋白 3D结构数据来预测非连续表位的方法DiscoTope，这种方法基于抗原-抗体蛋白质复合物的X-ray晶体结构所确定的非连续性表位集合来评估氨基酸统计学、空间信息和表面可接近性。Yan CH等人(参见BMC Bioinformatics, 7 :262,2006)介绍了由氨基酸序列来预测潜在的DNA-结合位点的方法，其使用朴素贝叶斯分类器来预测特定的氨基酸序列是否为DNA结合位点。在一个实施方案中，本发明所述的身份肽是长度为6-12个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、非跨膜区以及位于无序区域的肽。在一个实施方案中，本发明所述的身份结构域是长度为100-500个氨基酸、预期具有3维结构的序列特异性蛋白质片段。在一个实施方案中，本发明所述方法步骤(a)预测和/或选择位于感兴趣的蛋白质表面的多个肽片段，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、直至位于感兴趣的蛋白质表面的所有可作为潜在表位的肽片段。在一个实施方案中，所述多个肽片段被设计为一个免疫抗原串联多肽。例如，所述免疫抗原串联多肽可以如下设计。对感兴趣的蛋白质的免疫参数如抗原性、亲水性、可接近性、等电点、信号预测、跨膜预测、特异性等参数的设定规则可参见Kolaskar AS等FEBSLett.276(1-2) :172-4,1990 ；Parker JM 等 Biochemistry. 25(19) :5425-32,1986 ；EminiEA等J Virol. 55 (3) :836_9，1985。对于任意一个感兴趣的蛋白质，首先根据预测的等电点和信号肽结果排除蛋白质中的这些区域。例如设置一个滑动窗，长度为5-20个氨基酸，在蛋白质上顺次移动一个氨基酸，将滑动窗的序列加入一个集合。例如，对于一个长度为n个氨基酸的蛋白质(假设它没有信号肽和跨膜区)，总共会产生n-9条短肽序列(移动框长度为10个氨基酸)。对每一短肽，计算(可参见Kolaskar AS等FEBS Lett. 276(1-2) =172-4,1990 ；Parker JM 等 Biochemistry. 25(19) :5425-32,1986 ；Emini EA 等 J Virol. 55(3)836-9，1985)它的等电点、可接近性、免疫原性、亲水性和根据BLAST方法的种属内特异性。在等电点大于3. 5时，计算每条短肽的上述参数的加权平均值(0. 2*免疫原性+0. I*可接近性+0. 2*亲水性+0. 5*种属内特异性)。根据加权平均值对这些短肽进行排序，选出分数最大同时肽段间重叠(overlap) < 3的短肽,例如选择7条短肽。本发明所述肽片段可以通过本领域已知的任何技术获得，例如重组表达或者化学合成，即本发明所述肽片段可以使用原核或真核表达系统用本领域已知的重组表达方法表达或者所述肽片段可以通过常规化学方法合成。
在一个实例中，例如对于难以进行表达及纯化的蛋白质或者具有很低免疫原性的蛋白质，为了制备特异性抗体，利用高免疫原性表达载体、高成功率的可溶蛋白质表达系统辅助产生这些蛋白质的潜在抗原。例如，可以提及的是病毒样颗粒蛋白载体乙肝病毒核衣壳(HBC)蛋白。HBC蛋白质是一种可携带各种来源的肽的非感染性类病毒颗粒载体，可用来结合靶肽以产生高效价抗体反应，因而在疫苗制备中广泛应用。HBC蛋白质可在特定位点如环、N端或C端等携带外源氨基酸，可将高达238个氨基酸的外源序列展示在蛋白质表面以促进免疫反应发生。关于HBC载体的详细描述可参见Good MF等，Science，235 =1059-1063,1987 ;PumpensP 和 Grens E, Intervirology,44 :98-114,2001 ；Clarke BE 等，Nature330 381-384,1987 ；Francis MJ 等，Nature 330 :168-170,1987 ；ffhitacre DC 等 Expert Rev.Vaccines 8:111565-1573,2009。在一个实施方案中，本发明方法步骤(b)中的一或多个肽片段插入到HBC蛋白的环、N端或C端，例如插入到HBC蛋白的第77和第82位氨基酸残基之间的位置。本发明的多个肽片段例如2-10个肽片段还可以通过接头连接，然后插入到HBC蛋白中。所述接头可以是本领域常规使用的任何街头，例如(GGGGS)n，其中n为任意整数，例如n = 1、2、3或4。例如，在一个实例中，选择N条免疫原性、特异性较高的肽片段(5彡N彡20)，其长度可以为M(5彡MS 20)个氨基酸。为了避免不同肽片段之间产生新的抗原表位，在不同肽片段之间插入一或多个弱免疫原性接头GGGGS将所述肽片段串联到一起。对于不同的蛋白质长度，可以选择不同的肽片段长度(5 < M < 20)，插入的片段数目可在5-20之间，肽片段的长度例如是6-12氨基酸，片段数目例如是小于10。在本发明的实施方案中，上述步骤(b)中表达的一或多个肽片段还可以进一步与免疫增强载体蛋白偶联，所述免疫增强载体蛋白例如是匙孔血蓝蛋白(KLH)。KLH蛋白是一种源于巨型匙孔帽贝(Megathura crenulata)的携氧金属蛋白，其常被用作产生抗体的载体蛋白。其所具有的多个表位以及其与哺乳动物的来源蛋白的差异性使得其成为了良好的用于产生抗体的载体蛋白。关于KLH蛋白的使用可参见Harris JR等，Micron. 30 (6):597-623,1999 以及 WO 2001/047552。本发明步骤(C)所述免疫动物可以通过本领域任何已知方法进行。本发明用来进行免疫的动物可以是本领域常用的动物，例如小鼠、大鼠、兔、棉羊、山羊、马、牛等。在一个实施方案中，可以使用适当佐剂，从而快速高效地获得高效价且亚型较单一的抗体。在一个的实施方案中，通过本发明的方法可以获得主要包含单一 IgG亚型的抗体。本发明所使用的佐剂可选自弗氏完全佐剂、铝、CpG、或其任意组合。
在一个实施方案中，本发明方法包括对动物进行多位点免疫。利用多位点免疫策略快速产生高亲和性抗体的具体方案例如参见Kilpatrick KE等人(Hybridoma 16:
(4)381-389，1997)。通过佐剂来调节抗体的亲和性以及亚型的方案例如参见Karagouni L等 Scand. J. Tmmuno1. 31 :745-754,1990 以及 Petty RE 等 Immunology 32 :49-55,1977。本发明所述在多位点对动物进行免疫可以在选自以下位点的至少2个位点进行颈背部、尾根、后足掌、后侧腹股沟、前腿腋窝、后腿肌肉。在本发明的一个实施方案中，对动物进行多次免疫。多次免疫之间的时间间隔可以根据本领域常规技术知识确定，例如2-14天，如3或4天。在一个实施方案中，本发明方法步骤(C)所述免疫包含如下步骤(A).首次免疫，在颈背部、尾根、后足掌、后侧腹股沟以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及弗氏完全佐剂进行免疫；并在后腿肌肉使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫；(B).第二次免疫，在颈背部、后侧腹股沟以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及弗氏完全佐剂进行免疫；并在后腿肌肉使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫；(C).第三次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫；和(D).第四次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫。在更具体的实施方案中，本发明方法步骤(C)的免疫包含如下步骤(A).首次免疫，在颈背部、尾根、后足掌、后侧腹股沟以及前腿腋窝使用在250 Ul缓冲液中的20 U g步骤(b)表达产物以及250 U I弗氏完全佐剂进行免疫；并在后腿肌肉使用在500 u I缓冲液中的20 ii g步骤(b)表达产物以及25 ill铝+10 ii g CpG的佐剂进行免疫；(B).第二次免疫，在颈背部、后侧腹股沟以及前腿腋窝使用在250 Ul缓冲液中的
10U g步骤(b)表达产物以及250 U I弗氏完全佐剂进行免疫；并在后腿肌肉使用在500 U I缓冲液中的10 y g步骤(b)表达产物以及25 ill铝+10 ii g CpG的佐剂进行免疫；(C).第三次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窝使用在500 Ul缓冲液中的IOu g步骤(b)表达产物以及25 ill铝+10 ii g CpG的佐剂进行免疫；和(D).第四次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窝使用在500 Ul缓冲液中的IOu g步骤(b)表达产物以及25 ill铝+10 ii g CpG的佐剂进行免疫。在一个实施方案中，在第I天进行首次免疫，在第5天进行第二次免疫，在第8天进行第三次免疫，在第11天进行第四次免疫，第14天融合，得到的抗体绝大多数为亲和力成熟的IgG亚型，IgG亚型抗体相对于IgM具有亲和力高、稳定性好以及易于纯化的优势。本发明方法步骤(d)所述用来 自经免疫的动物的淋巴细胞获得抗体可以本领域已知的任何方法进行。本文所用术语“淋巴细胞”是指淋巴器官的细胞或者由淋巴器官所产生的细胞，所述淋巴器官包括中枢淋巴器官(又称作初级淋巴器官)和周围淋巴器官(又称作次级淋巴器官)。前者包括胸腺、腔上囊或其相当器官(如哺乳动物的骨髓)，后者包括脾、淋巴结等。
在一个实施方案中，所述抗体通过至少一种选自如下的方法获得(1)将来自步骤(C)经免疫的动物的淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞并表达从而获得抗体；(2)从来自步骤(c)经免疫的动物的淋巴细胞中分离出抗原特异性B细胞，再利用PCR来克隆和表达抗体基因从而获得抗体；或者(3)从来自步骤(c)经免疫的动物的淋巴细胞中分离出mRNA，然后通过噬菌体展示、或核糖体展示、或酵母展示、或细菌展示、或杆状病毒展示、或哺乳细胞展示、或mRNA展示来获得抗体。杂交瘤技术的详细介绍可参见Bazin, “Rat hybridomas and ratmonoclonalantibodies，，，CRC Press, 1990 ;Goding, “Monoclonal antibodies !principles andpractice”，3rd edition, Academic Press,1996 ；Shepherd 和 Dean “Monoclonalantibodies” Oxford University Press, 2000 等文献。本发明方法步骤(d)也可通过噬菌体展示、或核糖体展示、或酵母展示、或细菌展示、或杆状病毒展示、或哺乳细胞展示、或mRNA展示来获得抗体。这些方法均为本领域常用技术，其具体的操作可参考相应的教科书和操作手册。例如可参见Mondon P等Front.Biosci. 13 :1117-1129, 2008。以噬菌体展示技术为例，其是通过将分离的抗体基因插入到噬菌体DNA中，从而抗体分子上能与抗原结合的可变区域被连接到噬菌体衣壳蛋白上。当噬菌体感染大肠杆菌后，单链DNA在大肠杆菌内进行复制，而噬菌体则重新组装并分泌到培养基中，同时并不裂解大肠杆菌。曬菌体与祀抗原共同温育，结合的曬菌体分离后，再进行扩增和纯化从而能够筛选出大量克隆。关于噬菌体展示技术可参见刘佳等细胞与分子免疫学杂志(Chin. J. CellMol. Immunol.) 2004 :20 (6) 773-775、CN03131796. O、WO2009/109572 以及 WO 2009/085462。本发明方法所产生的抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。在一个实施方案中，本发明涉及用本发明方法筛选和制备的针对一个物种所有感兴趣蛋白质的抗体库。在另一个实施方案中，本发明涉及用本发明方法筛选和制备的包含了针对一种感兴趣的蛋白质的所有表位的抗体的抗体库。本发明中所用的术语“抗体”、“单克隆抗体”、“多克隆抗体”、“表位”等是本领域所常用的术语，其含义符合本领域技术人员一般的理解，也可以参考常用的教科书和手册对其的定义。本发明所用的术语“抗体库”是指包含了多种不同的抗体的一种抗体集合，其可以包含针对多种不同蛋白的抗体，也可以包含针对同一蛋白不同表位的抗体。本发明方法步骤(e)中所述“筛选”是用步骤(a)的肽片段和/或天然构象的感兴趣的蛋白质来筛选步骤(d)获得的抗体。在一个实施方案中，本发明方法步骤(e)通过亲和力排序筛选步骤(d)中所获得的抗体。对抗体进行亲和性鉴定的方法可参见Griswold WR等 Immunology letters,1984 :229-232 ；Van Heyningen V 等 Journal of ImmunologicalMethods, 62 :147-153,1983 ；以及 Rath S 等 Journal of Immunological Methods,106 245-249，1988。在一个实施方案中，本发明方法还进一步包括筛选功能性抗体或检测性抗体的步骤(f)。例如，所述检测性抗体可以通过Western印迹、IP、IF、IHC、流式细胞计数、ELISA或其任意组合进行筛选，或所述功能性抗体通过可阻断或中和测定来进行筛选。本文所述检测性抗体是指可以与抗原反应并且可以通过本领域技术手段例如Western印迹、IP、IF、IHC、流式细胞计数或ELISA等检测的抗体。本文所述功能性抗体是指可以与抗原反应并且对抗原的生物学功能产生作用例如阻断或中和等的抗体。例如，通 过如下方法筛选针对所述感兴趣的蛋白质的抗体将所述感兴趣的蛋白质或其片段生物素化，在真核细胞例如293细胞中过表达，将所述过表达的生物素化蛋白质或其片段加入链霉抗生物素包被的平板中，之后加入本发明方法步骤(e)所获得的抗体进行ELISA测定，获得反应阳性的抗体。本发明获得的一种单克隆抗体4A1是由杂交瘤细胞株4A1产生的，所述杂交瘤细胞株4A1于2011年I月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCC201107。本发明获得的另一种单克隆抗体1A6是由杂交瘤细胞株1A6产生的，所述杂交瘤细胞株1A6于2011年I月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C201108。本发明获得的一种单克隆抗体2F1是由杂交瘤细胞株2F1产生的，所述杂交瘤细胞株2F1于2011年I月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C201109。在另一个方面，本发明提供了根据本发明方法获得的抗体库。在一个实施方案中，所述抗体库包含针对所有感兴趣蛋白质的抗体。在一个实施方案中，所述抗体库包含针对位于一种感兴趣蛋白质的表面上的所有表位的抗体。在一个实施方案中，所述抗体库中的抗体是单克隆抗体。在另一个方面，本发明还提供了确定产生的抗体所针对的表位的方法，包括用上述步骤(a)中所预测和/或筛选的肽片段构建检测抗原来对本发明所产生的抗体进行筛选以确定表位的步骤。本文所用术语“检测抗原”是指利用上述步骤中所预测和/或筛选的肽片段所构建的融合蛋白，该检测抗原可用于针对多个蛋白进行筛选，其中针对每个所要筛选的蛋白均含有一个表位。在一个实施方案中，本发明所采用的筛选策略是可以针对N个蛋白质的筛选策略，每个蛋白质设计的表位数和蛋白质数均可以是N个(5 < NS 20)，前提条件是对每种蛋白质所选择的表位数目一致。例如针对5种蛋白质，每个蛋白质在免疫抗原设计的时候确定了 5个抗原表位，分别以A、B、C、D，E表示(见表I)，例如免疫抗原I的表位分别是Al、BI、Cl、Dl和El。此处表位数和蛋白数均可以是N个(5 < NS 20)。5个蛋白质的检测抗原采用I列内的五个多肽表位做为一个新的蛋白序列(见表I，例如检测抗原A包含Al、A2、A3、A4和A5)。在筛选的过程中，每个融合后的阳性克隆孔(采用免疫抗原筛选得到)，分别采用5个检测抗原筛选，通过典型的ELISA筛选，从而明确每个阳性克隆针对哪个多肽表位。在此结果的基础上，优先挑取针对每个表位的阳性细胞进行建株和后续鉴定，从而避免在未知表位的情况下，阳性克隆只是针对某个最优势表位的细胞株最多，造成得到的细胞株的同质性。表I免疫抗原设计方法
I检测抗原A I检测抗原B I检测抗原C I检测抗原D I检测抗原E免疫抗原 I|aiIbiIciIdiIei
免疫抗原 2A2B2一 C2一 D2E2—
免疫抗原 3A3B3一 C3一 D3E3—
免疫抗原 4A4B4一 C4一 D4E4—
免疫抗原 5|A5|B5|C5|D5|e5 综上所述，本发明的方法通过生物信息学技术预测和/或选择位于感兴趣的蛋白质表面的肽片段作为潜在表位。本发明方法可以高效、快速、低成本地获得针对感兴趣的蛋白质的抗体，而且本发明方法可以获得针对位于感兴趣的蛋白质天然构象表面的表位的所有抗体。另外，本发明方法还可以通过组合筛选来确定位于感兴趣的蛋白质天然构象表面的表位，鉴定抗体所识别的特定表位，以及进一步对所产生的抗体进行检测和筛选。对于抗体应用成功的几个关键因素，包括抗体的识别位点(表位)，亲和力以及特异性。对于单克隆抗体，在不知道表位的情况下，得到的抗体往往集中于某个免疫原性优势表位，表位的单一性，会导致抗体应用不成功，主要与该表位的位置有关。明确知道抗体识别的表位，优先得到多个表位的抗体，会降低表位位置不正确的影响，大大提供细胞株应用的成功率。本发明的优势在于对于大样本抗体制备，本方法具有成功率高(> 90%以上蛋白能够得到Western应用成功抗体)，成本低的特点。对于高同源性蛋白质，受体蛋白结构域以及小鼠本身蛋白质均具有很高的成功率。对于小鼠自身蛋白抗体制备的意义在于，从中筛选得到的功能性抗体，可以用于小鼠动物模型的抗体治疗试验，对于临床前研究具有重要意义。对于膜受体蛋白，采用功能性结构域制备抗体，更有利获得具有阻断功能抗体，有利于抗体药物开发，采用本发明方法构建的抗体文库，可以用进一步开发功能性抗体。同时高通量的表位筛选策略，保证得到的每个细胞株明确知道对应的识别表位信息，对于研究抗体与蛋白的相互作用，以及采用多个表位抗体共同确定某种蛋白表达信息，均具有很重要意义。以下结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。下述实施例仅用于说明本发明，无意对本发明做出任何限制。在不脱离本发明的精神和实质的情况下，本领域人员可以对本发明做出多种改动和变化，这些改动和变化同样在本申请权利要求要求保护的范围内。
实施例实施例I :载体改造A、HBC载体改造的设计首先用一段设计好的多克隆位点(MCSGGATCCTATCAGATCTATCGGGTACCGTATCGCGGCCGCTTCCATATGGAATTC(SEQ ID NO :1))来替换乙肝病毒核衣壳蛋白(HBc) cDNA 的 c/el 环，即编码HBc蛋白第76-82位氨基酸的核苷酸。所述MCS的示意图与序列详见图I。然后，将所述MCS的两端连接编码L-N和L-C两个接头的核苷酸序列并替换编码HBc蛋白第76-82位氨基酸的核苷酸，其中L-N和L-C两个接头两端的E代表谷氨酸，G代表甘氨酸，S代表丝氨酸。随后，将编码6XHis标签(HHHHHH)、P-gal (MTMITDSL)、接头(EFH)等序列元件的核苷酸序列添加到此cDNA之前，改造后的HBc核苷酸序列如图2所示。B、全基因合成用 DNA Works 软件(得自 http: //helixweb. nih. gov/dnaworks/)通过密码子优化设计HBc核苷酸序列，如下所示CCATGGGCAGCAGCCACCATCATCACCACCACATGACCATGATCACCGATAGCCTGGAGTTCCATATCGATCCGTACAAGGAATTTGGCGCGACCGTGGAACTGCTGAGCTTCCTGCCGAGCGACTTTTTTCCAAGCGTGCGTGACCTGCTGGATACGGCGAGCGCACTGTATCGTGAAGCGCTGGAAAGCCCGGAACATTGCAGCCCGCATCATACCGCGCTGCGTCAGGCGATTCTGTGCTGGGGCGAACTGATGACCCTGGCGACCTGGGTGGGCGGCAATGAAGAAGGTGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGATCCTATCAGATCTATCGGGTACCGTATCGCGGCCGCTTCCATATGGAATTCGGTGGCGGCGGCAGCGGCGGTGGTGGCAGCGAAGAAGACCTGGTTGTGAGCTATGTGAACACCAATATGGGCCTGAAGTTTCGTCAGCTGCTGTGGTTTCATATTAGCTGCCTGACCTTTGGCCGCGAAACCGTGATTGAATACCTGGTGAGCTTTGGCGTGTGGATTCGTACCCCACCGGCGTATCGTCCGCCGAATGCGCCAATTCTGAGCACCCTGCCGGAAACGACCGTTTAAGAGCTCCG TCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAG(SEQ ID NO 2)优化的HBC核苷酸序列利用下表2所示的引物序列合成，所示引物序列由赛百盛(中国上海)公司合成。表2全基因合成引物序列
权利要求
1.一种制备针对感兴趣的蛋白质的抗体的方法，包括 (a)预测和/或选择位于感兴趣的蛋白质表面的肽片段； (b)合成或表达一或多个所述肽片段； (C)利用步骤(b)的产物免疫动物，任选组合佐剂进行免疫； (d)用来自步骤(C)的经免疫的动物的淋巴细胞来获得抗体； (e)用步骤(a)的肽片段和/或天然构象的所述感兴趣的蛋白质来筛选步骤(d)中所获得的抗体，得到针对所述感兴趣的蛋白质的抗体库。
2.权利要求I的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是天然蛋白质、和/或其选择性剪接的同种型、和/或其突变型。
3.权利要求2的方法，其中步骤(a)中所述肽片段是感兴趣的蛋白质的线性表面身份肽和/或构象型表面身份结构域。
4.权利要求3的方法，其中所述步骤(a)的肽片段是通过如下方法预测或选择的 (i)根据感兴趣的蛋白质的序列，通过计算如下参数来确定表面肽，所述参数选自 溶剂可接近性、无序指数、蛋白-蛋白相互作用的结构域预测、或以上任意组合； ( )将步骤(a)所确定的表面肽与感兴趣的蛋白质来源物种的蛋白质组进行序列比对，筛选出所述感兴趣的蛋白质的特异性肽片段； (iii)将步骤(a)所确定的表面肽与其他物种的同源蛋白质进行序列比对，筛选出所述感兴趣的蛋白质的保守序列。
5.权利要求4所述的方法，其中所述身份肽是长度为5-20个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、非跨膜区以及位于无序区域的肽。
6.权利要求4的方法，其中所述身份结构域是长度为100-500个氨基酸、预期具有3维结构的序列特异性蛋白质片段。
7.权利要求1-6任一项的方法，其针对一个物种所有的蛋白质来产生抗体库。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中步骤(e)所产生的抗体库包含针对感兴趣的蛋白质的所有表位的抗体。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中步骤(d)通过至少一种选自如下的方法而获得抗体 (1)将来自步骤(c)经免疫的动物的淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞并表达从而获得抗体； (2)从来自步骤(c)经免疫的动物的淋巴细胞中分离出抗原特异性B细胞，再利用PCR来克隆和表达抗体基因从而获得抗体； (3)从来自步骤(c)经免疫的动物的淋巴细胞中分离出mRNA，然后通过噬菌体展示、或者核糖体展示、或者酵母展示、或者细菌展示、或者杆状病毒展示、或者不如细胞展示、或者mRNA展示来获得抗体。
10.权利要求I至9任一项的方法，其中所述步骤(b)的一或多个肽片段以与增强免疫原性和/或增加拷贝数的蛋白质的融合蛋白的形式重组表达。
11.权利要求10的方法，其中所述增强免疫原性和/或增加拷贝数的蛋白质为病毒样颗粒蛋白载体。
12.权利要求11的方法，其中所述增强免疫原性和/或增加拷贝数的蛋白质为乙肝病毒核衣壳(HBC)蛋白。
13.权利要求12的方法，其中所述ー或多个肽片段插入到HBC蛋白的环、N端或C端。
14.权利要求13的方法，其中所述ー或多个肽片段插入到HBC蛋白的位置位于HBC蛋白的第77和第82位氨基酸残基之间。
15.权利要求12-14任ー项的方法，其中通过接头连接的2-10个肽片段插入在HBC蛋白中。
16.权利要求15的方法，其中所述接头是(GGGGS)n，其中η= 1、2、3或4。
17.权利要求16的方法，其中η= I或2。
18.权利要求I至9任ー项的方法，其中所述步骤(b)表达的ー或多个肽片段进ー步与免疫增强载体蛋白偶联。
19.权利要求18的方法，其中所述免疫增强载体蛋白为匙孔血蓝蛋白(KLH)。
20.权利要求I至9任ー项的方法，其中所述步骤(b)的一或多个肽片段是化学合成的。
21.权利要求I至20任ー项的方法，其中所使用的佐剂选自弗氏完全佐剂、铝、CpG,或其任意组合。
22.权利要求I至21任ー项的方法，其中所述步骤(c)在多个位点免疫动物。
23.权利要求22的方法，其中所述多位点免疫在选自以下位点的至少2个位点进行颈背部、尾根、后足掌、后侧腹股沟、前腿腋窝、后腿肌肉。
24.权利要求22或23的方法，其中进行多次免疫，时间间隔为2-14天，例如3_4天。
25.权利要求24的方法，其中步骤(c)中的免疫方案包含如下步骤 (A).首次免疫，在颈背部、尾根、后足掌、后侧腹股沟以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及弗氏完全佐剂进行免疫；并在后腿肌肉使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫； (B).第二次免疫，在颈背部、后侧腹股沟以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及弗氏完全佐剂进行免疫；并在后腿肌肉使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫； (C).第三次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫； (D).第四次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫。
26.权利要求25的方法，其中在第一天进行首次免疫，在第5天进行第二次免疫，在第8天进行第三次免疫，在第11天进行第四次免疫。
27.权利要求1-27任ー项的方法，其中所产生的抗体为单ー的IgG亚型。
28.权利要求27的方法，其中所产生的抗体为单克隆抗体。
29.权利要求27的方法，其中所产生的抗体为多克隆抗体。
30.权利要求1-29任ー项的方法，其中所述步骤(e)通过亲和力排序筛选步骤(d)中所获得的抗体。
31.权利要求1-30任ー项的方法，进ー步包括筛选功能性抗体或检测性抗体的步骤(f)。
32.权利要求31的方法，其中所述检测性抗体通过Western印迹、IP、IF、IHC、流式细胞计数、ELISA或其任意组合进行筛选。
33.权利要求31的方法，其中所述功能性抗体通过阻断或中和测定来筛选。
34.权利要求1-33任一项的方法，其中所述方法可以针对90%以上的感兴趣的蛋白质产生检测性抗体和/或功能性抗体。
35.一种根据权利要求1-34任一项的方法获得的抗体库。
36.权利要求35的抗体库，其包含针对一个物种所有感兴趣蛋白质的抗体。
37.权利要求35的抗体库，其包含针对位于一种感兴趣蛋白质的表面上的所有表位的抗体。
38.权利要求35-37任一项的抗体库，其中所述抗体是单克隆抗体。
39.权利要求35的抗体库，其中所述库包括用于在Western印迹、IP、ELISA、IHC、IF或流式细胞术中检测感兴趣的蛋白质的抗体，和/或用于中和和/或阻断感兴趣的蛋白质的功能的抗体。
全文摘要
本发明提供了一种针对感兴趣的蛋白质制备其抗体的方法，其能够针对所有蛋白质高效、快速、低成本地制备具有高度特异性的抗体，并且能够明确抗体所针对的表位，进而建立起覆盖感兴趣的蛋白质表面的表位库以及针对所有表位的抗体库。这些抗体证明能够用于检测，蛋白功能研究和抗体制药。
文档编号C07K16/00GK102618940SQ201110034648
公开日2012年8月1日 申请日期2011年1月31日 优先权日2011年1月31日
发明者孟逊, 汪国兴, 王小清, 陈泽庸 申请人:艾比玛特生物医药(上海)有限公司