专利名称：水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖的利记博彩app
技术领域：
本申请涉及水解糖蛋白上的甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接(linkage)的方法，更特别的涉及使用甘露糖苷酶水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接，脱帽糖蛋白上的磷酸-6-甘露糖残基。背景、
目前研发中的大部分生物药(例如，重组蛋白)的生产需要高性能的表达系统。许多这类生物药的生物学活性依赖于它们的翻译后修饰(例如，磷酸化或糖基化)。基于酵母的表达系统组合了遗传操作的简便与能够分泌和修饰蛋白质的微生物发酵组合。然而，在酵母细胞中生产的重组糖蛋白主要表现出异质的高甘露糖和超甘露糖聚糖结构，对蛋白质功能、下游加工和后续的治疗用途是有害的，特别是当糖基化作用发挥重要的生物学作用时。美国系列申请号12/062，469通过引用全文整合。概述本发明至少部分的基于发现了能够水解糖蛋白上的甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接的甘露糖苷酶。藉此，甘露糖苷酶可用于获得还有脱帽末端甘露糖-6-磷酸残基的糖蛋白。本文中描述了获得此类糖蛋白的体外和体内方法。遗传改造过的细胞可用于方法中，生产具有脱帽末端甘露糖-6-磷酸残基的靶分子。在一个方面，本文件的特征是脱帽寡糖上的甘露糖-6-磷酸残基的方法。方法包括提供具有甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接的寡糖；和将寡糖与能够水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶接触。接触步骤可以使用纯化的甘露糖苷酶、重组的甘露糖苷酶、含有所述重组的甘露糖苷酶的细胞裂解物，或者含有所述重组的甘露糖苷酶的真菌细胞来实施。甘露糖苷酶可以包括靶向序列。寡糖可以与蛋白质(例如，在真菌生物中表达的人蛋白)连接。在另一个方面，本文件的特征是生产具有末端磷酸-6-甘露糖残基的靶蛋白的方法。方法包括提供经过遗传改造的真菌细胞，所述真菌细胞包括编码甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能够水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖；和向所述细胞导入编码靶蛋白的核酸，其中所述细胞生产包括所述末端的磷酸-6-甘露糖残基的靶蛋白。 本文件的特征还是在真菌生物中生产具有末端磷酸-6-甘露糖残基的靶蛋白的方法。方法包括提供经过遗传改造的真菌细胞，所述真菌细胞包括编码甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能够水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖，且所述真菌细胞进一步包括编码靶蛋白的核酸；和分离具有所述末端磷酸-6-甘露糖残基的靶蛋白。真菌细胞进一步包括编码能够促进甘露糖基磷酸化的多肽的核酸，和/或经过遗传改造缺少OCHl活性。本文件的特征还是经过遗传改造生产包含末端磷酸-6-甘露糖残基的糖蛋白的分离的真菌细胞。所述真菌细胞包括编码甘露糖苷酶的核酸，其中甘露糖苷酶在真菌细胞中的表达产生了包含末端磷酸-6-甘露糖残基的糖蛋白。真菌细胞还可以包括编码靶糖蛋白的核酸。在另一个方面，本文件的特征是解脂耶氏酵母、毕赤酵母、多形汉逊酵母、Arxulaadeninivorans、甲醇毕赤酵母、Oogataea minuta或黑曲霉细胞的基本纯的培养物,其大部分被遗传改造为生产包括末端磷酸-6-甘露糖残基的糖蛋白，所述细胞包括编码能够水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶的核酸。在本文描述的任何实施方案中，真菌生物可以是解脂耶氏酵母(YairowiaIipolytica)或Arxula adeninivorans。真菌生物可以是甲基营养型酵母，例如毕赤酵 母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、Oogataea minuta 或多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。真菌生物可以是丝状真菌(例如，选自浅蓝灰曲霉(Aspergillus caesiellus)、亮白曲霉(Aspergillus candidus)、肉色曲霉(Aspergilluscarneus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、弯头曲霉(Aspergillus deflectus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、赫曲霉(Aspergillus ochraceus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)、Aspergillus penicilloides、局限曲霉(Aspergillus restrictus)、酱油曲霉(Aspergillus so jae)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、Aspergillus tamari、土曲霉(Aspergillus terreus)、焦曲霉(Aspergillus ustus)和花斑曲霉(Aspergillusversicolor)的丝状真菌)。在本文描述的任何实施方案中，蛋白质可以是病原体蛋白、溶酶体蛋白、生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体或其抗原结合片段，或融合蛋白。溶酶体蛋白可以是溶酶体酶(例如，与溶酶体贮积症(LSD)相关的溶酶体酶，如酸性a葡萄糖苷酶或a半乳糖苷酶)。LSD可以是费波瑞病、I型粘多糖病、法伯氏病、高歇氏病、GMl-神经节苷脂沉积病、泰-萨二氏病、山德霍夫氏病、GM2活化因子病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、尼曼-匹克病(Fabry’s disease, mucopolysaccharidosis I, Farber disease, Gaucher disease, GMl-gangliosidosis, Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, GM2 activatordisease,Krabbe disease, metachromatic leukodystrophy, Niemann-Pick disease)、V型粘多糖病(Scheie disease)、II型粘多糖病(Hunter disease)、IV型粘多糖病(Sanfilippo disease)、莫奎欧氏症(Morquio disease)、VI 型粘多糖病(Maroteaux-Lamydisease)、透明质酸酶缺乏症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、岩藻糖代谢病、甘露糖苷贮积症、辛德勒病、I型唾液腺病、庞贝氏症、骨密质发育不全、蜡样脂褐质沉积症、胆固醇酯沉积病、沃尔曼病、多种硫酸酯酶缺乏症、半乳糖涎酸贮积症、粘脂沉积症、胱氨酸病、唾液酸忙积功能障碍、具有Marinesco- Sj6greil综合征的乳糜微滴滞留病、Hermansky-Pudlak综合征、Chediak-Higashi综合征、Danon氏病或Geleophysic发育不良。例如，LSD可以是庞贝氏症或费波瑞病(hyaluronidase deficiency, asparty Iglucosaminuria,fucosidosis, mannosidosis, Schindler disease, sialidosis type I, Pompedisease,Pycnodysostosis, ceroid lipofuscinosis, cholesterol ester storagedisease, Wolman disease, Multiple sulfatase deficiency, galactosialidosis, mucolipidosis, cystinosis, sialic acid storage disorder, chylomicron retention diseasewith Marinesco- Sjogren syndrome, Hermansky-Pudlak syndrome, Chediak-Higashisyndrome, Danon disease, or Geleophysic dysplasia. Forexample, the LSD can be Pompedisease or Fabry’ s disease)。在本文描述的任何实施方案中，对于甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸侧链中的原子的三维蛋白坐标落入距图33中等价原子的坐标1.5 A偏差以内。在本文描述的任何实施方案中，甘露糖苷酶可以包括与SEQ ID NO:50的I至774位残基所述的氨基酸序列或SEQ ID NO:50所述的氨基酸序列具有至少90%同一性(例如，至少95%或98%同一性)的氨基酸序列。在本文描述的任何实施方案中，甘露糖苷酶可以包括以下氨基酸序列，所述序列 具有(i)GVGXXGXGG 基序，其中 X 是 Gly，Ala, Ser, Thr 或 Cys ; (ii) VRXE 基序，其中 X 是除Pro 以外的任何氨基酸；(iii) X1YQGX2 基序,其中 X1 是 Leu, He, Val, Ala, Phe, Tyr 或 Met,其中X2是Thr，Ser或Asn ;或(iv)⑶XGN，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。在本文描述的任何实施方案中，甘露糖苷酶可以是C.cellulans、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)或变铅青链霉菌(Streptomyces Iividans)的甘露糖苷酶。在本文描述的任何实施方案中，真菌细胞可以进一步包括编码促进甘露糖基磷酸化的多肽的核酸(例如，MNN4多肽,如解脂耶氏酵母、酿酒酵母、Ogataea minuta、毕赤酵母或白色念珠菌的多肽)和/或可以经过遗传改造缺少OCHl活性。例如，能够促进甘露糖基磷酸化的多肽是毕赤酵母PNOl多肽。在本文描述的任何实施方案中，甘露糖苷酶可以进一步包括分泌信号和/或靶向信号，将甘露糖苷酶靶向到胞内区室。靶蛋白和甘露糖苷酶可以是共同分泌的。本文件的特征还是包含末端磷酸-6-甘露糖残基的分离的糖蛋白，其中蛋白是由本文描述的方法生产的。在仍然另一个方面，本文件的特征是包含糖蛋白的组合物，其中糖蛋白上至少47%的N-聚糖具有末端磷酸-6-甘露糖残基。例如，糖蛋白上至少50%、75%、80%、85%或90%的N-聚糖可具有末端磷酸-6-甘露糖残基。本文件的特征还是分离的核酸，所述核酸包括SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ IDNO: 10、SEQ ID NO: 12 或SEQ ID NO: 14所述核苷酸序列，或者与 SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14至少90%相同的核苷酸序列。本文件的特征还是这样的载体，所述载体包括与上述核酸有效连接的启动子，其中所述核酸编码甘露糖苷酶。核酸可以进一步包括分泌信号或靶向信号，将甘露糖苷酶靶向到胞内区室。除非另外定义，则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文所述相似或等价的方法和材料可用于实践或测试本发明，但下文仍描述了示例性的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、Genbank 登录号和其他参考文献都通过引用全文整合到本文中。在发生冲突的情况下，由本申请，包括定义主导。材料、方法和实例都只是示例性的，并非意在限制。根据下列详细的说明和权利要求，本发明的其他特征和优点是显而易见的。
附图简介图I是pYLTmAX和pYLTmAXMnn4构建体的示意图。图2 是描述 MTLY60 A ochl (Mnn4 的 I 个野生型拷贝)、MTLY60 A ochl+Hp4dMnn4(1WT+Mnn4的I个额外拷贝)和MTLY60 A ochl+Hp4dMnn4+TEFMnn4的糖分析的一系列electroferogram。P表不单憐酸化峰。PP表不二憐酸化峰，而Man8表不Man8GlcNAc2峰。图3是哺乳动物和酵母的聚糖磷酸化通路的示意图。哺乳动物的聚糖磷酸化通路涉及由GlcNAc磷酸转移酶催化向Man8GlcNAc2聚糖添加磷酸化-GlcNAc,然后通过剥离酶(uncovering enzyme)脱帽GlcNAc暴露磷酸。相反，酵母的聚糖磷酸化涉及向Man8GlcNAc2聚糖添加磷酸-甘露糖，但不存在内源性的酶脱帽甘露糖来暴露磷酸。
图4是描述源自菌株MTLY60 A ochl+Hp4dMnn4+TEFMnn4的N聚糖的一系列electroferogram,所述菌株用C. celIulans培养基的上清液处理了不同的时间段(7hr、8hr或过夜(ON))。图5是描述源自MNN4过表达菌株的N聚糖的一系列electroferogram,所述菌株用C. cellulans上清液(SN)以及有或无磷酸酶(CIP)抑制剂处理过。图6是在指定的丽的洗脱级分的吸光值单位(mAU)的图。每个洗脱级分含"500u I。图7是在硅胶凝胶过滤(将250 ill各级分D0C/TCA沉淀)的洗脱级分电泳后的SDS聚丙烯酰胺凝胶的展示。将框住的条带切出，使用串联质谱(MS/MS)进行肽质量指纹识别和重新测序。图8A是编码CcManl (S卩，C. Cellulans的甘露糖苷酶候选物)的核苷酸序列(SEQID N0:6)(在重叠群1003)，CcManl是在MS/MS重新测序中鉴别出的。图8B是CcMan I的氨基酸序列(SEQ ID NO: 7)，包括信号序列(粗体)。没有信号肽的CcMan I多肽的预测分子量是 92. 6kDa。图9A是编码CcMan2的核苷酸序列(SEQ ID NO:8)(在重叠群774)，图9B是包括信号序列(粗体)的CcMan 2的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。没有信号肽的CcMan 2多肽的预测分子量是121. 6kDa。
图10A是编码CcMan3的核苷酸序列(SEQ ID NO: 10)(在重叠群774)，图10B是包括信号序列(粗体)的CcMan 3的氨基酸序列(SEQ ID NO: 11)。没有信号肽的CcMan 3多肽的预测分子量是116kDa。图IlA是编码CcMan4的核苷酸序列(SEQ ID NO: 12)(在重叠群1237)，图IlB是包括信号序列(粗体M^CcMan 4的氨基酸序列(SEQ ID NO: 13)。没有信号肽的CcMan 4多肽的预测分子量是184kDa。图12A是编码CcMan5的核苷酸序列(SEQ ID NO: 14)(在重叠群896)，图12B是包括信号序列(粗体)的CcMan5的氨基酸序列(SEQ ID NO: 15)，图12C是不包括信号序列的CcMan5的氨基酸序列(SEQ ID N0:50)。没有信号肽的CcMan 5多肽的预测分子量是173kDa0
图13含有用于表达CcManl-5的表达质粒的实例，所述表达是在E. coli的细胞周质中(pET25-Man )、作为分泌蛋白在解脂耶氏酵母中(pYLPSecCcManI_5 )、作为靶向解脂耶氏酵母的分泌通路的蛋白质、被标记于N端(pYLPNtCcManl-5)或被标记于C端(pYLPCtCcManl-5)。图14是用于在E. coli中表达的密码子优化过的CcManl的核苷酸序列(SEQ IDNO:16)。图15是用于在E. coli中表达的密码子优化过的CcMan2的核苷酸序列(SEQ IDNO:17)。图16是用于在E. coli中表达的密码子优化过的CcMan3的核苷酸序列(SEQ IDNO:18)。
图17是用于在E. coli中表达的密码子优化过的CcMan4的核苷酸序列(SEQ IDNO:19)。图18是用于在E. coli中表达的密码子优化过的CcMan5的核苷酸序列(SEQ IDN0:20)。图19是pLSAH36和pLSH36载体的示意图，和用于将C.cellulans基因导入载体的克隆策略。图20是描述表达CcMan4和CcMan5的E. coli细胞的细胞周质级分的分析的一系列electroferogram。分析是使用DNA测序仪辅助的、突光团辅助的碳水化合物电泳(DSA-FACE)来实施的。第I和第2道分别代表右旋糖梯带和来自RNaseB的糖。第3道是未处理过的Mnn4糖，“P”对应单甘露糖磷酸化的Man8GlcNAc2峰，“PP”对应双甘露糖磷酸化的Man8GlcNAc2峰,儿“Man8”对应Man8GlcNAc2峰。4至9道是用Mnn4聚糖与标出的细胞周质孵育所获得的结果，有或无后续的胎牛肠磷酸酶(CIP)消化。图 21 是 Zhu 等人，Nat. Chem. Biol.，6 (2) : 125-32. Epub 2009 Dec 27 (2010)描述的 CcMan4 (1759AA)和 CcMan5 (1650AA)与 Bt3990 (744AA)和 Bt2199 (739AA)甘露糖苷酶的示意性比对。图22是描述从表达的E. coli细胞中获得的CcMan4和CcMan5酶分析的一系列electroferogram。分析是使用DSA-FACE实施的，利用过表达MNN4的菌株来源的聚糖作为底物(被称为MNN4聚糖或MNN4糖)。第I道代表右旋糖梯带，第2道代表未处理过的Mnn4糖。在第3至第6道中，糖分别与以下孵育不诱导的或在18°C用IPTG诱导过夜的CcMan4domain细胞周质级分,不诱导的或在18°C用IPTG诱导过夜的CcMan5domain细胞周质级分。最后一道代表来自RNaseB的糖。图23是CcManSp774的彩带状示意图。CcManS^74由N端￠-夹心结构域(8-271位残基；浅灰色)、a-螺旋接头(272-290位残基；黑色)和(a a )6桶状结构域(291-771位残基；深灰色)组成。催化性Ca2+显示为球状。图24是CcManSh774蛋白质骨架的彩带状示意图，其中骨架的侧链排列出以竖条表示的底物结合位点。碳、氧和氮原子分别着色为浅灰色、灰色和深灰色。催化中心中的Ca2+离子和水Wl、W2、W3和W4显示为球状。图25是CcManSh774蛋白质骨架的彩带状示意图，其中骨架的侧链排列出以竖条表示的底物结合位点和甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖(标记为Man-P-Man)的建模位置。碳、氧和氮原子分别着色为浅灰色、灰色和深灰色。催化中心中的Ca2+离子和水Wl、W2、W3和W4显示为球状(为了比较，仍然显示了将被底物02和03羟基取代的W2和W3的位置)。黄色、红色和黑色虚线分别表示含Ca2+的配位键、含假设的亲核水(W4)的H键和含-I位甘露糖和磷酸的H键。-I位甘露糖建模为其基态的椅式构像。在催化过程中，它的02羟基将在Ca2+离子的赤道配位平面中占据比W2更近的位置，从而导致甘露糖-I环变形为半椅式构像，促进亲核水(W4)对Cl碳(箭头)的线性攻击。图26A是编码半乳糖苷酶A的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列，含粗体的lip2前序列和下划线的Myc His标签(SEQ ID N0:22)。图26B是a -半乳糖苷酶A的氨基酸序列，含粗体的lip2前序列和下划线的Myc His标签(SEQ ID N0:23)。图27A是人a葡萄糖苷酶(GAA)的密码子优化的核苷酸序列，含粗体的lip2前序列(SEQ ID NO: 24)。图27B是人GAA的氨基酸序列，含粗体的Iip2前序列(SEQ ID NO: 25)，其中*表示终止密码子。图28是用于克隆huGAA的解脂耶氏酵母表达载体的示意图。图29是描述用源自E. coli细胞的细胞周质级分的CcMan5处理huGAA的分析的一系列electroferogram。分析是使用DSA-FACE实施的。图30是对CcMan5的最小催化中心的描述。用圆括号给出了 SEQ ID NO:50中的等价残基的编号。I Q(Q536) ；2 N/D-E/Q(N588-Q589) ；3 D/E(D355) ；4 R(R405) ；5 D/E-X-D/E(D660-X-D662) ；6 :G_G (G71-G72);和 7 T/S/G(T626)。图31是使用MUSCLE (通过对数预期的多序列比较)，对CcMan5的氨基酸序列(SEQ ID NO:50, SEQ ID NO: 15所述氨基酸序列没有信号肽)和它的10个同源物的比对。NP_630514 链霉菌属，SEQ ID NO:26 ;ZP_02866543 梭菌属(Clostridium)，SEQ IDN0:27 ;NP_812442 拟杆菌属(Bacteroides)，SEQ ID NO:28 ;YP_003584502 王祖农菌属(Zunongwangia), SEQ ID NO: 29 ;YP_003120664 噬几丁质菌属(Chitinophaga)，SEQ IDNO:30 ;AAK22560 柄杆菌属(Caulobacter)，SEQ ID NO:31 ;ACL94075 柄杆菌属，SEQ IDNO: 32 ;ACT03290 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，SEQ ID NO:33 ;ACU59240 噬几丁质菌属，SEQ ID N0:34 ;ACU05553 土地杆菌属(Pedobacter)，SEQ ID N0:35。图32是使用MUSCLE对CcMan5的氨基酸序列(SEQ ID NO:50)和它的19个同源物的比对。链霉菌属 NP_630514，SEQ ID NO:26 ;链霉菌属 ZP_02866543，SEQ ID NO:36,ZP_06527366 链霉菌属，SEQ ID NO:37 ;YP_003013376 类芽孢杆菌属，SEQ ID NO:38 ；NP_812442拟杆菌属，SEQ ID N0:28 ;ZP_04848482拟杆菌属，SEQ ID N0:39 ;ZP_03677957拟杆菌属，SEQ ID NO:40 ;YP_003584502王祖农菌属，SEQ ID NO: 29 ;ZP_01061975列文虎克菌属(Leeuwenhoekiella), SEQ ID NO:41 ;ZP_07083984 鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium),SEQ ID N0:42 ;YP_003120664 噬几丁质菌属，SEQ ID NO:30 ;ZP_01885202 土地杆菌属，SEQ ID N0:43 ;ZP_02866543 梭菌属，SEQ ID NO: 27 ;XP_367221 稻瘟菌属(Magnaporthe),SEQ ID N0:44 ;ZP_07042437 拟杆菌属，SEQ ID N0:45 ;ZP_05759807 拟杆菌属，SEQ IDN0:46 ;ZP_05287524 拟杆菌属，SEQ ID NO:47 ;ZP_06076108 拟杆菌属，SEQ ID NO:48 ；YP_001302992 Parabacteroides, SEQ ID NO:49。
图33含有围绕CcManSu4的活性位点的残基的结构坐标。图34含有PDB入口 2xsg中的两个CcManSn74分子的不对称单元中的蛋白Ca原子和催化性Ca2+原子，描述了蛋白质的整体折叠。详细说明一般而言，本文件提供了水解糖蛋白上的甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接，产生具有脱帽的磷酸-6-甘露糖(M6P)残基的靶分子(例如，靶蛋白)的方法和材料。本文描述的方法和材料特别有效的用于产生治疗患有溶酶体贮积症(LSD)的患者的试剂)，LSD是一大类遗传性的代谢功能障碍，其特征是由于涉及降解作用的异化酶活性受损，储藏产物在溶酶体中累积。储藏产物的积累导致细胞功能障碍和进行性的临床表现。可以通过酶替换疗法(ERT)校正异化酶的缺陷，只要所施用的酶可以靶向到疾病细胞的溶酶体中。溶酶体酶通常是在内质网(ER)中合成的糖蛋白，通过分泌通路运输到高尔基体中，然后被募集到溶酶体。溶酶体酶向溶酶体递送的一种方式是通过阳离子依赖性(CD)的甘露糖6-磷酸受体(MPR)。M6P末端的聚糖在跨高尔基体网络(TRN)中被2种MPR识别，介导溶酶 体酶从分泌通路分选病将酶递送至溶酶体。使用本文描述的方法和材料，可以使用基于微生物的生产方法获得含脱帽M6P的聚糖的治疗性蛋白质，所述蛋白质可以利用同一 M6P依赖性通路递送至溶酶体中。因而，本文描述的方法和材料可用于制备治疗代谢功能障碍的糖蛋白，例如LSD。甘露糖苷酶本文件提供了编码能够水解寡糖上的末端甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接的甘露糖苷酶多肽分离的核酸，以及能够水解寡糖上的末端甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接的分离的甘露糖苷酶。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换的使用，指RNA和DNA，包括cDNA、基因组DNA、合成的DNA和含有核酸类似物的DNA (或RNA)。多核苷酸可以具有任何的三维结构。核酸可以是双链的或单链的(即，正义链或反义链)。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA (mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、siRNA、微RNA、核酶、cDNA、重组的多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物，以及核酸类似物。“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换的使用，意指任何肽键连接的氨基酸链，不论长度或翻译后修饰。通常，当本文描述的多肽(例如，甘露糖苷酶或具有脱掉的M6P残基的靶蛋白)按重量计构成制品中的总蛋白质的至少60%时，所述多肽是分离的，例如样品中60%的总蛋白。在一些实施方案中，本文描述的多肽由按重量计制品中至少75%、至少90%或至少99%的总蛋白构成。“分离的核酸”指与存在于天然存在的基因组中的其他核酸分子分开的核酸，包括通常在天然存在的基因组(例如，酵母基因组)中位于核酸一侧或两侧的侧翼的核酸。术语“分离的”在本文中涉及核酸时，还包括任何非天然存在的核酸序列，因为此类非天然存在的序列不可见于自然界，且在天然存在的基因组中没有直接连续的序列。分离的核酸可以是例如DNA分子，只要去除或缺少了在紧靠天然存在的基因组中的DNA分子侧翼通常可见的一种核酸序列。因而，分离的核酸包括但不限于作为独立于其他序列的分隔的分子存在的DNA分子(例如，化学合成的核酸，或由PCR或限制性内切核酸酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)，以及整合到载体、自主复制的质粒、病毒(例如，任何的副粘病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或肝病毒)中或整合到原核细胞或真核细胞的基因组DNA中的DNA。此外，分离的核酸可以包括改造过的核酸，例如部分是杂合体或融合核酸的DNA分子。在例如cDNA文库或基因组文库中，或者含有基因组DNA限制性消化的凝胶切片中，与数百至数百万种其他核酸共存的核酸不被认为是分离的核酸。术语“外源性”在本文中涉及核酸和特定的宿主细胞时，指在自然界中可发现的特定细胞中不存在(且不能获得)的任何核酸。因而，非天然存在的的核酸一旦被导入宿主细胞中，则被认为是对宿主细胞外源性的。重要的是，应注意非天然存在的核酸可以含有自然界中发现的核酸序列的核酸子序列或片段，只要所述核酸作为整体不存在于自然界中。例如，表达载体中的含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，因而一旦导入宿主细胞中，对宿主细胞就是外源性的，因为所述核酸分子作为整体(基因组DNA加载体DNA)不存在于自然界。因而，任何作为整体不存在于自然界中的载体、自主复制的质粒或病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒或肝病毒)都被认为是非天然存在的核酸。由此可见，通过PCR或限制性内切核酸酶处理产生的基因组DNA片段以及cDNA被认为是非天然存在的核酸，因为它们作为分隔的分子存在，不可见于自然界。还由此可见，任何含有启动子序列和多肽编码序列(例如，cDNA或基因组DNA)处于自然界中不可见的排列的核酸是非天然存在的核酸。天然存在的核酸对特定的细胞而言可以是外源性的。例如，从酵母X的细胞中分离的完整染色体对于酵母y的细胞是外源性的核酸，只要所述染色体被导入酵母细胞中。 编码甘露糖苷酶的核酸可以与SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14所述的核苷酸序列至少70%序列同一性(例如，至少80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%或100%序列同一性)。在一些实施方案中，本文描述的核酸可以编码与SEQ ID NOs :7，9，11，13，15，50所述的氨基酸序列具有至少70% (例如，至少75，80，85，90，95，99或100%)同一性的甘露糖苷酶多肽。例如，核酸可以编码与SEQ IDNO: 15或SEQ ID NO: 50所述的氨基酸序列，或其一部分具有至少90%(例如，至少95或98%)同一性的甘露糖苷酶。例如，核酸可以编码与SEQ ID NO: 50的I至774位残基具有至少90%同一性的甘露糖苷酶。如下确定特定的氨基酸序列和SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ IDNO: 11，SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15或SEQ ID N0:50所述氨基酸序列之间的百分比同一性。首先，使用含有 BLASTP 2.0. 14 版的单机版 BLASTZ 的 BLAST 2 Sequences(B12seq)程序比对氨基酸序列。该单机版BLASTZ可自Fish & Richardson的网站(例如,www. fr. com/blast/)或美国政府的国立生物技术信息中心的网站(www. ncbi. nlm. nih. rov)获得。解释如何使用B12seq程序的说明可见于BLASTZ所附的readme文件中。B12seq在两条氨基酸序列之间使用BLASTP算法实施比较。为了比较两条氨基酸序列，B12seq的选项设置如下_i设为含有待比较的第一氨基酸序列的文件(例如，C:\seql. txt) ；-j设为含有待比较的第二氨基酸序列的文件(例如，C:\seq2. txt)；-p设为blastp ；-o设为任何理想的文件名(例如，C: \output. txt);所有其他选项都保持原有的默认设置。例如，可以使用下列命令产生含有两条氨基酸下列之间的比较的输出文件C: \B12seq - i c:\seql. txt-j c:\seq2.txt-pblastp -o c:\output. txt。如果两条比较序列具有同源性,则设计的输出文件将展现比对序列的同源性区域。如果两条比较序列没有同源性，则设计的输出文件将不展现比对的序列。对于除使用blastn以外，对核酸序列遵循相似的程序。一经比对，通过计数两条序列中都存在的相同氨基酸残基的位置数，来确定匹配数。通过将匹配数除以全长甘露糖苷酶多肽氨基酸序列的长度，再将获得的值乘以100，确定百分比同一性。例如，当与SEQ ID NO:7所述序列比对时具有700个匹配的氨基酸序列与 SEQ ID N0:7 所述序列 77. 8% 相同(S卩，700 + 900*100=77. 8)。应注意，百分比同一性值四舍五入至最接近的十分之几。例如，78. 11,78. 12、78. 13 和 78. 14 四舍五入至 78. 1，而 78. 15,78. 16,78. 17,78. 18 和 78. 19 四舍五入至 78. 2。
还应注意，长度值总是整数。应理解，多个核酸可以编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性是本领域普遍已知的；即，对于许多氨基酸，有一个以上的核苷酸三联体作为所述氨基酸的密码子。例如，可以修饰给定的甘露糖苷酶多肽的编码序列中的密码子，使得获得在特定物种(例如，细菌或真菌)中的最佳表达。例如，可以将SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:8,SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14所述的核酸密码子优化用于E. coli表达，如图14-18所述(参见 SEQ ID NOs: 16-20)。还可以使用杂交来评估两条核酸序列之间的同源性。本文中描述的核酸序列或其片段可用作根据标准杂交技术的杂交探针。目标探针(例如，含有一部分CcMan5核苷酸序 列的探针)与来自测试来源的DNA或RNA的杂交是测试来源中存在与探针对应的DNA或RNA(例如，CcMan5核苷酸序列)的指针。杂交条件是本领域技术人员已知的,可见于CurrentProtocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. , 6. 3. 1-6. 3. 6, 1991 中。中等的杂交条件定义为与以下条件等价的条件，即，30°C下在2X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，再在50°C下在IX SSC,0. 1% SDS中洗涤。高严谨度的条件定义为与以下条件等价的条件，即，45°C下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，再在65°C下在0. 2X SSC, 0. 1% SDS中洗漆。还可以基于本文描述的一部分C.cellulans甘露糖苷酶的三维结构(SEQ IDNO: 50的1-774位残基，也称为CcManSh774),来鉴别能够杂交寡糖上的末端甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接的甘露糖苷酶多肽。可以通过例如X射线衍射CcManSh774的晶体，确定三维结构。CcManSp774的结构坐标(例如,储藏在Protein Data Bank (世界范围的网站F1DB.org中的PDB ID No. 2xs下)中的CcManSn74的坐标)，图33中所述关于CcMan5的催化中心的坐标，或者图34中所述关于PDB入口 2xsg中的两个CcManSn74分子的不对称单元中的蛋白Ca原子和催化性Ca2+原子的坐标，可用于多种用途，包括但不限于表征能够水解寡糖上的末端甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接的甘露糖苷酶的三维结构，以及可视化、鉴别和表征这样的甘露糖苷酶区域，所述区域参与接受甘露糖-6-磷酸a，I-甘露糖(后文中称为Man-P-Man)作为底物并赋予所述酶水解Man-P-Man产生末端磷酸_6_甘露糖的能力。“结构坐标”是与分子或分子复合物中原子相对于其他原子的空间关系对应的笛卡尔坐标。结构坐标可使用X射线衍射技术或NMR技术获得，或者可以使用分子取代分析或同源性建模推断。各种软件程序允许图示结构坐标组，获得分子或分子复合物的三维展示。可以通过数学操作修饰由图33或图34提供的原始组得到本文描述的结构的结构坐标，例如通过倒置或整体加入或减去。由此，应认识到本发明的结构坐标是相对的，不以任何方式受图33或图34的实际x、y、z坐标的具体限制。如实施例8所述,CcManSp774的结构由两个结构域组成,N端的P -夹心结构域(SEQID NO: 50的8-271位残基)和C端的(a a )6桶状结构域(SEQ ID NO: 50的291-771位残基)，通过a-螺旋接头(SEQ ID NO: 50的272-290位残基)连接。两个结构域之间的界面产生了携带保守的催化性Ca2+离子的空洞形状，并产生-I底物结合位点(命名如Davies等人，Biochem. J. 321:557-9(1997)所述)和催化中心的形状。SEQ ID NO:50 的 22、25、71、72、195、196、354、405、535、536、588、589、626、658、660 和 662 位残基形成底物结合位点。可以使用I3DB ID No. 2xs的结构坐标或图33所示的摘要(包括CcManS1I74的活性位点周围的残基)或图34所示的摘要(包括PDB入口 2xsg中的两个CcMan51-774分子的不对称单元中的蛋白Ca原子和催化性Ca2+原子)，部分或全部的表征CcManSn74的三维结构，并描述蛋白质的整体折叠。例如，可以通过根据I3DB ID No. 2xs的7-771位氨基酸残基的结构坐标，土不超过2人的所述氨基酸的保守性骨架原子的均方根误差，来表征CcManSu4的三维结构。在一些实施方案中，CcManSp774的三维结构包括根据TOB ID No. 2xs的氨基酸的全部结构坐标，土不超过2A的所述氨基酸的保守性骨架原子的均方根误差(例如，不超过1.5 A、1.0A或0.5人)。在本文中，“均方根误差”是偏离均值的方差平方的算数平均值的均方根，是表示本文所述结构坐标的偏差或方差的方式。本公开内容包括所有包含所示氨基酸残基的保守性取代的实施方案，所述保守性取代导致落入所述均方根误差范围内的相同结构坐标。、本文提供的结构坐标可用于表征甘露糖苷酶多肽的三维结构。根据此类结构，可以将底物结合位点例如通过计算机可视化、鉴别和表征，基于分子的表面结构、表面电荷、位阻排列、反应氨基酸的存在、疏水性或亲水性的区域等。为了使用本文所述结构产生的结构坐标,如图33、图34或I3DB ID No. 2xs所述，可以将相关的坐标展示为或转化为三维形状或图像呈现。能够从结构坐标组产生分子或其部分的三维图像呈现的软件程序是可商购的。可商购的软件程序实例包括但不限于以下的GRID (Oxford University,Oxford,UK) ；MCSS(Molecular Simulations,San Diego,CA) ；AUT0D0CK(Scripps ResearchInstitute, La Jolla, CA) ；D0CK(University of California, San Francisco, CA)；Flo99 (Thistlesoft, Morris Township, NJ) ；Ludi(Molecular Simulations, San Diego,CA) ；QUANTA(Molecular Simulations,San Diego,CA) ；Insight(Molecular Simulations,San Diego, CA) ；SYBYL(TRIPOS, Inc.，St. Louis. MO)；和 LEAPFROG(TRIP0S，Inc.，St. Louis, MO) o本文描述的结构坐标可以用于标准的同源性建模技术，从而确定分子或分子复合物的未知三维结构。同源性建模涉及使用一个或多个相关蛋白质分子、分子复合物或其部分的结构坐标，构建未知的结构模型。同源性建模可以通过拟合蛋白质中被解析的三维结构与已知分子的同源性结构元件的三维结构中共同的或同源的蛋白质部分来进行，尤其是使用由本文的图33和34提供的相关(S卩，同源的)结构坐标。可以使用氨基酸序列同一性、同源的次级结构元件和/或同源的三级折叠，来确定同源性。同源性建模可以包括用已解析的相关结构替代氨基酸(或其他元件)，重建部分或全部的三维结构。相应的，可以使用本文描述的CcManSp774的三维结构生成未知分子的三维结构，并使用多种本领域普遍已知的技术细化。基于本文描述的三维结构，可以在CcManSn74或其他甘露糖苷酶的一些原子或侧基中产生取代，从而改善或修饰它的选择性。例如，CcMan5在536和588位含有非酸性残基，允许甘露糖苷酶的磷酸连接耐受在Man-P-Man底物中的异头氧。由此，可以将其他甘露糖苷酶中的相应残基变为非酸性残基，增加甘露糖苷酶接受Man-P-Man底物的能力。可以通过分析核苷酸和多肽序列比对，鉴别适用于本文中的其他甘露糖苷酶多肽候选物。例如，在核苷酸或多肽序列的数据库中实施搜索，可以鉴别甘露糖苷酶多肽的同源物和/或类似物。序列分析可以涉及使用已知的甘露糖苷酶氨基酸序列对非冗余数据库进行BLAST、相互Reciprocal或PSI-BLAST分析。数据库中那些具有大于40%序列同一性的多肽可以鉴别为进一步评估作为甘露糖苷酶多肽适用的候选物。氨基酸序列相似性允许保守型氨基酸取代，例如用另一个疏水性残基取代一个疏水性残基，或者用另一个极性残基取代一个极性残基。需要时，可以人工检查此类候选物，从而缩小进一步评估的候选物数量。可以通过选择表现出具有这样的结构域的候选物，来实施人工检查，其中所述结构域被怀疑存在于能够水解末端甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接的甘露糖苷酶中，例如一个或多个(例如，1、2、3、4或更多个)保守的结构域或功能区(例如，底物结合空穴)。此类结构域可包括富含甘氨酸的基序GVGXXGXGG，其中X是Gly、Ser、Thr、Val、Ala、Cys或Gln (或其他具有小侧链的氨基酸)。该基序可见于SEQ ID NO:50的69-77位残基。该区域形成环，为_1甘露糖和酶的活性位点中的磷酸-结合子位点提供了关键性的氢键。保守基序的另一个实例包括VEXE基序，其中Arg(R)与-I环，并可能与+1环形成氢键，Glu (E)处于与该R残基的盐键桥中，可能使该基序成形；而X是Trp或除Pro以外的任何氨基酸。该基序可见于SEQ ID NO:50的404-407位残基。合适的基序还可以是X1YQGX2基序,其中X1是Leu、Ile、Val、Ala、Phe、Tyr或Met,X2是Thr、Ser或Asn。该基序可见于SEQ ID NO: 50的534-538位残基。该基序中的Gln (Q)作为E是重要的，存在不具有水解寡糖上的末端甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接的能力的甘露糖苷酶中。该基序中的Tyr(Y)被认为对+1位点形成而言是重要的。此外，由SEQ ID N0:50 的22、25、71、72、195、196、354、405、535、536、588、589、626、658,660和662位残基定义的区域形成了 CcMan5的底物结合空穴。作为最低需求，G71、G72、D355、R405、Q536、N588、Q589、T626、D660、D662 形成了催化中心，其中 N588、Q589 和D660参与协调催化性Ca2+离子，D662和D660参与活化亲核的水，Q536稳定跃迁状态过程中的异头氧，而G71、G71、D355、R405和T626参与-I位点的底物结合。参见图30关于最小催化中心的展示。由此，当位于最小的催化中心(例如，图30所述)的氨基酸侧链中的原子的三维蛋白坐标落入距图33中等价原子的坐标1.5 A偏差以内时，可以选择甘露糖苷酶作为能够水解末端甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接的候选甘露糖苷酶。保守基序还可以是在蛋白质的N端结构域中的⑶XGN基序，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。该基序可见于SEQ ID NO: 50的21-25位残基，形成酶的部分底物结合口袋，如图24所示。特别的是，D和N的侧链框出了底物结合空穴，并可能形成结合+1甘露糖的备选子口袋。如实施例14所述，在多肽序列的数据库中实施搜索在下了生物中鉴别出CcMan5的同源物天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor) (GenBank 登录号NP_630514)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans) (GenBank 登录号ZP_05522540)、变铅青链霉菌(GenBank 登录号:ZP_06527366)、螺状梭菌(Clostridium spiroforme) (GenBank登录号ZP_02866543)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron) (GenBank 登录号NP_812442)、Zunongwangia profunda (GenBank 登录号YP_003584502)；Chitinophaga pinensis (GenBank 登录号YP_003120664);类芽抱杆菌属(GenBank 登录号YP_003013376);拟杆菌属(GenBank 登录号ZP_04848482) ；Bacteroidescellulosilyticus (GenBank 登录号ZP_03677957) ；Leeuwenhoekiella blandensis(GenBank 登录号ZP_01061975) ；Sphingobacterium spiritivorum (GenBank 登录号ZP_07083984)和土地杆菌属(GenBank登录号ZP_01885202)。天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌中的甘露糖苷酶是相似的(与CcMan5 GH92结构域66%序列同一性，在765个BLASTP比对的残基中有501个相同)，不仅在上述基序而且在三维结构的许多环中。可以通过标准技术生产编码甘露糖苷酶多肽的分离的核酸分子。例如，可以使用聚合酶连锁反应(PCR)技术获得含有本文所述核苷酸序列的分离的核酸。PCR可用于从DNA以及RNA中扩增特定的序列，包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。一般而言，来自目标区域末端或远端的序列信息被用于设计与待扩增的模板的反向链序列相同或相似的寡核苷酸引物。还可以利用多种PCR对策，其中可以位点特异性的核苷酸序列修饰导入模板核酸中。还可以化学合成分离的核酸，不论是作为单个核酸分子(例如，使用phosphoramidite技术按3’至5’方向用自动化DNA合成)或作为一系列的寡核苷酸。例如，可以合成含有所需序列的一个或多个成对的长寡核苷酸(例如，>100个核苷酸)，其中每一对含有互补的短片段(例如，约15个核苷酸)，使得将寡核苷酸对退火时形成二聚体。使 用DNA聚合酶延伸寡核苷酸，每个寡核苷酸对获得单个双链核酸分子，之后可连接成载体。本发明的分离的核酸还可以通过诱变例如天然存在的DNA而获得。本文件还提供了本文描述的甘露糖苷酶的(i)生物学活性的变体和(ii)生物学活性的片段或其生物学活性的变体。相对于SEQ ID NOs :7、9、11、13、15或50所述的序列，甘露糖苷酶的生物学活性的变体可以含有添加、删除或取代。含取代的蛋白一般具有不超过50个(例如，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40或50个)保守氨基酸取代。保守取代是用具有相似特征的另一个氨基酸取代一个氨基酸。保守取代包括以下组中的取代缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。非极性的疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上述极性、碱性或酸性组中的一个成员被另一个同组成员的任意取代都可视为保守取代。相反，非保守取代是用具有不相似特征的另一个氨基酸取代一个氨基酸。图31和32所述的序列比对提供了进行多个氨基酸取代的实例。缺失变体可以缺少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20个氨基酸片段(2个或多个氨基酸)或非连续的单个氨基酸。添加(添加变体)包括这样的融合蛋白，所述融合蛋白含有(a) SEQID NOs :7、9、11、13或15所述甘露糖苷酶，或其片段；和(b)内部或末端(C或N)的不相关或异源的氨基酸序列。在此类融合蛋白的语境中，术语“异源的氨基酸序列”指除(a)以外的氨基酸序列。异源序列可以是例如用于纯化重组蛋白的序列(例如，FLAG、多聚组氨酸(例如，六组氨酸)、gluttanin (HA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或麦芽糖结合蛋白(MBP))。异源序列还可以是用作诊断的蛋白或可检测的标志物，例如，荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。在一些实施方案中，融合蛋白含有来自另一种蛋白质的信号序列。在某些宿主细胞(例如，酵母宿主细胞)中，可以通过使用异源信号序列增加靶蛋白的表达和/或分泌。在一些实施方案中，融合蛋白可以含有载体(例如，KLH，可用于例如引发免疫应答产生抗体)，或者内质网或高尔基体细胞器的滞留信号。异源序列的长度可以改变，在一些情况下可以是比异源序列连接的全长靶蛋白更长的序列。甘露糖苷酶的生物学活性片段或生物学活性变体具有野生型、全长、成熟蛋白质的至少 40% (例如，至少 50% ；60% ；70% ；75% ；80% ；85% ；90% ；95% ；97% ；98% ；99% ；99. 5% 或100%或甚至更高的)甘露糖苷酶活性(例如，脱帽M6P残基)。例如，甘露糖苷酶的生物学活性片段可含有SEQ ID NO:50的1-774位残基。本文描述的甘露糖苷酶可用于生产具有脱帽末端磷酸-6-甘露糖(M6P)残基的分子(例如，靶蛋白)。方法可以在体外或体内实施。脱帽(uncapping)M6P残基的体外方法 本文描述的甘露糖苷酶可以是重组生产的，用于在体外脱帽/打开(uncapping)寡糖上的M6P残基。为了重组生产甘露糖苷酶，使用含有与编码甘露糖苷酶多肽的核酸有效连接的启动子的载体。在本文中，“启动子”指能够使基因转录的DNA序列。启动子被RNA聚合酶识别，之后起始转录。因而，启动子含有被RNA聚合酶直接结合或涉及募集RNA聚合酶的DNA序列。启动子序列还可以包括“增强子区”，这是一个或多个可以结合蛋白质(即，反式作用因子，大部分类似转录因子)来增强基因簇中的基因转录水平(由此得名)的DNA区域。增强子通常位于编码区的5’区，也可以与启动子序列分隔，例如可以位于基因的内含子区域或基因编码区的3’。在本文中，“有效连接”意指整合到遗传构建体(例如，载体)中，使得表达控制序列有效的控制目标编码序列的表达。可以将表达载体导入宿主细胞(例如，通过转化或转染)中，用于表达编码的多肽，之后可以纯化所述多肽。可用于小规模或大规模生产甘露糖苷酶多肽的表达系统包括但不限于微生物，例如用含有核酸分子的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，E. coli)，和用含有核酸分子的重组真菌表达载体转化的真菌(例如，酿酒酵母、解脂耶氏酵母、Arxula adeninivorans、毕赤酵母、多形汉逊酵母或曲霉)。有效的表达系统还包括用含有核酸分子的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统，和用含有核酸分子的重组病毒表达载体(例如，烟草花叶病毒)感染的或用重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞细胞。还可以使用哺乳动物表达系统生产甘露糖苷酶多肽，所述表达系统包括锚定了重组表达构建体的细胞(例如，永生化细胞系，如COS细胞、中华田鼠卵巢细胞、Hela细胞、人胎肾293细胞和3T3 LI细胞)，所述构建体沿着本文描述的核酸含有源自哺乳动物细胞基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或来自别哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子和巨细胞病毒启动子)的启动子。通常，用帮助纯化蛋白质的异源氨基酸序列标记重组的甘露糖苷酶多肽，例如FLAG、多聚组氨酸(例如，六组氨酸)、gluttanin (HA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或麦芽糖结合蛋白(MBP)。纯化蛋白质的其他方法包括层析技术，例如离子交换层析、疏水和逆向层析、尺寸排阻层析、亲和层析、疏水电荷诱导层析等(参见例如，Scopes, ProteinPurification !Principles and Practice,第 3 版，Springer-Verlag, New York(1993)；Burton 和 Harding, J. Chromatogr. A 814:71-81(1998))。为了在体内生产具有脱帽末端M6P的分子，在合适的条件下将含有甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接的靶分子与纯化的甘露糖苷酶或含有重组生产的甘露糖苷酶的细胞裂解物接触。细胞裂解物可来自遗传改造过的细胞，包括真菌细胞、植物细胞或动物细胞。动物细胞的非限制性实例包括线虫、昆虫、植物、鸟、爬行动物和哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、田鼠、沙鼠、狗、猫、山羊、猪、牛、马、鲸、猴或人。在将靶分子(例如寡糖或糖蛋白)与纯化的甘露糖苷酶或含有重组生产的甘露糖苷酶的细胞裂解物接触的基础上，甘露糖苷酶水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接，并产生具有一个或多个脱帽末端M6P残基的靶分子。实施例2中描述的方法可用于确定是否已经脱帽了末端M6P残基。在通过甘露糖苷酶加工后，可以分离已脱帽末端M6P残基的靶分子。用于获得细胞裂解物并保持裂解物中的甘露糖苷酶的活性或完整性的合适方法可以包括使用恰当的缓冲液和/或抑制剂，包括保持或使细胞裂解物中的N糖基化活性变化最小化的核酸酶、蛋白酶和磷酸酶抑制剂。此类抑制剂包括例如螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙二醇二(P-氨乙基乙酯)N，N，NI, NI-四乙酸(EGTA)，蛋白酶抑制剂例如苯甲基磺酸氟化物(PMSF)、aprotinin、leupeptin、antipain等,磷酸酶抑制剂如磷酸盐、氟化钠、钒酸盐等。获得含有酶活性的裂解物的恰当缓冲液和条件描述在例如Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47), John Wiley & Sons, NewYork (1999) ；Harlow 和 Lane, Antibodies :A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory Press(1988) ;Harlow和Lane, Using Antibodies A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Press (1999) ；Tietz Textbook of Clinical Chemistry,第 3 版，Burtis和 Ashwood 编著，W. B. Saunders, Philadelphia, (1999)中。需要时，可以进一步加工细胞裂解物，消除或最小化存在的干扰物质。需要时，可以通过多种本领域技术人员普遍已知的方法将细胞裂解物分级，包括亚细胞分级，和层析技术，例如离子交换层析、疏水和逆向层析、尺寸排阻层析、亲和层析、疏水电荷诱导层析
坐寸o在一些实施方案中，可以制备细胞的细胞器仍然完整和/或有功能的细胞裂解物。例如，含有一个或多个完整的粗面内质网、完整的光面内质网或完整的高尔基体配置的裂解物。制备含有完整的细胞器和用于测试细胞器功能性的裂解物的合适方法描述在例如Moreau 等人，(1991) J. Biol. Chem. 266 (7) : 4329-4333 ;Moreau 等人，(1991) J. Biol.Chem. 266(7) :4322-4328 ;Rexach等人，(1991) J. Cell Biol. 114(2) :219-229 JPPaulik等人，(1999) Arch. Biochem. Biophys. 367 (2) : 265-273 中。靶分子在本文中指任何含有末端甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接的分子，或者当在真菌来源的细胞中表达时，含有甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接的任何分子。合适的革巴分子包括病原体蛋白，例如破伤风类毒素或白喉类毒素；病毒表面蛋白，例如巨细胞病毒(CMV)糖蛋白B、H和gCIII，人免疫缺陷病毒(HIV-I)衣壳糖蛋白，劳氏肉瘤病毒(RSV)衣壳糖蛋白，单纯疱疹病毒(HSV)衣壳糖蛋白，Epstein Barr病毒(EBV)衣壳糖蛋白，varicella-zoster病毒(VZV)衣壳糖蛋白，人乳头瘤病毒(HPV)衣壳糖蛋白，流感病毒糖蛋白和肝炎家族表面抗原；溶酶体蛋白(例如，酸性a葡萄糖苷酶、a半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、脑苷脂酶或半乳糖脑苷脂酶)；胰岛素；胰高血糖素；生长因子；细胞因子；趋化因子；和抗体或其片段。生长因子包括例如血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、神经生长因子(NGF)、神经营养素、血小板来源的生长因子(PDGF)、红细胞生成素(EPO)、Thrombopoietin (TPO),Myostatin (⑶F-8)、生长分化因子-9 (⑶F9)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF2)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)。细胞因子包括例如白介素，如 IL-I 至 IL-33 (例如，IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13 或 IL-15)。趋化因子包括例如 1-309、TCA-3、MCP-UMIP-I a、MIP-I^ 、RANTES、C10、MRP-2、MARC、MCP-3、MCP-2、MRP-2、CCF18、MIP-1y、Eotaxin、MCP_5、MCP-4、NCC-I、Ck ^ 10、HCC-I、Leukotactin-I、LEC, NCC-4、TARC, PARC 或 Eotaxin-2。还包括肿瘤糖蛋白(例如，肿瘤相关抗原)，例如，癌胚抗原(CEA)、人粘液素、HER-2/neu和前列腺特异性抗原(PSA) (Henderson 和 Finn, Advances in Immunology, 62, pp. 217-56 (1996) ) 在一些实施方案中，靶蛋白可以是与溶酶体贮积症相关的，所述靶蛋白包括例如酸性a葡萄糖苷酶、a半乳糖苷酶、a -L-艾杜糖苷酸酶、0 -D-半乳糖苷酶、P -葡萄糖苷酶、3 -氨基己糖苷酶、3 -D-甘露糖苷酶、a -L-岩藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、a-N乙酰氨基半乳糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、艾杜糖酸(iduronate)-2-硫酸酯酶、a -葡萄糖胺-N-乙酰转移酶、^ -D-葡萄糖酸酶、透明质酸酶、a -L-甘露糖苷酶、a -神经氨酸苷酶、磷酸转移酶、酸性脂肪酶、酸性神经酰胺酶、神经磷脂酶、硫酯酶、组织蛋 白酶K和脂蛋白脂肪酶。在一些实施方案中，靶蛋白是融合蛋白，其中靶蛋白与另一种多肽序列、或与聚合物、载体、佐剂、免疫毒素或可检测的部分(例如，荧光素、冷光素或放射性)融合。例如，靶蛋白可以与聚合物(例如，聚乙二醇)连接，增加小蛋白的分子量和/或增加循环驻留时间。脱帽M6P残基的体内方法本文描述的遗传改造过的细胞可用于生产含有脱帽M6P残基的靶分子。例如，基于细胞的方法可以包括导入遗传改造过的真菌细胞中，使得包括编码甘露糖苷酶的核酸、编码靶分子的核酸，其中细胞生产含有脱帽末端M6P残基的靶分子。在一些实施方案中，编码甘露糖苷酶和靶分子的核酸含有分泌序列，使得甘露糖苷酶和靶分子共同分泌。本文描述的遗传改造过的细胞含有编码甘露糖苷酶的核酸，可用于产生一种或多种具有脱帽末端M6P残基的靶分子。适合体内生产脱帽末端M6P残基的细胞可以是真菌来源的，包括解脂耶氏酵母、Arxula adeninivorans、甲基营养型酵母(例如，假丝酵母属、汉逊酵母属、Oogataea、毕赤酵母属或隐球酵母属的甲基营养型酵母)或者曲霉属、木霉属、链胞霉属、镰刀霉属或金孢子菌属的丝状真菌。示例性的真菌物种包括但不限于 Pichia anomala、Pichia bovis、Pichia canadensis、Pichia carsonii、Pichiafarinose、Pichia fermentans、Pichia fluxuum、Pichia membranaefaciens、Pichiamembranaefaciens、Candida valida、Candida albicans、Candida ascalaphidarum、Candida amphixiae、Candida Antarctica、Candida atlantica、Candida atmosphaerica、Candida blattae、Candida carpophila、Candida cerambycidarum、Candida chauliodes、Candida corydalis、Candida dosseyi、Candida dubliniensis、Candida ergatensis、Candida fructus、Candida glabrata、Candida fermentati、Candida guilliermondii、Candida haemulonii、Candida insectamens、Candida insectorum、Candida intermedia、Candida jeffresii、Candida kefyr、Candida krusei、Candida lusitaniae、CandidaIyxosophila^ Candida maltosa、Candida membranifaciens、Candida milleri、Candidaoleophila、 Candida oregonensis、 Candida parapsilosis、 Candida quercitrusa、Candida shehatea、Candida temnochilae、Candida tenuis、Candida tropical is、Candida tsuchiyae、Candida sino Iaborantium^ Candida so jae ^ Candida viswanathii、Candida utilis、Oogataea minuta、Pichia membranaefaciens、Pichiasilvestris^Pichia membranaefaciens、Pichia chodati、Pichia membranaefaciens、Pichiamenbranaefaciens、Pichia minuscule、Pichia pastoris、Pichia pseudopolymorpha、Pichia quercuum、Pichia robertsii、Pichia saitoi、Pichia silvestrisi、Pichiastrasburgensis、 Pichia terricola、 Pichia vanriji、 Pseudozyma Antarctica、Rhodosporidium toruloides、 Rhodotorula glutinis、 Saccharomyces bayanus、Saccharomyces bayanus、 Saccharomyces momdshuricus、 Saccharomyces uvarum、Saccharomyces bayanus、 Saccharomyces cerevisiae、 Saccharomyces bisporus、Saccharomyces chevalieri、 Saccharomyces delbrueckii、 Saccharomyces exiguous、Saccharomyces fermentati、 Saccharomyces fragilis、 Saccharomyces marxianus、Saccharomyces mellis、Saccharomyces rosei、Saccharomyces rouxii、Saccharomycesuvarum、 Saccharomyces willianus、 Saccharomycodes ludwigii、 Saccharomycopsis capsularis、Saccharomycopsis fibuligera、Saccharomycopsis fibuligera、Endomyceshordei、Endomycopsis fobuligera. Saturnispora saitoi、Schizosaccharomycesoctosporus、Schizosaccharomyces pombe、Schwanniomyces occidentalism Torulasporadelbrueckii、 Torulaspora delbrueckii、 Saccharormyces dairensis、 Torulasporadelbrueckii、 Torulaspora fermentati、 Saccharomyces fermentati、 Torulasporadelbrueckii、 Torulaspora rosei、 Saccharomyces rosei, Torulaspora delbrueckii、Saccharomyces rosei、 Torulaspora delbrueckii、 Saccharomyces delbrueckii、Torulaspora delbrueckii、 Saccharomyces delbrueckii、 Zygosaccharomycesmongolicus、Dorulaspora globosa、Debaryomyces globosus、Torulopsis globosa、Trichosporon cutaneum、 Trigonopsis variabilis、 Williopsis californica、Williopsis saturnus、Zygosaccharomyces bisporus、Zygosaccharomyces bisporus、Debaryomyces disporua.Saccharomyces bisporas、 Zygosaccharomyces bisporus、Saccharomyces bisporus、Zygosaccharomyces mellis、Zygosaccharomyces priorianus、Zygosaccharomyces rouxiim、 Zygosaccharomyces rouxii、 Zygosaccharomycesbarkeri、 Saccharomyces rouxii、 Zygosaccharomyces rouxii、 Zygosaccharomycesmajor、Saccharomyces rousii、Pichia anomala、Pichia bovis、Pichia Canadensis、Pichia carsonii、Pichia farinose、Pichia fermentans、Pichia fluxuum、Pichiamembranaefaciens、Pichia pseudopolymorpha、Pichia quercuum、Pichia robertsii、Pseudozyma Antarctica、Rhodosporidium toruloides、Rhodosporidium toruloides、Rhodotorula glutinis^Saccharomyces bayanus、Saccharomyces bayanus、Saccharomycesbisporus、 Saccharomyces cerevisiae、 Saccharomyces chevalieri、 Saccharomycesdelbrueckii、 Saccharomyces fermentati、 Saccharomyces fragilis、 Saccharomycodesludwigii、 Schizosaccharomyces pombe、 Schwanniomyces occidentalism Torulasporadelbrueckii、Torulaspora globosa、Trigonopsisvariabi I is、Williopsis californica、Williopsis saturnus、Zygosaccharomyces bisporus、Zygosaccharomyces mellis 或Zygosaccharomyces rouxii。示例性的丝状真菌包括曲霉的多个物种，包括但不限于Aspergillus caesiellus、白曲霉(Aspergillus candidus)、肉色曲霉(Aspergilluscarneus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、弯头曲霉(Aspergillus deflectus)、黄曲霉、烟曲霉、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、构巢曲霉、黑曲霉、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、米曲霉、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus )、Aspergilluspenicilloides、局限曲霉(Aspergillus restrictus)、酱油曲霉、Aspergillus sydowi>Aspergillus tamari、土曲霉(Aspergillus terreus)、焦曲霉(Aspergillus ustus)或米色曲霉(Aspergillus versicolor)。在如本文所述的遗传改造前的此类细胞可以从多个商业来源和研究资源机构中获得，例如美国典型培养物收藏中心(Rockville，MD)。靶分子包括蛋白质，例如本文所述的任何靶蛋白(见上文)。除编码甘露糖苷酶的外源性核酸外，遗传改造过的细胞可以包括一个或多个遗传修饰，例如(i)删除了编码外部链延伸(OCHl)蛋白的内源性基因；(ii)导入编码能够促进甘露糖基磷酸化的多肽的重组核酸(例如，来自解脂耶氏酵母、酿酒酵母、Ogataea minuta、毕赤酵母或白色念珠菌的MNN4多肽)，增加甘露糖残基的磷酸化；(iii)导入或拨打干扰OCHl蛋白功能性表达的RNA分子；(iv)导入编码具有N-糖基化活性的野生型(例如，内源性或外源性)蛋白质的重组核酸(即，表达具有N-糖基化活性的蛋白质)；(v)导入编码上述靶分子的重组核酸；或(V)改变一个或多个编码具有N-糖基化活性的蛋白质的内源性基因的启动子或增强子元件，从而改变其编码的蛋白质的表达。RNA分子包括例如小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA (shRNA)、反义RNA或微RNA (miRNA)。遗传改造还包括改变编码具有N-糖基化活性的蛋白质的内源性基因，产生具有添加(例如，异源序列)、删除或取代(例如，突变如点突变；保守或非保守突变)的蛋白质。突变可以是特异性导入的(例如，通过定点诱变或同源重组)或者可以是随机导入的(例如，可以化学诱变细胞，如中所述Newman和Ferro-Novick(1987)J. Cell Biol.105(4):1587)。本文所述的遗传修饰可以导致一种或多种的(i)在遗传改造过的细胞中，一种或多种活性的增加，(ii)在遗传修饰过的细胞中，一种或多种活性的减少，或(iii)在遗传修饰过的细胞中，一种或多种活性的定位或胞内分布改变。可以理解，特定活性的量的增力口 (例如，促进甘露糖基磷酸化)可能是由于过表达一种或多种能够促进甘露糖基磷酸化的蛋白质，内源性基因拷贝数的增加(例如，基因复制)，或内源性基因的启动子或增强子的改变，刺激由基因编码的蛋白质的表达增加。一种或多种特定活性的减少可能是由于过表达突变形式(例如，显性负突变形式)、导入或表达一种或多种干扰RNA分子，降低具有特定活性的蛋白质的表达，或者删除一种或多种编码具有特定活性的蛋白质的内源基因。为了通过同源重组破坏基因，可以以包括可选择的标志物的方式构建“基因替代” 载体。可选择的标志物基因可以与长度足以介导同源重组的基因部分的5’和3’端有效连接。可选择的标志物可以是任何一种补偿宿主细胞营养缺陷型的基因或者提供抗体耐受性的基因，包括URA3、LEU2和HIS3基因。其他合适的可选择的标志物包括使酵母细胞产生氯霉素抗性的CAT基因，或由于表达-半乳糖苷酶而导致蓝色克隆的IacZ基因。然后，使用本领域普遍已知的方法(见下文)，将基因替代载体的线性化DNA片段导入细胞中。可以基于选择标志物确定线性片段与基因组的整合和基因的破坏，并可以通过例如Southern印迹分析验证。可以通过例如Cre-IoxP系统(见下文)从宿主细胞的基因组中去除选择标志物。可选的，可以以包括待破坏的基因部分的方式构建基因替代载体，所述部分缺少任何内源基因启动子序列，并不编码基因编码序列或只编码基因编码序列的失活片段。“失活片段”是编码蛋白质的基因的片段，具有从全长基因编码序列产生的蛋白质的少于约10%(例如，少于约9%、少于约8%、少于约7%、少于约6%、少于约5%、少于约4%、少于约3%、少于约2%、少于约1%或0%)的活性。此类基因部分插入到载体中，插入的方式使得没有任何已知的启动子序列与基因序列有效连接，但终止密码子和转录终止序列与基因序列部分有效连接。之后，可以将该载体线性化为基因序列部分，并转化到细胞中。通过单同源重组，该线性化载体之后整合到基因的内源配对物中。表达载体可以是自主型或整合型。可以将重组核酸(例如，编码甘露糖苷酶的核酸)以表达载体的形式导入到细胞中，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒或病毒颗粒。重组核酸可以在染色体外维持，或者可以整合到酵母细胞染色体DNA中。表达载体可以忽悠选择标志物基因，所述基因编码在选择条件下细胞存活必需的蛋白质(例如，编码尿嘧啶生物合 成必需的酶的URA3，或编码色氨酸生物合成必需的酶的TRPl )，允许检测和/或选择那些被所需核酸转化的细胞(参见例如，美国专利号4，704, 362)。表达载体还可以包括自主复制序列(ARS)。例如，美国专利号4，837，148描述了为在毕赤酵母中维持质粒提供核酸手段的自主复制序列。整合型载体公开在例如美国专利号4，882，279中。整合型载体一般至少包括如下连续排列的序列第一可插入的DNA片段、可选择的标志物基因和第二可插入的DNA片段。第一和第二可插入的DNA片段都是长度约200个(例如，约250、约300、约350、约400、约450、约500个，或约1000个或更多个)核苷酸，并具有与待转化的物种的基因组DNA部分同源的核苷酸序列。将含有用于表达的目标基因的核苷酸序列(例如，编码具有N糖基化活性的蛋白质的基因)插入到该载体的第一和第二可插入的DNA片段之间，不论是在标志物基因之前或之后。可以在转化前将整合型载体线性化，以促进目标核苷酸序列整合到宿主细胞基因组中。表达载体的特征可以是处于酵母(例如，解脂耶氏酵母、Ogataea minuta、毕赤酵母或其他合适的真菌物种)启动子控制下的重组核酸，使得其能够在真菌细胞中表达。合适的酵母启动子包括例如ADC1、TPI1、ADH2、hp4d、POX和GallO (参见例如，Guarente等人，
(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA79 (23) :7410)启动子。其他合适的启动子描述在例如Zhu和 Zhang(1999)Bioinformatics 15(7-8) :608-611 和美国专利号 6，265，185 中。启动子可以是组成型或诱导型(条件性)的。组成型启动子理解为其表达在标准培养条件下恒定的启动子。诱导型启动子是响应一种或多种诱导条件的启动子。例如，诱导型启动子可以是化学调控的(例如，转录活性受化学诱导剂的存在或缺失调控的启动子，例如乙醇、四环素、类固醇、金属或其他小分子)或物理调控的(例如，转录活性受物理诱导因子的存在或缺失调控的启动子，例如光或高温、低温)。诱导型启动子还可以受一种或多种转录因子的间接调控，所述转录因子自身受化学或物理条件的直接调控。可以理解，其他的遗传改造修饰也可以是条件性的。例如，可以使用如定点DNA重组条件性的删除基因，例如Cre-IoxP系统(参见例如，Gossen等人，(2002) Ann. Rev.Genetics 36:153-173 和美国申请公开号 20060014264)。可以使用多种方法将重组核酸导入本文描述的细胞中，例如原生质体技术或完整的细胞氯化锂酵母转化方法。其他可用于转化质粒或线性核酸载体的方法描述在例如美国专利号 4，929，555 ；Hinnen 等人，(1978)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75:1929 ；Ito 等人，
(1983)J. Bacteriol. 153:163 ;美国专利号 4, 879, 231 ;和 Sreekrishna 等人，(1987)Gene59:115，其公开内容通过引用全文整合到本文中。也可以使用电穿孔和PEG1000完整细胞转化方法，如 Cregg 和 Russel, Methods in Molecular Biology Pichia Protocols,第 3章，Humana Press, Totowa, N. J ,第 27-39 页(1998)所述。可以使用恰当的技术选择转化的真菌细胞，包括但不限于在缺少所需的生物化学产物(由于细胞的营养缺陷型)的条件下，培养转化后的营养缺陷型细胞，选择和检测新的表型，或者培养在存在对缺少包含在转化子中的抗性基因的酵母有毒的抗生素的条件下。 还可以通过基因组中整合的表达盒选择和/或验证转化子，可以通过例如Southern印迹或PCR分析来评估。在将载体导入目标靶细胞之前，载体可以在如上所述的细菌细胞中生长，例如大肠杆菌(E. coli)。可以通过任何本领域已知的从细菌环境中获得纯化载体DNA的方法，从细菌细胞中分离载体DNA。可以用苯酚、氯仿和乙醇专门提取纯化的载体DNA，确保质粒DNA制品中不存在任何E. coli蛋白，因为这些蛋白质对于哺乳动物细胞而言是有毒的。在一些实施方案中，遗传改造过的真菌细胞缺少OCHl基因或其基因产物(例如，mRNA或蛋白质)，是OCHl活性缺陷的。在一些实施方案中，遗传改造过的细胞表达能够促进甘露糖基磷酸化的多肽(例如，来自解脂耶氏酵母、酿酒酵母、Ogataea minuta、毕赤酵母或白色念珠菌的MNN4多肽，或来自毕赤酵母的PNOl多肽)。例如，真菌细胞可以表达解脂耶氏酵母的 MNN4 多肽(Genbank 登录号=XM 503217 ；Genolevures Ref :YALI0D24101g)。在一些实施方案中，遗传改造过的细胞是OCHl活性缺陷的，并表达能够促进甘露糖基磷酸化的多肽。在脱帽M6P残基后，可以分离靶分子。在一些实施方案中，靶分子留在酵母细胞内，并在细胞裂解时释放。在一些实施方案中，靶分子通过编码序列提供的机制(外源性核酸天然的，或者改造到表达载体中)被分泌到培养基中，所述机制指导分子从细胞的分泌。可以通过多种用于检测分子存在的标准规程验，证存在于细胞裂解物或培养基中的脱帽后的靶分子。例如，当改变的靶分子是蛋白质时，此类规程可以包括但不限于用特异性针对改变的靶蛋白(或靶蛋白本身)的抗体进行免疫印迹或放射性免疫沉淀，结合特异性针对改变的靶蛋白(或靶蛋白本身)的配体，或者测试改变的靶蛋白(或靶蛋白本身)的特定酶活性。在使用本文描述的方法生产的靶分子中，糖蛋白上至少47% (例如，至少50，55，60, 65，70, 75，80, 85或90%)的N-聚糖具有末端磷酸-6-甘露糖残基。可以从DSA-FACE电色谱图s的峰面积中估计具有末端磷酸-6-甘露糖残基的N-聚糖的百分比。在一些实施方案中，分离后，可以将脱帽的靶分子连接到异源部分上，例如使用酶手段或化学手段。“异源部分”指任何与改变的靶分子连接(例如，共价或非共价的)的组件，所述组件不同于最初存在于改变的靶分子中的组件。异源部分包括例如聚合物、载体、佐齐U、免疫毒素或可检测的部分(例如，荧光素、冷光素或放射性)部分。在一些实施方案中，可以向改变的靶分子上添加额外的N-聚糖。
用于检测靶分子糖基化的方法包括DNA测序仪辅助的(DSA)、荧光团辅助的碳水化合物电泳(FACE)，或表面增强的激光吸附/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF MS)。例如，分析可以利用DSA-FACE，其中例如糖蛋白被变形，然后固定在例如膜上的。然后，可以用合适的还原剂还原糖蛋白，例如_■硫苏糖醇(DTT)或0疏基乙醇。可以使用酸将蛋白质的疏基羧化，例如碘乙酸。之后，可以使用酶从蛋白质中释放N-聚糖，例如N-葡萄糖苷酶F。任选的，可以通过还原性的胺化作用重建和衍生N-聚糖。然后，可以浓缩衍生的N-聚糖。适合N-聚糖分析的仪器包括例如ABI PRISM 377DNA测序仪(Applied Biosystems)。可以使用例如GENESCAN 3. I软件(Applied Biosystems)实施数据分析。任选的，可以用一种或多种酶进一步处理分离的甘露糖蛋白，验证其N-聚糖状态。N-聚糖分析的其他方法包括例如质谱(例如，MALDI-TOF-MS)、正常相的高压液相色谱(HPLC)、逆相层析和离子交换层析(例如，当未标记聚糖时，用脉冲安培电流检测，如果恰当的标记了聚糖，则用UV吸光值或突光检测)。还参见 Callewaert 等人，(2001) Glycobiology 11 (4) : 275-281 和 Freire等人，(2006) Bioconjug. Chem. 17(2) : 559-564。培养改造过的细胞、本文件还提供了本文描述的任何改造细胞的基本纯的培养物。在本文中，遗传改造过的细胞的“基本纯的培养物”是这样的细胞培养物，所述培养物中少于约40% (S卩，少于约 35% ；30% ；25% ；20% ；15% ；10% ；5% ；2% ；1% ；0. 5% ；0. 25% ；0. 1% ；0. 01% ；0. 001% ；0. 0001% ；
或者甚至更少)的总活细胞数是遗传改造过的细胞以外的活细胞，例如，细菌、真菌(包括酵母)、真菌原生质或原生动物细胞。术语“约”在上下文中意指相关的百分比可以是比所述百分比高或低15%。因而，例如，约20%可以是17%至23%。此类遗传改造过的细胞的培养物包括细胞和生长培养基、储藏培养基或运输培养基。基质可以是液体、半固体(例如，凝胶状基质)或冷冻的。培养物包括生长在液体中的细胞，或生长在半固体基质中/上的细胞，或者在储藏或运输基质中储藏或运输的细胞，包括冷冻储藏或运输基质。培养物是在培养容器或储藏容器或底物(例如，培养皿、瓶或管，或者储藏瓶或管)中的。本文描述的遗传改造过的细胞可以作为例如冷冻的细胞悬浮液储藏，例如在含有冷冻保护剂(如甘油或蔗糖)的缓冲液中，或作为冻干的细胞储藏。可选的，可以作为干燥的细胞制品储藏，所述细胞制品是通过例如流体床干燥或喷雾干燥或任何合适的干燥方法获得的。代谢功能障碍具有脱帽末端M6P残基的分子可用于治疗多种代谢功能障碍。代谢功能障碍是影响单个人(或动物)细胞中的能量产生的功能障碍。大部分的代谢功能障碍是遗传的，虽然一些可以是“作为饮食、毒素、感染等的结果而“获得的”。遗传性代谢功能障碍也称为先天性代谢错误。一般而言，遗传性代谢功能障碍是由遗传缺陷引起的，所述缺陷导致细胞代谢过程中一些步骤必需的酶缺失或错误的构建。最大类的代谢功能障碍是碳水化合物代谢功能障碍、氨基酸代谢功能障碍、有机酸代谢功能障碍(有机酸尿)、脂肪酸氧化和线粒体代谢功能障碍、叶啉代谢功能障碍、嘌呤或嘧啶代谢功能障碍、类固醇代谢功能障碍、线粒体功能障碍、过氧化物酶体功能障碍和溶酶体贮积症(LSD)。可以通过施用一种或多种具有脱帽末端M6P残基的分子(或同一分子的药物组合物)治疗的代谢功能障碍的实例可以包括遗传性血色素沉积症、眼皮肤白化病、蛋白C缺陷、I型遗传性血管性水肿、先天性蔗糖酶-异麦芽糖缺陷、II型Crigler-Najjar综合征、Laron综合征、遗传性髓过氧化物酶、原发性甲状腺机能减退、先天性长QT综合征、酪氨酸结合球蛋白缺陷、家族性高胆固醇血症、家族性高乳糜微粒血症、Abeta-脂蛋白血症、低血浆脂蛋白A水平、伴随肝损伤的遗传性肺气肿、先天性甲状腺机能减退、成骨不全症、遗传性低纤维蛋白原血症、a-抗糜蛋白酶缺陷、肾源性尿崩症、腺苷脱氨酶缺陷、Pelizaeus Merzbacher病、IIA型血管性血友病、因子V和VIII组合缺陷、迟发型脊稚骨N发育不良、无脉络膜症、I细胞病、Batten病、毛细管共济失调、ADPKD-常染色体显性遗传多囊肾病、微绒毛包含病、结节性硬化症、眼脑肾Lowe综合征、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、骨髓发育不良症候群、Tangier病、家族性肝内胆汁淤积症、X-连锁肾上腺脑白质营养不良、Scott综合征、I型和2型Hermansky-Pudlak综合征、Zellweger综合征、肢近端型点状软骨发育不良、常染色体隐性原发性高草酸盐尿、Mohr Tranebjaerg综合征、脊髓和bullar肌肉萎缩、原发性ciliary diskenesia (Kartagener综合征 )、巨人症和肢端肥大症、乳漏、Addison病、肾上腺性男性化、Cushing综合征、酮酸中毒、原发性或继发性醛甾酮症、Miller Dieker综合征、无脑回、运动神经元病、Usher综合征、Wiskott-Aldrich综
合征、Optiz综合征、亨廷顿氏病、遗传性胰腺炎、抗磷脂综合征、重叠结缔组织病、Sjogren综合征、僵人综合征、Brugada综合征、Finnish型先天性肾脏综合征、Dubin-Johnson综合征、X连锁的低磷酸盐血症、Pendred综合征、持续性胰岛素低血糖婴儿、遗传性球形红细胞增多症、无血浆铜蓝蛋白、婴儿神经元蜡样质脂褐质沉积症、假性软骨发育不全和多发性骨骺、Stargardt样黄斑营养不良、X连锁的进行性神经性腓骨肌萎缩症、常染色体显性色素性视网膜炎、Wolcott-Rallison综合征、Cushing病、肢节型肌营养不良症、IV型粘多糖症、遗传性家族性Finish淀粉样病变、肝糖储积病、肉瘤、慢性骨髓单核细胞性白血病、心肌病、面生殖发育异常、Torsion病、亨廷顿氏病和脊髓小脑性共济失调、遗传性高同型半胱氨酸血症、多神经病、低运动神经元病、色素性视网膜炎、血清阴性关节炎、间质性肺纤维化、Raynaud 症状、Wegner 氏肉芽肿、preoteinuria、CDG-Ia> CDG-Ib> CDG-Ic、CDG-Id、CDG-Ie、CDG-If、CDG-IIa、CDG-IIb、CDG-IIc、CDG-IId、Ehlers-Danlos 综合征、多发性外生骨疣、Griscelli综合征(I型或2型)或X连锁的非特异性智力迟钝。此外，代谢功能障碍还可以包括溶酶体贮积症，例如但不限于费波瑞病、I型粘多糖病、法伯氏病、高歇氏病、GMl-神经节苷脂沉积病、泰-萨二氏病、山德霍夫氏病、GM2活化因子病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、尼曼-匹克病(A、B和C型)、V型粘多糖病(Scheie disease), II型粘多糖病(Hunter disease)、IV型粘多糖病(Sanfilippo disease)、莫奎欧氏症、VI型粘多糖病(Maroteaux-Lamy disease)、透明质酸酶缺乏症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、岩藻糖代谢病、甘露糖苷贮积症、辛德勒病、I型唾液腺病、庞贝氏症、骨密质发育不全、蜡样脂褐质沉积症、胆固醇酯沉积病、沃尔曼病、多种硫酸酯酶缺乏症、半乳糖涎酸贮积症、粘脂沉积症(II、III和IV型)、胱氨酸病、唾液酸贮积功能障碍、具有Marinesco- Sjdgren综合征的乳糜微滴滞留病、Hermansky-Pudlak 综合征、Chediak-Higashi 综合征、Danon 氏病或Geleophysic发育不良。代谢功能障碍的症状是多种多样的，可以包括一种或多种的例如贫血、疲劳、易怒、低血小板、肝肿大、脾肿大、骨骼衰弱、肺损伤、感染(例如，胸腔感染或肺炎)、肾损伤、进行性脑损害、癫痫发作、超厚胎粪、咳嗽、哮鸣、过多的唾液或粘液产生、呼吸短促、腹痛、肠闭塞、繁殖力问题、鼻息肉、指甲/趾甲和皮肤的增生性病变、手足痛、血管角质瘤、少汗、角膜和晶状体浑浊、白内障、二尖瓣脱垂和/或回流、心脏扩大症、不耐低温、行走困难、吞咽困难、进行性视力丧失、进行性听力丧失、张力减退、巨舌、反射消失、下腰痛、睡眠呼吸暂停、端坐呼吸、嗜睡、脊柱前弯症或脊柱侧凸。可以理解，由于缺陷或缺少的蛋白质和导致的疾病表型(例如，代谢功能障碍的症状表现)的不同性质，给定的功能障碍一般将只表现出特定功能障碍的特征性症状。例如，患法布里病(Fabry disease)的患者可以表现出上述症状特定子集，例如但不限于不耐低温、角膜旋转、疼痛、皮肤发红、恶心或腹泻。患有高歇氏病的患者可以表现出脾肿大、肝硬化、抽搐、张力亢进、窒息、骨质疏松或皮肤褪色。除了施用一种或多种本文描述的脱帽的分子外，还可以通过正确的营养和维生素(例如，辅助因子疗法)、物理疗法和疼痛药物治疗代谢功能障碍。根据给定的代谢功能障碍的特定性质，患者可以在任何年龄表现出这些症状。在许多情况下，症状可以出现于儿童期或早成年期。例如，法布里病(Fabry disease)的症状可以出现于较早的年龄段，例如10岁或11岁。 在本文中，“处于出现代谢功能障碍的风险”的对象是这样的对象，所述对象具有出现功能障碍的倾向，即，由于酶突变的结果导致出现代谢功能障碍的遗传倾向，例如酸性a葡萄糖苷酶、a半乳糖苷酶、a -L-艾杜糖苷酸酶、^ -D-半乳糖苷酶、^ -葡萄糖苷酶、
氨基己糖苷酶、P-D-甘露糖苷酶、a-L-岩藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、a -N乙酰氨基半乳糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、艾杜糖酸-2-硫酸酯酶、a -葡萄糖胺-N-乙酰转移酶、^ -D-葡萄糖酸酶、透明质酸酶、a -L-甘露糖苷酶、a -神经氨酸苷酶、磷酸转移酶、酸性脂肪酶、酸性神经酰胺酶、神经磷脂酶、硫酯酶、组织蛋白酶K和脂蛋白脂肪酶。显而易见的，“处于出现代谢功能障碍的风险”的对象不是目标物种中的所有对象。“怀疑具有功能障碍”的对象是这样的对象，所述对象具有一种或多种代谢功能障碍的症状，例如本文描述的任何功能障碍的症状药物组合物和治疗方法具有脱帽的M6P残基的靶分子可以整合到含有治疗有效量的分子和一种或多种佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂的药物组合物中。可接受的稀释剂、载体和赋形剂通常不会负面的影响受体的内稳态(例如，电解质平衡)。可接受的载体包括生物可兼容的、惰性的或生物可吸收的盐、缓冲试剂、寡糖或多糖、聚合物、改善粘性的试剂、防腐剂等。一个示例性的载体是生理盐溶液(0. 15M NaCl，pH 7. 0至7. 4)。另一个示例性的载体是50mM磷酸钠，IOOmM氯化钠。制备和施用药物组合物的其他细节可见于例如Remington’ sPharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co. , Easton, Pa.)中。组合物中还可以整合补充的活性化合物。含具有脱帽的M6P残基的分子组合物的施用可以使系统性的或局部的。药物组合物可以如下制备使得它们适合不经肠道的和/或经肠道的施用。特定的施用方式包括皮下、静脉内、肌肉内、腹腔内、透皮的、鞘内的、口腔的、直肠的、脸颊的、局部的、鼻腔的、眼的、关节内的、动脉内的、蛛网膜下的、支气管的、阴道的和子
宫内的施用。施用可以是周期性的注射药物组合物的大药丸(boIus )，或者可以通过外部(例如，IV袋)或内部(例如，生物可侵蚀的植入物、生物人工器官或植入后改变的N糖基化分子生产细胞的克隆)的储槽进行静脉内或腹腔内不间断或持续的施用。参见例如美国专利号4, 407,957,5, 798, 113和5，800，828。药物组合物的施用可以使用合适的递送手段实现，例如泵(参见例如，Annals of Pharmacotherapy, 27:912 (1993) ；Cancer, 41:1270 (1993)；Cancer Research, 44:1698 (1984));微胶囊(参见例如，美国专利号 4，352，883 ;4，353，888和5，084, 350);连续释放的聚合物植入物(参见例如，Sabel，美国专利号4，883，666);大胶囊(参见例如，美国专利号5，284，761,5, 158，881,4, 976，859和4，968，733，和公开的PCT专利申请W092/19195、WO 95/05452);皮下、静脉内、动脉内、肌肉内或其他合适位点的注射；或口服施用，以胶囊、液体、片剂、丸剂或缓释配方的形式。不经肠道的递送系统的实例包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的灌注系统、泵递送、封闭的细胞递送、脂质体递送、针头递送的注射、无针头注射、喷雾器、烟雾器和透皮贴。适合不经肠道的施用的配方通常含有改变的N糖基化分子的无菌含水制品，优选是与受体的血液等渗的(例如，生理盐水)。配方可以存在单元剂量或多剂量形式。
适合口服施用的配方可以作为分散单元存在，例如胶囊剂、扁囊剂(cachet)、片剂或润喉糖，都含有预定量的改变的N糖基化分子；或作为含水液体或不含水液体中的悬浮液存在，例如糖浆、酏剂、乳化液或饮剂(draught)。适合局部施用的具有脱帽的M6P残基的分子可以作为例如乳膏、喷雾、泡沫剂、凝胶、油膏、软膏或干擦剂(dry rub)施用给哺乳动物(例如，人类患者)。干擦剂可以在施用位点再水合。此类分子还可以直接融合到(例如，浸泡到或干燥为)可以之后应用于局部的绷带、纱布或贴剂上。此类分子还可以在局部施用的绷带、纱布或贴剂上维持成半固体、凝胶状或完全的液体状态(参见例如，美国专利号4，307，717)。药物组合物的治疗有效量可以按本领域技术人员可认知的剂量方案向需要的对象施用。例如，可以向对象系统性的施用组合物，按例如每次剂量0. 01 u g/kg至10，000 u g/kg对象体重。在另一个实例中，剂量是从每次剂量I U g/kg至100 u g/kg对象体重。在另一个实例中，剂量是从每次剂量Iu g/kg至30 ii g/kg对象体重，例如从每次剂量3 ii g/kg至10 ii g/kg对象体重。为了使治疗效果最佳，可以首先以不同的剂量方案施用具有脱帽的M6P残基的分子。单元剂量和方案取决于这样的因素，包括例如哺乳动物的物种、其免疫状态、哺乳动物的体重。通常，可以使用恰当的筛选测定监控此类分子在组织中的水平，所述测定作为临床测试程序的一部分，例如确定给定治疗方案的功效。具有脱帽的M6P残基的分子的给药频率落入医学实践人员(例如，医生或护士)的技能和临床判断范围内。通常，施用方案是通过建立最佳施用参数的临床试验建立的。然而，实践人员可以根据对象的年龄、健康、体重、性别和医学状态，改变此类施用方案。给药频率可以根据治疗是否是预防性或治疗性的而改变。可以通过例如细胞培养或实验动物中已知的制药方法，确定此类分子或其药物组合物的毒性和治疗功效。这些方法可用于例如确定LD50 (50%的群体致死的剂量)和ED50(在50%的群体中治疗有效的剂量)。在毒性效应和治疗效应之间的剂量比例是治疗指数，可表示为LD50/ED50比。表现出高治疗指数的药物组合物是优选的。可以使用表现出毒副作用的药物组合物，但是应该仔细的设计递送系统，将此类混合物靶向到受影响组织的位点，从而使对正常细胞(例如，非靶细胞)的潜在损伤最小化，从而降低副作用。从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配置在恰当对象(例如，人类患者)中使用的剂量范围。此类药物组合物的剂量一般落入循环浓度范围内，包括没有或只有极小毒性的ED50。剂量可以 在该范围内改变，取决于使用的制剂类型和利用的施用途径。对于所使用的本文描述的药物组合物(例如，用于治疗对象中的代谢功能障碍)，可以从细胞培养测定中初步估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制成这样的剂量，所述剂量实现了包括细胞培养中确定的IC50 (即，实现了症状的半最大抑制的药物组合物浓度)在内的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更精确的确定人中的有效剂量。可以通过例如高性能的液相色谱测量血浆中的水平。如本文中定义的，具有脱帽的M6P残基的分子的“治疗有效量”是能够在治疗对象中产生医学上理想的结果(例如，减轻一种或多种代谢功能障碍的症状)的分子的量。治疗有效量(即，有效剂量)可以包括毫克或微克量的化合物/千克对象或样品重量(例如，约I微克/千克至约500毫克/千克，约100微克/千克至约5毫克/千克，或约I微克/千克至约50微克/千克)。对象可以是任何哺乳动物，例如人(例如，人类患者)或非人灵长类(例如，黑猩猩、狒狒或猴子)、小鼠、大鼠、兔、荷兰猪、沙鼠、田鼠、马、家畜类(例如，牛、绵羊或山羊)、狗、猫、或鲸。本文描述的分子或其药物组合物可以作为与另一只治疗的组合疗法向对象施用，例如，代谢功能障碍(例如，溶酶体贮积症)的治疗。例如，组合疗法可以不看向对象(例如，人类患者)施用一种或多种其他试剂，所述试剂为患有或有风险出现(或怀疑患有)代谢功能障碍(例如，溶酶体贮积症)的对象提供了治疗益处。因而，化合物或药物组合物和一种或多种其他试剂可以同时施用。可选的，可以首先施用分子，其次施用一种或多种其他试剂，反之亦然。应理解，处于在先治疗特别毒性(例如，具有显著副作用的代谢功能障碍治疗)的情况下时，本文描述的分子的施用可用于抵消和/或减少在先治疗的量至足以产生相同或改善的治疗益处但没有毒性的水平。本文描述的任何药物组合物可以与施用说明一起包括在容器、包装或分配器中。下文是实践本发明的实施例。实施例不以任何方式视为对本发明范围的限制。
实施例实施例I产生具有高度磷酸化的N-聚糖的解脂耶氏酵母菌株为了上调解脂耶氏酵母的聚糖磷酸化，用2种额外的MNN4基因拷贝转化MTLY60菌株，每种基因拷贝位于分离的表达载体中。MNN4基因参与增加酵母中的聚糖磷酸化。图I含有克隆了 MNN4基因的pYLTmAX质粒的示意图，所述质粒用于生产pYLTmAXMnn4，含有处于TEF启动子控制下的MNN4开放阅读框。制备含有2种额外的MNN4基因拷贝的菌株，I种处于hp4d启动子的控制下，I种处于TEFl启动子的控制下。从MTLY60 A ochl菌株(I份MNN4野生型拷贝)、MTLY60 A ochl+Hp4dMNN4 菌株(1WT+1 份额外的 MNN4 拷贝)和 MTLY60 A ochl+Hp4dMNN4+TEFMNN4菌株(1WT+2份额外的MNN4拷贝)制备N聚糖，和通过DNA测序仪辅助的(DSA)、突光团辅助的碳水化合物电泳(FACE)。参见Callewaert等人，Glycobiology11(4) :275-281(2001)。基于图2中的结果，可以推断含I份额外拷贝的菌株中磷酸化峰是上调的，并出现双磷酸化的峰。在含2份额外拷贝的菌株中，双磷酸化的峰高得多，而中性的Man8GlcNAc2糖的峰低得多。实施例2鉴别可以脱帽真菌来源的磷酸化聚糖中存在的加盖(capping)的甘露糖残基的甘露糖苷酶活性酵母和丝状真菌对糖的磷酸化导致甘露糖-磷酸-甘露糖二酯连接(图3)。为了获得磷酸处于单酯连接中的结构，需要能够水解甘露糖-磷酸 连接的甘露糖苷酶，使磷酸保持连接在高甘露糖聚糖结构的6位上。Chiba等人，Glycobiology，12(12) :821-8(2002)指出，纤维单胞菌物种中的甘露糖苷酶能够脱帽甘露糖。然而，Chiba等人仅部分的纯化了甘露糖苷酶蛋白，不能鉴别编码蛋白质的基因。 从LMG细菌收藏中心获得纤维化纤维单胞菌(Cellulosimicrobium cellulans,也称为溶黄嘌呤厄菌(Oerskovia xanthineo Iytica)和藤黄节杆菌(ArthrobacterIuteus))的分离物，并测试所生产的甘露糖苷酶活性。细菌在30°C和含甘露糖的基质中生长，向培养基中分泌甘露糖苷酶。从培养物获得细菌上清液(SN)，通过将SN与分离的源自实施例I所述过表达MNN4的菌株中的N-聚糖孵育，测试所需的甘露糖苷酶活性。在孵育后，通过DSA-FACE测定聚糖(图4 )。在用SN处理后，聚糖获得了额外的电荷，在电场中迁移更快，并移动到electroferogram的左手侧。如果这些跑动快的结构确实是磷酸单酯取代的高甘露糖聚糖，则它们的尺寸将比运动到相同位置的中性产物更大。用磷酸酶处理此类聚糖可获得跑得更慢的中性寡糖。如图5所示，用胎牛肠磷酸酶(CIP)处理，获得了表现出较低电泳迁移率的峰，证明磷酸是末端的且甘露糖是脱帽的。实施例3部分纯化和讲一步鉴别甘露糖苷酶为了纯化甘露糖苷酶，将纤维化纤维单胞菌生长在IL的培养基B (Bagiyan等人，Eur. J. Biochem. 249(1) :286-92(1997))或培养基 A (Chiba 等人，2002，见上文)上。参见表I。之后，用40%和80%硫酸铵沉淀培养基，通过SDS-PAGE分析样品。用含ImM CaClJA20mM磷酸钠缓冲液pH 6. 5透析硫酸铵级分，然后在源自MNN4过表达菌株(实施例I)的寡糖上测试活性。表I培养基组分
培养基A (I升)培养基B (I升)
2g甘露聚糖如甘露聚糖
0. 5g (NH4)2SO42g (NH4)2SO权利要求
1.脱帽(uncapping)寡糖上的甘露糖_6_磷酸残基的方法，所述方法包括 A)提供所述具有甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接的寡糖；和 B)将所述寡糖与能够水解所述甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶接触。
2.权利要求I的方法，其中所述甘露糖苷酶包括与SEQID NO: 50的I至774位残基所述的氨基酸序列或SEQ ID NO:50所述的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
3.权利要求I的方法，其中所述甘露糖苷酶包括与SEQID NO: 50的I至774位残基所述的氨基酸序列或SEQ ID NO:50所述的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
4.权利要求I的方法，其中所述甘露糖苷酶包括与SEQID NO: 50的I至774位残基所述的氨基酸序列或SEQ ID NO:50所述的氨基酸序列具有至少98%同一性的氨基酸序列。
5.权利要求I的方法，其中对于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸侧链中的原子的三维蛋白坐标落入距图33中等价原子的坐标1.5 A偏差以内。
6.权利要求I的方法，其中所述甘露糖苷酶包括以下氨基酸序列，所述序列具有(i)GVGXXGXGG 基序，其中 X 是 Gly, Ala, Ser, Thr 或 Cys ; (ii) VRXE 基序，其中 X 是除 Pro 以外的任何氨基酸;(Ui)X1YQGX2基序，其中X1是Leu, He, Val, Ala, Phe, Tyr或Met，其中X2是Thr, Ser或Asn ;或(iv)⑶XGN，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。
7.权利要求1-6的任一项的方法，其中所述接触步骤是使用纯化的甘露糖苷酶、重组的甘露糖苷酶、含有所述重组的甘露糖苷酶的细胞裂解物，或者含有所述重组的甘露糖苷酶的真菌细胞来实施的。
8.权利要求1-7的任一项的方法，其中所述寡糖与蛋白质连接。
9.权利要求7的方法，其中所述蛋白质是在真菌生物中表达的人蛋白。
10.权利要求9的方法,其中所述真菌生物是解脂耶氏酵母(YarrowiaIipolytica)或Arxula adeninivorans。
11.权利要求9的方法，其中所述真菌生物是甲基营养型酵母。
12.权利要求11的方法，其中所述甲基营养型酵母是毕赤酵母(Pichiapastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、Oogataea minuta 或多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)。
13.权利要求9的方法，其中所述真菌生物是丝状真菌。
14.权利要求13的方法，其中所述丝状真菌选自浅蓝灰曲霉(Aspergilluscaesiellus)、亮白曲霉(Aspergillus candidus)、肉色曲霉(Aspergillus carneus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、弯头曲霉(Aspergillus deflectus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、赫曲霉(Aspergillus ochraceus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)、Aspergillus penicilloides、局限曲霉(Aspergillus restrictus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、Aspergillus tamari、土曲霉(Aspergillus terreus)、焦曲霉(Aspergillus ustus)和花斑曲霉(Aspergillusversicolor)。
15.权利要求8的方法，其中所述蛋白质是病原体蛋白、溶酶体蛋白、生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体或其抗原结合片段，或融合蛋白。
16.权利要求15的方法，其中所述溶酶体蛋白是溶酶体酶。
17.权利要求16的方法，其中所述溶酶体蛋白与溶酶体贮积症(LSD)相关。
18.权利要求17的方法，其中所述LSD是费波瑞病、I型粘多糖病、法伯氏病、高歇氏病、GMl-神经节苷脂沉积病、泰-萨二氏病、山德霍夫氏病、GM2活化因子病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、尼曼-匹克病、V型粘多糖病(Scheie disease)、II型粘多糖病(Hunter disease)、IV型粘多糖病(Sanfilippo disease)、莫奎欧氏症、VI型粘多糖病(Maroteaux-Lamy disease)、透明质酸酶缺乏症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、岩藻糖代谢病、甘露糖苷贮积症、辛德勒病、I型唾液腺病、庞贝氏症、骨密质发育不全、蜡样脂褐质沉积症、胆固醇酯沉积病、沃尔曼病、多种硫酸酯酶缺乏症、半乳糖涎酸贮积症、粘脂沉积症、胱氨酸病、唾液酸贮积功能障碍、具有Marinesco- Sjogren综合征的乳糜微滴滞留病、Hermansky-Pudlak综合征、Chediak-Higashi 综合征、Danon 氏病或Geleophysic 发育不良。
19.权利要求18的方法，其中所述LSD是庞贝氏症或费波瑞病。
20.权利要求1-6的任一项的方法,其中所述甘露糖苷酶包括祀向序列。
21.生产具有末端磷酸-6-甘露糖残基的靶蛋白的方法，所述方法包括 提供经过遗传改造的真菌细胞，所述真菌细胞包括编码甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能够水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖；和 向所述细胞导入编码靶蛋白的核酸，其中所述细胞生产包括所述末端的磷酸-6-甘露糖残基的所述革巴蛋白。
22.权利要求21的方法，其中对于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸侧链中的原子的三维蛋白坐标落入距图33中等价原子的坐标1.5 A偏差以内。
23.权利要求21的方法，其中所述甘露糖苷酶包括a)与SEQID NO: 50的I至774位氨基酸或SEQ ID N0:50的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；或b)具有以下序列的氣基酸序列i )GVGXXGXGG基序，其中X是Gly, Ala, Ser, Thr或Cys ;ii )VRXE基序，其中X是除Pro以外的任何氨基酸；(UDX1YQGX2基序，其中X1是Leu，He, Val, Ala, Phe, Tyr或Met，其中\是1111'，Ser或Asn ;或(iv)⑶XGN，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。
24.权利要求21-23的任一项的方法，其中所述真菌细胞进一步包括编码能够促进甘露糖基磷酸化的多肽的核酸。
25.权利要求21-24的任一项的方法，其中所述真菌细胞是经过改造而缺少OCHl活性的。
26.权利要求21-25的任一项的方法，其中所述甘露糖苷酶是C.cellulans、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)或变铅青链霉菌(Streptomyces Iividans)的甘露糖苷酶。
27.在真菌生物中生产具有末端磷酸-6-甘露糖残基的靶蛋白的方法，所述方法包括 A)提供经过遗传改造的真菌细胞，所述真菌细胞包括编码甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能够水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖，且所述真菌细胞进一步包括编码靶蛋白的核酸；和 B)分离所述具有所述末端磷酸-6-甘露糖残基的靶蛋白。
28.权利要求27的方法，其中对于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸侧链中的原子的三维蛋白坐标落入距图33中等价原子的坐标1.5 A偏差以内。
29.权利要求27的方法，其中所述甘露糖苷酶包括(i)与SEQID N0:50的I至774位氨基酸或SEQ ID N0:50所述氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；或(ii)具有以下序列的氨基酸序列(i) GVGXXGXGG基序，其中X是Gly，Ala，Ser, Thr或Cys ；(ii) VRXE基序，其中X是除Pro以外的任何氨基酸；(iii) X1YQGX2基序，其中X1是Leu, He, Val, Ala, Phe, Tyr 或 Met,其中 X2 是 Thr, Ser 或 Asn ;或(iv)GDXGN,其中 X 可以是除Pro以外的任何氨基酸。
30.权利要求27-29的任一项的方法，其中所述靶蛋白和所述甘露糖苷酶是共同分泌的。
31.经过遗传改造生产包含末端磷酸-6-甘露糖残基的糖蛋白的分离的真菌细胞，所述真菌细胞包括编码甘露糖苷酶的核酸，其中所述甘露糖苷酶在所述真菌细胞中的表达产生了包含所述末端的磷酸-6-甘露糖残基的糖蛋白。
32.权利要求31的真菌细胞，其中对于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸侧链中的原子的三维蛋白坐标落入距图33中等价原子的坐标1.5 A偏差以内。
33.权利要求31的真菌细胞，其中所述甘露糖苷酶包括(a)与SEQID N0:50的I至774位氨基酸或SEQ ID NO: 50的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；或(b )具有以下序列的氨基酸序列(i ) GVGXXGXGG基序，其中X是Gly，Ala，Ser，Thr或Cys ;(ii) VRXE基序，其中X是除Pro以外的任何氨基酸；(iii) X1YQGX2基序，其中X1是Leu, He, Val, Ala, Phe, Tyr 或 Met,其中 X2 是 Thr, Ser 或 Asn ;或(iv)GDXGN,其中 X 可以是除Pro以外的任何氨基酸。
34.权利要求31-33的任一项的真菌细胞，其中所述真菌细胞还包括编码能够促进甘露糖基磷酸化的多肽的核酸。
35.权利要求31-33的任一项的真菌细胞，其中所述真菌细胞经过遗传改造缺少OCHl活性。
36.权利要求31-33的任一项的真菌细胞，其中所述真菌细胞进一步包括编码能够促进甘露糖基磷酸化的多肽的核酸，且其中所述真菌细胞经过遗传改造缺少OCHl活性。
37.权利要求31-36的任一项的真菌细胞，其中所述真菌细胞还包括编码靶蛋白的核酸，其中所述靶蛋白是糖蛋白。
38.权利要求31-36的任一项的真菌细胞，其中所述靶蛋白是人蛋白。
39.权利要求38的真菌细胞，其中所述靶蛋白是病原体蛋白、溶酶体蛋白、生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体或其抗原结合片段，或融合蛋白。
40.权利要求39的真菌细胞，其中所述溶酶体蛋白是溶酶体酶。
41.权利要求40的真菌细胞，其中所述溶酶体酶是酸性a葡萄糖苷酶或a半乳糖苷酶。
42.权利要求38的真菌细胞，其中所述靶蛋白是与LSD相关的蛋白质。
43.权利要求42的真菌细胞，其中所述LSD是费波瑞病、I型粘多糖病、法伯氏病、高歇氏病、GMl-神经节苷脂沉积病、泰-萨二氏病、山德霍夫氏病、GM2活化因子病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、尼曼-匹克病、V型粘多糖病(Scheie disease), II型粘多糖病(Hunter disease)、IV型粘多糖病(Sanfilippo disease)、莫奎欧氏症、VI型粘多糖病(Maroteaux-Lamy disease)、透明质酸酶缺乏症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、岩藻糖代谢病、甘露糖苷贮积症、辛德勒病、I型唾液腺病、庞贝氏症、骨密质发育不全、蜡样脂褐质沉积症、胆固醇酯沉积病、沃尔曼病、多种硫酸酯酶缺乏症、半乳糖涎酸贮积症、粘脂沉积症、胱氨酸病、唾液酸贮积功能障碍、具有Marinesco-SjGgren综合征的乳糜微滴滞留病、Hermansky-Pudlak综合征、Chediak-Higashi 综合征、Danon 氏病或Geleophysic 发育不良。
44.权利要求31-43的任一项的真菌细胞，其中所述真菌细胞是解脂耶氏酵母或Arxula adeninivorans 的细胞。
45.权利要求32的真菌细胞，其中所述能够促进甘露糖基磷酸化的多肽是MNN4多肽。
46.权利要求45的真菌细胞，其中所述MNN4多肽是解脂耶氏酵母、酿酒酵母(S. cerevisiae)、Ogataea minuta、毕赤酵母或白色念珠菌(C. albicans)的多妝。
47.权利要求46的真菌细胞，其中所述能够促进甘露糖基磷酸化的多肽是毕赤酵母PNOl多肽。
48.权利要求31-47的任一项的真菌细胞，其中所述甘露糖苷酶是C.cellulans、天蓝色链霉菌或变铅青链霉菌的甘露糖苷酶。
49.权利要求31-47的任一项的真菌细胞，其中所述甘露糖苷酶包括分泌信号。
50.权利要求33-47的任一项的真菌细胞，其中所述甘露糖苷酶包括将所述甘露糖苷酶靶向胞内区室区域的靶向信号。
51.权利要求31-47的任一项的真菌细胞，其中所述甘露糖苷酶包括将所述甘露糖苷酶靶向胞内区室区域的分泌信号和靶向信号。
52.解脂耶氏酵母、毕赤酵母、多形汉逊酵母、Arxulaadeninivorans、甲醇毕赤酵母、Oogataea minuta或黑曲霉细胞的基本纯的培养物，其大部分被遗传改造为生产包括末端磷酸-6-甘露糖残基的糖蛋白，所述细胞包括编码能够水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶的核酸。
53.权利要求52的培养物，其中对于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸侧链中的原子的三维蛋白坐标落入距图33中等价原子的坐标1.5 A偏差以内。
54.权利要求52的培养物，其中所述甘露糖苷酶包括a)与SEQID N0:50的I至.774位氨基酸或SEQ ID N0:50的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；或b)具有以下序列的氨基酸序列(i) GVGXXGXGG基序，其中X是Gly，Ala，Ser, Thr或Cys ;(ii) VRXE基序，其中X是除Pro以外的任何氨基酸；(iii) X1YQGX2基序，其中X1是Leu, He, Val, Ala, Phe, Tyr 或 Met,其中 X2 是 Thr, Ser 或 Asn ;或(iv)GDXGN,其中 X 可以是除Pro以外的任何氨基酸。
55.权利要求52-54的培养物，其中所述细胞进一步包括编码能够促进甘露糖基磷酸化的多肽的核酸。
56.权利要求55的培养物，其中所述细胞经过遗传改造而缺少OCHl活性。
57.包含末端磷酸-6-甘露糖残基的分离的糖蛋白，其中所述蛋白是由权利要求1-30的任一项的方法生产的。
58.包含糖蛋白的组合物，其中所述糖蛋白上至少47%的N-聚糖包括末端磷酸-6-甘露糖残基。
59.权利要求58的组合物，其中所述糖蛋白上至少50%的N-聚糖包括末端磷酸-6-甘露糖残基。
60.权利要求58的组合物，其中所述糖蛋白上至少75%的N-聚糖包括末端磷酸-6-甘露糖残基。
61.权利要求58的组合物，其中所述糖蛋白上至少90%的N-聚糖包括末端磷酸-6-甘露糖残基。
全文摘要
本文通过能够水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶描述了用于脱帽寡糖上的甘露糖-6-磷酸残基的方法和遗传改造过的细胞。
文档编号C07H11/04GK102712914SQ201080054049
公开日2012年10月3日 申请日期2010年9月29日 优先权日2009年9月29日
发明者H.K.雷毛特, K.C.T.A.M.皮恩斯, N.L.M.卡勒沃特, P.S.蒂尔斯, W.弗维肯 申请人:Vib研究所, Vrije布鲁塞尔大学, 奥克西雷恩英国有限公司, 根特大学