专利名称：作为诊断方法的igfbp-4片段检测的利记博彩app
技术领域：
本发明描述了一种用于诊断人疾病，包括心血管疾病和癌症疾病的方法，其包括检测患者血液中的IGFBP-4(胰岛素样生长因子结合蛋白-4)片段。本发明提供了对IGFBP-4的源自其被特定蛋白酶PAPP-A切割后的IGFBP-4分子的蛋白水解片段(N和C端两者)特异性的抗体及抗体表位。识别这些特定表位的抗体仅对IGFBP-4片段是特异性的，并且与完整的全长IGFBP-4分子没有或者具有较低的交叉反应。可以使用抗体来开发用于定量或定性检测人血液中的IGFBP-4片段的免疫测定法。
背景技术：
胰岛素样生长因子I (IGF-I)和胰岛素样生长因子II (IGF-II)(先前称为生长调节素)在结构上与胰岛素相关，并且是人血浆中循环的两种最丰富的多肽生长因子(1)。 IGF是负责正常组织生长和再生的多能生长因子。另外，已经提示了 IGF通过其葡萄糖降低和胰岛素致敏作用而对葡萄糖稳态具有有益的影响。然而，认为不是所有IGF效应都是有利的；如此，流行病学研究提示了 IGF-I和IGF-II还牵涉常见的癌症、动脉粥样硬化和2 型糖尿病的形成O)。IGF是由许多细胞类型，包括平滑肌细胞和巨噬细胞分泌的。IGF的细胞效应是由膜结合性高亲和力受体介导的。IGF受体是两种独特类型的，并且是由极其多种细胞表达的。IGF是有力的平滑肌细胞促细胞分裂剂，而且提示了这些多肽通过旁分泌、自分泌或内分泌机制促成动脉粥样硬化损伤的形成(3)。在血浆和其它生物学流体中，IGF与来自称作IGF结合蛋白(IGFBP)的结构相关蛋白质家族的蛋白质复合。IGFBP结合约99%的循环IGF集合。此蛋白质家族包括至少六种 IGFBP0 IGFBP与IGF受体不同。认为IGFBP调控IGF在不同组织，包括骨中的效应(4)。IGFBP-4最初以25kDa蛋白质从人骨细胞条件化培养基纯化。后来，还从自多种细胞类型收集的条件化培养基纯化出IGFBP-4，并且在多种细胞类型中揭示了 IGFBP-4的表达(5，6)。自人胎盘和骨肉瘤互补DNA(cDNA)文库推导人IGFBP-4蛋白的一级结构(7，8)。 人IGFBP-4的cDNA编码258个残基的蛋白质，其通过除去信号序列而加工成具有单一天冬酰胺连接的糖基化位点的237个残基的成熟蛋白质6kDa) (7)。虽然培养时的多种细胞类型分泌IGFBP-4的糖基化和非糖基化04_25kDa)形式两者，但是非糖基化通常是正常人血液中最丰富的(5，6)。IGFBP-4在6种IGFBP间的独特之处在于在可变L域中具有两个额外的半胱氨酸残基。IGFBP-4的这些独特特性可以负责IGFBP-4的与众不同的生物学功能(13)。成年人血清中的IGFBP-4的均值水平高于IGFBP-I、IGFBP_2、和IGFBP-6的水平； 与IGFBP-5的水平相似；并且小于IGFBP-3水平。血清IGFBP-4随年龄而升高的趋势与对 IGFBP-I和IGFBP-2报告的趋势相似，但是与IGFBP-3和IGFBP-5水平随年龄下降不同，提示了在人血清中，不同IGFBP的水平随年龄增加而差别地受到调节(12)。虽然血清IGFBP-4的精确功能性作用不完全清楚，但是体外研究已经显示了， IGFBP-4抑制骨细胞和其它细胞类型中的IGF活性。Mohan等(9，10)表明IGFBP-4抑制IGF-I和IGF-II两者诱导的鸡胚颅盖细胞和MC3T3-E1小鼠成骨细胞的细胞增殖。IGFBP-4 抑制多种细胞类型中的IGF-I和IGF-II刺激的DNA合成(6)。IGFBP-4合成可以通过系统激素和局部生长因子在转录或翻译后水平调节(11)。 体外研究揭示了，甲状旁腺素、1，25_ 二羟基维生素D、IGF-I、IGF-II、转化生长因子-beta、 和成骨蛋白-1/骨形态生成蛋白-7是人骨细胞中的IGFBP-4生成的主要调节物(8，9)。特定的蛋白酶解是IGFBP-4功能的一种主要的调节机制。在由人和绵羊皮肤成纤维细胞两者条件化的培养基中第一次报告了 IGF依赖性IGFBP-4特异性蛋白酶。此蛋白酶后来鉴定为妊娠相关血浆蛋白-A (PAPP-A)。还在来自培养的人成骨细胞、血管平滑肌细胞、 颗粒细胞、滋养层和脱落性子宫内膜基质细胞的条件化培养基中以及在卵巢滤泡液和人妊娠血清中检出相同的蛋白水解活性(13)。在1974年，自人妊娠血清以与嗜曙红细胞主要碱性蛋白的原形式(proform) (proMBP)的四聚体复合物第一次分离PAPP-A。揭示了 PAPP-A属于大的Metzincin金属蛋白酶家族。显示了重组PAPP-A是一种能够在M135/K136(使用单字母氨基酸残基代码)间的单一位点切割IGFBP-4的活性蛋白酶。PAPP-A的IGFBP-4切割仅仅在IGFBP与IGF复合时的情况中是可能的。PAPP-A还在S143/K144间切割IGFBP-5，但是在此情况中，不需要 IGF的存在。在Bayes-Genis等(16)的研究后，妊娠相关血浆蛋白A第一次被提示为动脉粥样硬化斑块不稳定性的生物学标志物。这些作者已经表明不稳定性斑块的胞外基质中的高水平PAPP-A。数项研究已经显示了急性冠状动脉综合征(ACQ患者血液中的PAPP-A浓度比在稳定性冠状动脉疾病患者或对照受试者的血液中高。如此，PAPP-A提示为与冠状动脉血液凝结有关的心血管疾病，诸如不稳定性咽峡炎和心肌梗死的标志物。假设在动脉粥样硬化斑块中，由活化的平滑肌细胞表达的PAPP-A可以发挥切割与IGF复合的IGFBP-4，如此增强IGF生物利用度的活性酶的功能。IGF系统可以促成动脉粥样硬化斑块形成、脱稳定化、和导致急性冠状动脉事件的破裂(17)。显示了 IGFBP-4是由肿瘤起源，诸如肺腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌、滤泡性甲状腺癌、胃癌、胶质瘤、肝细胞瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、骨肉瘤和前列腺癌的不同细胞表达。体外和体内研究提示了 IGFBP-4可能通过抑制自分泌IGF作用在多种肿瘤的生长调节中起重要的作用。IGF生物利用度的调节在肿瘤生长和形成中可以发挥至关重要的作用(13)。似乎提示PAPP-A浓度的血浆测量的可获得证据对于辨别不稳定性动脉粥样硬化斑块患者及用于鉴定癌症患者可以是有价值的。然而，现在已经证实精确的PAPP-A血浆测量不是容易的任务。首先，这是由于如下的实情，即此蛋白质在患者血浆中存在着极低的水平。还显示了肝素注射也可以影响患者血浆中的PAPP-A水平(18)。我们已经提示了，PAPP-A酶活性产物的测量可以比直接的PAPP-A测量具有更高的临床价值，因为此类产物应当在血液中以比PAPP-A更高的浓度呈现，并且其在血液中的浓度应当不受肝素注射影响。本发明致力于利用IGFBP-4片段作为身体中升高的PAPP-A活性的标志物，并且因此作为与升高的PAPP-A浓度和活性有关的不同疾病的标志物。不管患者样品中是否存在完整的IGFBP-4，为了特异性测量IGFBP-4的蛋白水解片段而设计的免疫测定法对于诊断或预测多种病理学，包括ACS和癌症可以具有实践价值。发明_既述本发明涉及人病理学，包括心血管疾病和癌症的新的血液标志物，即IGFBP-4的蛋白水解片段的发现。在我们的研究中，我们已经显示了动脉粥样硬化斑块中表达的PAPP-A是一种活性蛋白酶。将来自动脉粥样硬化血管的PAPP-A纯化至同质性，并且显示了其能够在存在 IGF-II的情况中有效切割IGFBP-4。PAPP-A在氨基酸残基M135与K136间切割IGFBP-4， 产生两个IGFBP-4片段，BP"N端片段”(包含完整的IGFBP-4分子的N端至M135的氨基酸残基)和“C端片段”(包含完整的IGFBP-4分子的K136至C端的氨基酸残基)。获得对IGFBP-4蛋白水解片段特异性的且没有展现与全长分子的交叉反应性或展现出低的与全长分子的交叉反应性的单克隆抗体。这些单抗能够仅识别通过PAPP-A在氨基酸残基M135与K136间对IGFBP-4切割生成的新表位，并且没有或者具有低的与完整的(完全大小的)IGFBP-4分子的交叉反应。特别地，本发明的抗体以比它们识别全长 IGFBP-4高的亲和力特异性识别通过酶依赖性IGFBP-4切割起源的新表位。使用与识别完整的IGFBP-4的另一种抗体配对的这些片段特异性抗体之一，设计数种三明治式免疫测定法。这些测定法适合于IGFBP-4片段量化，而不管样品中是否存在全长 IGFBP-4 (图 2B)。免疫测定法适用于测量ACS患者和健康供体血液中的IGFBP-4的这两种蛋白水解片段。显示了 IGFBP-4蛋白水解片段的水平在ACS患者的血液中比在健康供体的血液中显著更高。ACS患者的血浆中的IGFBP-4片段的均值水平比在健康供体的血浆中高3. 2倍(ρ < 0. 0005)(图3)。基于这些观察结果，我们已经提示了可以使用IGFBP-4的这两种蛋白水解片段作为动脉粥样硬化斑块脱稳定化和破裂的标志物。如此，在本发明中，我们描述了 IGFBP-4的片段作为人病理学，包括心血管疾病的新标志物；使用患者血液中的IGFBP-4片段测量来预后和诊断ACS的方法。附图简述
图1 :IGFBP_4的蛋白水解片段的Western印迹检测，其表明自动脉粥样硬化组织纯化的PAPP-A的蛋白酶活性。通过以下处理IGFBP-4 (每道200ng)第1 道，重组 PAPP-A ； 第2道，动脉粥样硬化组织PAPP-A ；第3 道，没有 PAPP-A ；第4道，分子量标志物；以kDa显示。使用兔抗-IGFBP-4多克隆抗体来免疫染色。图2A =ELISA中的IGFBP-4片段特异性单抗测试将IOng全长重组IGFBP-4或通过PAPP-A依赖性切割生成的IGFBP-4片段在聚苯乙烯板上吸附。清洗后，在30分钟期间在摇动的情况中将片段特异性单抗IBP3、IBP12、 IBP27、IBP13和IBP28(10微克/ml)在孔中温育。通过与辣根过氧化物酶(底物TMB)缀合的抗小鼠IgG多克隆抗体检测特异性结合的抗体。图2B 对IGFBP-4片段特异性的三明治式免疫测定法。
免疫测定法捕捉单抗IBP513、IBP521(200ng/ 孔)。检测单抗用稳定的Eu3+螯合物标记的IBP12、IBP27、和IBP30 (1微克/ml)。抗原100ng/ml全长重组IGFBP-4或通过PAPP-A依赖性切割生成的IGFBP-4片段。温育体积0.1ml。温育时间于室温30分钟。CPS 每秒的计数；AW450nm) :450nm的吸光度单位。图3 人血浆中的IGFBP-4片段检测免疫测定法捕捉单抗IBP521(2OOng/ 孔)。检测单抗通过稳定的Eu (3+)螯合物标记的IBP30 (1微克/ml)。MAB IBP521识别完全大小的IGFBP-4及通过PAPP-A介导的蛋白酶解生成的其C 端片段MAb IBP30仅特异性识别IGFBP-4的C端片段，并且不识别完全大小的IGFBP-4。温育体积0. Iml0温育时间于室温30分钟。CPS 每秒的计数。发明详述本发明描述了 IGFBP-4的N和C端蛋白水解片段作为生物标志，与健康供体血浆相比，所述生物标志在ACS或一些癌症患者的血浆样品中以显著更高的水平呈现。可以使用IGFBP-4片段的免疫测定法来早期检测ACS或癌症，或者来测定疾病形成风险的程度。遵循标准的方案来开发对IGFBP-4肽以及完整的IGFBP-4特异性的单克隆抗体。 用于动物免疫以获得IGFBP-4片段特异性的单克隆抗体的合成肽对应于PAPP-A依赖性切割位点处的IGFBP-4蛋白水解片段。合成肽含有出于偶联目的的额外的末端半胱氨酸(与假定的蛋白水解位点相反)。通过质谱术分析来确认序列，并将肽与载体蛋白缀合。使用所得的缀合物作为抗原以进行小鼠免疫。依照本领域技术人员已知的标准技术(19-22)来制备肽结合单克隆抗体。数轮动物免疫后，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞系的细胞融合。此类方案还包括对形成的杂交瘤克隆筛选生成的抗体期望的特异性的阶段。为了获得本发明的抗体，杂交瘤克隆筛选为对与 IGFBP-4蛋白水解片段对应的IGFBP-4肽特异性结合，且同时不与完整的IGFBP-4起反应。 此方法使得能够找出生成对IGFBP-4的新表位特异性的单克隆抗体的数个杂交瘤克隆，所述新表位在对蛋白质的PAPP-A依赖性切割过程中形成(图2A)。在进行的实验中，选择一组如下的单克隆抗体，其对通过PAPP-A依赖性切割生成的IGFBP-4的蛋白水解片段特异，并且具有小于5%的与完整的IGFBP-4的交叉反应性。然而，应当注意，获得的交叉反应性百分比取决于例如所使用的方法，并且不应认为5%是低交叉反应性的限制性数值。用对完整的(完全大小的)IGFBP-4特异性的单克隆抗体在三明治式免疫测定法中测试获得的肽特异性抗体以寻找两位点抗体组合，其适合于开发用于特异性测定 IGFBP-4蛋白水解片段，而不管完整的全长IGFBP-4的存在的三明治式免疫测定法。使用对完整的IGFBP-4特异性的单克隆抗体作为捕捉抗体，而使用对IGFBP-4的蛋白水解片段特异性的单克隆抗体作为检测抗体。在一些实施方案中，抗体的相反构型也是有可能的。本发明中所描述的三明治式免疫测定法对IGFBP-4的蛋白水解片段是高度特异性的(图2B)。在本发明中，通过稳定的Eu3+螯合物标记开发的三明治式免疫测定法的检测抗体。在多个其它实施方案中，可以通过能够生成不同类型的信号的不同类型的标记物来标记检测抗体，所述信号可以使用多种标准的方法，诸如检测发光、化学发光、荧光、吸光度、 放射性、或者通过显微术、成像等来显现或检测。免疫测定法可以包括免疫组合化学、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、Western印迹、浊度法、比浊法、免疫放射测定法、侧向流动、免疫组织/细胞化学和本领域技术人员已知的其它方法。可以使用免疫测定法来测定样品中的生物标志的存在或缺乏及样品中的生物标志的量。可以通过与参照或标准品，诸如完整的IGFBP-4或已知存在于样品中的不同多肽比较(或者为与其的比率)来测定样品中的IGFBP-4蛋白水解片段的量。还可以通过与参照或标准品，诸如参照或对照样品中的内源或重组或合成IGFBP-4片段的量比较来测定样品中的IGFBP-4蛋白水解片段的量。因而，样品中的生物标志的量不需要以绝对项量化，但是可以相对于参照或对照以相对项测量。在本发明中，实施检测ACS的血浆样品中的IGFBP-4的蛋白水解片段。通过使用 IBP521-IBP30三明治式对揭示片段的显著增加(图3)。本发明的多个实施方案包括检测患者血浆样品中的IGFBP-4的N端或C端或同时的C端和N端片段以评估ACS形成风险。本发明的又一个实施方案是用于检测IGFBP-4蛋白水解片段或测量样品中的 IGFBP-4蛋白水解片段量的免疫测定试剂盒。试剂盒可以包含(i)对N端或C端IGFBP-4 蛋白水解片段特异性的单克隆抗体，( )对完整的IGFBP-4的任何合适的表位特异性的第二单克隆检测抗体，和(iii)至少与IGFBP-4片段序列部分对应的内源IGFBP-4片段或重组蛋白的标准品或校正物制备物。可以适当地标记第二单克隆抗体以检测抗体-IGFBP-4 片段复合物。在一些实施方案中，用于IGFBP-4片段竞争性测量的试剂盒可以包含(i)对N端或C端IGFBP-4蛋白水解片段特异性的单克隆抗体，(ii)至少与IGFBP-4片段序列部分对应的内源IGFBP-4片段或重组蛋白的标准品或校正物制备物。可以通过IGFBP-4片段的所述经标记的标准品制备物的竞争性除去程度来测定分析样品中的IGFBP-4片段水平。实施例1 生成对蛋白酶解介导的IGFBP-4新表位特异性的小鼠单克隆抗体。为了小鼠免疫而获得的合成肽肽-1(SEQ ID NO. 1)肽-2(SEQ ID NO. 2)使用固相Fmoc化学Q3)来合成肽_1和肽2。在对烷氧基苯甲醇树脂上制备肽。 在自树脂切割后，通过反相高压液相层析来纯化粗制肽制备物。用水中的0.1 %三氟乙酸梯度和乙腈中的0. 三氟乙酸应用C18制备柱。通过分析C18高压液相层析和质谱术(具有士0. 5道尔顿精确性的基质辅助激光解吸/离子化质谱术)来测定纯度(> 95% )。IGFBP-4肽-1(SEQ ID NO. 1)含有与IGFBP-4片段122_1；35相同的氨基酸序列，其具有来自N端的一个额外的半胱氨酸残基。IGFBP-4肽-2 (SEQ ID NO. 2)含有与IGFBP-4 片段136-150相同的氨基酸序列，其具有来自C端的一个额外的半胱氨酸残基。使用这些额外的半胱氨酸残基的硫氢基基团来制备与载体蛋白的肽缀合物。
通过使用获得Pierce (Rockford, IL)的磺基-SMCC依照制造商的指令实施肽与载体蛋白的缀合物的制备。对于缀合物，将2. 5mg载体蛋白，即牛血清清蛋白(BSA)或卵清蛋白(两者都获自 Sigma Chemicals, St. Louise, Mo.)在 IOmM KHPO4 U 50mM NaCl, pH 7. 4 (PBS)中以浓度10mg/ml溶解。将0. Iml 二甲亚砜中溶解的2毫克磺基-SMCC添加至蛋白质溶液。于室温实施载体蛋白活化的反应达2小时。使用NAP-5柱(获自GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ)通过凝胶过滤除去过量的磺基-SMCC。用 IOmM KHPO4, 150mM NaCl, pH 7. 2预平衡NAP-5柱。然后，将2mg合成肽-1或肽-2添加至蛋白质溶液以开始缀合。在冰上在不断摇动的情况中实施此反应达2小时。通过使用用PBS预平衡的凝胶过滤NAP-5柱自蛋白质-肽缀合物除去未反应的肽级分。根据通过使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳揭示的蛋白质分子量的3-5kDa增加确认肽与合适的载体蛋白的缀合。将缀合物等分取样，并于-20°C贮存，直至使用。用肽_(载体蛋白)缀合物免疫小鼠用肽-蛋白质缀合物将5只BALB/c小鼠的组免疫5次。组1 第一次免疫腹膜内地在具有60%弗氏完全佐剂的PBS中的0. 2ml 10微克 BSA-肽-1 ；第二次免疫第30天，腹膜内地在具有60%弗氏不完全佐剂的PBS中的0. 2ml 5微克BSA-肽-1 ；第三次免疫第60天，腹膜内地在PBS中的0. 2ml 2. 5微克BSA-肽-1。组2 第一次免疫腹膜内地在具有60%弗氏完全佐剂的PBS中的0. 2ml 10微克 BSA-肽-2 ；第二次免疫第30天，腹膜内地在具有60%弗氏不完全佐剂的PBS中的0. 2ml 5微克BSA-肽-2 ；第三次免疫第60天，腹膜内地在PBS中的0. 2ml 2. 5微克BSA-肽-2。第三次免疫后20天，选择具有最高滴度的肽特异性抗体的小鼠来进行最后一次免疫和杂交。给小鼠静脉内注射对于组1的0. 2ml在PBS中的10微克BSA-肽-1及对于组2的0. 2ml在PBS中的10微克BSA-肽-2。次日以相同的方案重复静脉内注射(第五次免疫)。然后，第五次免疫后2天，将经免疫小鼠的脾在无菌条件下分离，并将均浆化的组织与小鼠骨髓瘤细胞系sp2/0融合，如先前所描述的(19-22)。通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)来对培养杂交瘤的条件化培养基筛选抗体。通过ELISA分别用作为预吸附的抗原使用的卵清蛋白-肽-1或卵清蛋白-肽-2来选择生成对肽1或肽2特异性的抗体的杂交瘤。对于别的测试，使用NSO细胞系中表达的人重组IGFBP_4(获自Sigma Chemicals, St. Louise, Mo.)及预吸附的抗原。对于测定法，在免疫测定聚苯乙烯板(获自Corning, Cambridge, ΜΑ)上吸附每孔50ng/0. 11 PBS的卵清蛋白-肽-1、或卵清蛋白-肽_2、或人重组IGFBP-4。在抗原吸附40分钟后，将平板清洗两次， 并用含有去污剂Tween 20,0. 的PBS(PBST)封闭10分钟。然后，将平板与0. 05ml通过培养杂交瘤30分钟收集的条件化培养基一起温育，并用PBST清洗2次。通过与每孔0. Iml 在PBST中1 1000稀释的与HRP缀合的二级抗小鼠IgG多克隆抗体一起温育30分钟来揭示与预吸附的抗原结合的小鼠抗体。二抗来自Sigma Chemicals, St. Louise, Mo。与二抗一起温育后，用PBST将平板清洗6次，并添加3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物，其含有0. 03%过氧化氢。在温育15分钟后通过添加0. Iml 0. 5M磷酸来停止反应，并于450nm测量孔中的吸光度。用Labsystems Multiscan微板读板仪(Labsystems， Finland)来实施吸光度的测量。选择生成对与卵清蛋白(于上文所描述的450nm条件的吸光度超过背景大于0. 5)缀合的合适的肽特异性的，并且同时不与人重组IGFBP-M450nm的吸光度超过背景小于 0. 025)起反应的抗体的杂交瘤来进行进一步的工作。通过有限稀释克隆此类杂交瘤。将分泌感兴趣的单克隆抗体的杂交瘤克隆在含有10%胎牛血清(HyClone Laboratories, Logan, UT)的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)中培养。抗体的亲和纯化在腹膜内注射选定的杂交瘤克隆后在小鼠腹水中生成单克隆抗体。通过使用蛋白 A亲和层析自腹水纯化抗体。树脂来自GE Healthcare Life Sciences (Piscataway，NJ)， 并且依照制造商的指令来实施纯化。将纯化的单克隆抗体于4°C作为50%硫酸铵中的悬浮液贮存。单克隆抗体特异性的调查为了确认选定的单克隆抗体的特异性，获得IGFBP-4蛋白水解片段。依照较早所描述的条件(14)来实施PAPP-A依赖性蛋白水解反应。将2微克人重组IGFBP-4在存在 2mM CaCl2,1. 8 微克 IGF-II (获自 Sigma Chemicals, St. Louise, Mo)、40ng 人重组 PAPP-A(HyTest，Turku, Finland)和 2 微升蛋白酶抑制剂混合物(获自 Sigma Chemicals, St. Louise，Mo)的情况中在0. 23ml 50mMTris-HCl, pH 7. 5中温育。将反应于37°C实施 15小时，并通过于-20°C冷冻样品来停止。通过Western印迹通过使用1微克/ml获自 Abeam (Cambridge, ΜΑ)的特异性兔多克隆抗体来测定对IGFBP-4的PAPP-A依赖性切割的程度(图1)。使用亲和纯化的抗体在间接ELISA中实施针对IGFBP-4蛋白水解片段的选定的单克隆抗体的特异性研究(图2Α)。将IOng全长重组IGFBP-4或通过PAPP-A依赖性切割生成的IGFBP-4片段(上文所描述的制备物)在聚苯乙烯板上吸附。温育40分钟后，将平板清洗两次，并用含有去污剂Tween 20,0. 1 %的PBS(PBST)封闭10分钟。然后，将分泌的单抗 (10微克/ml)于室温在摇动的情况中温育30分钟，并且此后，用PBST清洗两次。通过每孔 0.1ml在PBST中以1 1000稀释的与HRP缀合的抗小鼠IgG多克隆抗体检测特异性结合的抗体。二抗来自Sigma ChemicalsJt. Louise，Mo。与二抗一起温育后，用PBST将平板清洗6次，并添加含有过氧化物酶底物的3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)，其补充有0. 03% 过氧化氢。在温育15分钟后通过添加0. Iml 0. 5M磷酸来停止反应，并于450nm测量吸光度。最终，选择对通过PAPP-A依赖性切割生成的IGFBP-4的蛋白水解片段特异性的，并且具有小于5%的与完整的IGFBP-4的交叉反应性的单克隆抗体组IBP28，IBP27, IBP12, IBP3, IBP4, IBP7, IBP13, IBP18, IBP19, IBP20, IBP30, IBP167, IBP166, IBP168, IBP174, IBP160, IBP161，IBP164, IBP171。所有单克隆抗体是IgG同种型的，只是IBP30是IgM同种型的。用于量化IGFBP-4片段的三明治式免疫测定法的设计还在三明治式免疫测定法中检查亲和纯化的单克隆抗体的特异性(图2B)。开发出数种三明治式测定法，其利用对IGFBP-4的蛋白水解片段(N或C端；在间接ELISA中小于5%的与全长分子的交叉反应)特异性的一种单克隆抗体和识别完整IGFBP-4的任何表位的另一种单抗。实施例2中描述了对完整IGFBP-4特异性的小鼠单克隆抗体的生成。为了实施三明治式荧光免疫测定法，我们使用经稳定的Eu3+螯合物标记的检测单抗，如由Hyytia等所描述的04)。此测定法中的捕捉抗体对于完整的IGFBP-4是特异性的，而检测抗体对IGFBP-4的蛋白水解新表位是特异性的。将100 μ L磷酸盐缓冲液盐水中每孔2 μ g的捕捉抗体(IBP513，IBP521)在96孔免疫测定板中在不断摇动时于室温温育30 分钟。将平板用补充有 0. 15MNaCl，0. 025% Tween 20 和 0. 5g/l NaN3 的 IOmM Tris-HCl (pH 7. 8)缓冲液(缓冲液A)清洗。清洗后，将0. Iml测定缓冲液(50mM Tris-HCl缓冲液、pH 7. 7，9g/lNaCl、0. 01% Tween 40,0. 5% BSA 和 0. 5g/l NaN3)添加至平板，所述测定缓冲液含有lOOng/ml全长人重组IGFBP-4或通过PAPP-A依赖性切割生成的IGFBP-4片段。将平板于室温在不断摇动的情况中温育30分钟。用缓冲液A清洗后，添加0. Iml在测定缓冲液中的检测抗体(IBP12、IBP27和IBP30)的溶液(lmg/1)。将平板于室温在不断摇动的情况中温育30分钟。用缓冲液A清洗后，添加每孔0. 2ml增强溶液(1. 75M NaSCNUM NaCl,5% 甘油、20% 1-丙醇、5mM Na2CO3>50mM甘氨酸-NaOH，pH 10. 0)，并于室温在温和摇动的情况中温育3分钟。在Victor 1420多标记物计数器(WalIac-Perkin Elmer)上测量Eu3+的荧光。以每秒的计数(CPQ表达荧光。开发的三明治式免疫测定法能够仅检测通过PAPP-A依赖性切割生成的IGFBP-4 片段，并且与全长IGFBP-4没有交叉反应(或非常低小于)。实施例2 生成对完整的IGFBP-4特异性的小鼠单克隆抗体小鼠的免疫用哺乳动物NSO细胞系中表达的人重组IGFBP-4将5只BALB/c小鼠免疫5次。蛋白质获自Sigma Chemicals, Μ. Louise，Mo。第一次免疫腹膜内地在具有60%弗氏完全佐剂的PBS中的0. 2ml 5微克IGFBP-4 ；第二次免疫第30天，腹膜内地在具有60%弗氏不完全佐剂的PBS中的0. 2ml 2微克IGFBP-4 ；第三次免疫第60天，腹膜内地在PBS中的 0. 2ml 2 微克 IGFBP-4。第三次免疫后20天，选择具有最高滴度的蛋白质特异性抗体的小鼠来进行接着的免疫和杂交。对于第四次，给小鼠静脉内注射0. 2ml在PBS中的2微克IGFBP-4。次日依照相同的方案实施最后一次静脉内注射(第五次免疫)。两天后，将经免疫小鼠的脾在无菌条件下分离，并将均浆化的组织与小鼠骨髓瘤细胞系sp2/0融合，如先前所描述的(19-22)。使用ELISA方法对培养杂交瘤的条件化培养基筛选IGFBP-4特异性抗体。依靠间接的ELISA来选择生成对完整的IGFBP-4特异性的抗体的杂交瘤。对于测定法，将每孔 50ng/0. Iml PBS的全长人重组IGFBP-4在免疫测定聚苯乙烯板上吸附。温育40分钟后，将平板清洗两次，并用含有去污剂Tween 20，0. 1 %的PBS(PBST)封闭10分钟。然后，将平板与0. 05ml通过自含有培养杂交瘤的孔收集的条件化培养基一起温育30分钟。温育后，将平板用PBST清洗2次。清洗后，将平板与每孔0. Iml与HRP (在PBST中以1 1000稀释) 缀合的抗小鼠IgG多克隆二抗一起温育30分钟。与二抗一起温育后，将平板用PBST清洗六次，并添加含有TMB和0. 03%过氧化氢的过氧化物酶底物。在温育15分钟后通过添加 0. Iml 0. 5M磷酸来停止反应，并于450nm测量孔中的吸光度。通过有限稀释方法来克隆生成对全长IGFBP-4(于450nm的上文所描述的条件的吸光度超过背景大于0. 特异性的抗体的杂交瘤。将分泌感兴趣的单克隆抗体的杂交瘤克隆在含有10%胎牛血清的DMEM中培养。抗体的亲和纯化在腹膜内注射选定的杂交瘤克隆后在小鼠腹水中生成对全长IGFBP-4特异性的单克隆抗体。通过使用蛋白A亲和层析自腹水纯化抗体。树脂来自GEHealthcare LifeSciences (Piscataway, NJ)，并且依照制造商的指令实施纯化。将纯化的单克隆抗体于4°C 作为50%硫酸铵中的悬浮液贮存。实施例3 动脉粥样硬化患者PAPP-A的蛋白水解活性将人动脉粥样硬化冠状动脉血管样品于-70°C贮存，直至使用。在含有0. 15M NaCUO. 5% Triton X100、和蛋白酶抑制剂混合物的50mM Tris-HCl (pH7. 8)缓冲液中组织勻浆化后自动脉粥样硬化冠状动脉血管提取PAPP-A。依靠亲和层析来纯化提取的PAPP-A0 利用PAPP-A特异性单克隆抗体4G11 (获自HyTest，Turku，Finland)来制备用于PAPP-A纯化的亲和基质。为了确认纯化的蛋白质与PAPP-A的同一性，使用用数种PAPP-A特异性单克隆抗体的Western印迹分析和液相层析/串联质谱术分析。对于对动脉粥样硬化患者PAPP-A的蛋白水解活性分析，将2微克人重组IGFBP-4 在 0.23ml 50mM Tris-HCl, pH 7. 5 中在存在 2mM CaCl2、1. 8 微克 IGF-II (获自 Sigma Chemicals, St. Louise, Mo.)、40ng动脉粥样硬化患者PAPP-A、和2微升蛋白酶抑制剂混合物(获自Sigma Chemicals, St. Louise, Mo)中温育。于37°C实施反应达15小时，并通过于_20°C冷冻样品来停止。通过Western印迹使用IGFBP-4特异性兔多克隆抗体(获自 Abeam, Cambridge, ΜΑ)测定对IGFBP-4的PAPP-A依赖性切割的程度(图1)。显示了动脉粥样硬化患者PAPP-A以与重组PAPP-A相同的效率切割IGFBP-4。如此，第一次显示了人斑块中表达的内源PAPP-A是一种能够在存在IGF-II的情况中切割IGFBP-4的活性蛋白酶。实施例4 测量ACS患者血浆样品中的IGFBP-4片段。通过片段特异性三明治式免疫测定法测试43名ACS患者(具有ST段升高)的血液及来自34名健康供体的血浆样品。将所有血浆样品在存在EDTA的情况中自患者收集， 并在测量前于-70°C贮存。对于三明治式免疫测定法测量，将0. Iml磷酸盐缓冲盐水中每孔2微克的捕捉抗体IBP521在96孔免疫测定板中于室温在不断摇动时温育30分钟。用缓冲液A清洗后，将用测定缓冲液以1 1稀释的0.1ml患者血浆样品添加至平板。将平板于室温在不断摇动的情况中温育30分钟。用缓冲液A清洗后，添加测定缓冲液中的0. Iml检测抗体IBP30(lmg/ 1)。将平板于室温在不断摇动的情况中温育30分钟。用缓冲液A清洗后，添加每孔O.aiil 增强溶液，并于室温在温和摇动的情况中温育3分钟。使用Victor 1420多标记物计数器 (Wallac-PerkinElmer)来测量Eu3+荧光。ACS患者血浆中的IGFBP-4片段水平比在健康供体血浆中高3. 2倍(ρ < 0. 0005)(图3)。图上显示了均值数值士标准偏差。以每秒的计数(CPQ表达荧光。参考文献1.Spencer EM. Modern concepts of insulin-like growth factors. New York Elsevier,1991.2. Frystyk J. , Free insulin-like growth factors-measurements and relationships to growth hormone secretion and glucose homeostasis. Growth Horm IGF Res. 2004 ； 14 (5) :337-75.3. Ferns GA et al. The insulin-like growth factors :their putative role in atherogenesis. Artery 1991 ； 18 (4) :197-225.4. Rosenfeld RG, Lamson G, Pham H, Oh Y, Conover C,De Leon DD, Donovan SM,Ocrant IiGiudice L Insulin—like growth factor-binding proteins. 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权利要求
1.一种抗体，其识别通过对IGFBP-4的酶依赖性切割起源的新表位，该新表位包含如 SEQ ID NO :3中所描述的氨基酸序列或与SEQ ID NO :3具有至少80%同源性的氨基酸序列。
2.依照权利要求1的抗体，其以比其识别全长IGFBP-4更高的亲和力特异性识别通过酶依赖性IGFBP-4切割起源的新表位。
3.一种抗体，其特异性识别通过对IGFBP-4的酶依赖性切割起源的新表位，并且其不识别全长IGFBP-4，所述新表位包含如SEQ ID NO :3中所描述的氨基酸序列或与SEQ ID NO 3具有至少80%同一性的氨基酸序列。
4.依照权利要求3的抗体，其特异性识别通过在氨基酸残基M135与K136间的酶依赖性IGFBP-4切割起源的新表位，并且其不识别全长IGFBP-4。
5.依照权利要求1的抗体，其特异性识别通过在M135与K136氨基酸残基间的酶依赖性IGFBP-4切割起源的新表位。
6.依照权利要求5的抗体，其以比其识别全长IGFBP-4更高的亲和力特异性识别通过在M135与K136氨基酸残基间的酶依赖性IGFBP-4切割起源的新表位。
7.依照权利要求1的抗体，其以比其识别全长IGFBP-4更高的亲和力特异性识别由于 PAPP-A在M135与K136氨基酸残基间对IGFBP-4切割起源的新表位。
8.与依照权利要求1至4中任一项的抗体具有相同特异性的适体或另一种结合剂。
9.依照权利要求1至4中任一项的抗体，其是单克隆抗体或其片段。
10.依照权利要求1至4中任一项的抗体，其是多克隆抗体或其片段。
11.依照权利要求1至4中任一项的抗体，其是重组抗体或其片段。
12.一种定性或定量检测IGFBP-4蛋白水解片段的方法，其利用依照权利要求1至4中任一项的至少一种抗体来进行。
13.一种定性或定量检测IGFBP-4蛋白水解片段的方法，其利用依照权利要求8的至少一种适体或结合剂来进行。
14.依照权利要求12或13的方法，其是诊断免疫测定法。
15.依照权利要求14的方法，其用于诊断心血管疾病。
16.依照权利要求14的方法，其用于诊断癌症。
17.依照权利要求12或13的方法，其是进一步包括使用包含与通过酶依赖性IGFBP-4 切割起源的所述新表位对应的表位的内源或重组IGFBP-4蛋白水解片段或合成肽的制备物作为标准品来制备校正曲线的诊断方法。
18.依照权利要求17的方法，其进一步包括将如检出的IGFBP-4蛋白水解片段的水平与制备的所述校正曲线比较。
19.依照权利要求14的方法，其中所述免疫测定法是使用第一捕捉抗体和第二检测抗体的三明治式免疫测定法。
20.包含与通过酶依赖性IGFBP-4切割起源的所述新表位对应的表位的内源或重组 IGFBP-4蛋白水解片段或合成肽作为标准品或校正物用于包含依照权利要求1至4中任一项的至少一种单克隆抗体或依照权利要求8的适体或结合剂的免疫测定法的用途。
21.包含与通过酶依赖性IGFBP-4切割起源的所述新表位对应的表位的内源或重组 IGFBP-4蛋白水解片段或合成肽作为抗原以生成与权利要求1至4中任一项的抗体具有相同特异性的抗体的用途。
22.一种用于诊断性测定患者样品中的IGFBP-4蛋白水解片段的免疫测定试剂盒，该试剂盒包含(a)与权利要求1至4中任一项的抗体具有相同特异性的抗体，(b)对全长IGFBP-4的任何表位特异性的另一种抗体，和(c)如权利要求20中所限定的标准品或校正物制备物。
23.—种诊断方法，包括通过使用利用权利要求1至4中任一项的至少一种抗体，或依照权利要求8的适体或结合剂的测定法来测量患者样品中的PAPP-A蛋白水解活性。
24.酶活性内源或重组PAPP-A，其作为标准品或校正制备物用于依照权利要求23的诊断方法。
全文摘要
本发明涉及一种用于诊断心血管或癌症疾病的方法，其通过检测患者样品中的IGFBP-4(胰岛素样生长因子结合蛋白-4)片段来进行。还公开了特异性识别通过对IGFBP-4的酶依赖性切割起源的新表位的抗体。
文档编号C07K16/18GK102471379SQ201080029212
公开日2012年5月23日 申请日期2010年6月29日 优先权日2009年6月29日
发明者A.B.波斯特尼科夫, A.G.卡特卢卡, A.V.卡利托诺夫, T.I.索罗维瓦 申请人:西特斯特有限公司