蛋白质和多肽的质谱鉴定和定量检测的方法学革新的利记博彩app

专利名称：蛋白质和多肽的质谱鉴定和定量检测的方法学革新的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及蛋白质混合物的分析方法，用于目标蛋白的鉴定和定量检测。更明确的是，本发明涉及到方法上的革新改良，以达到能对微量物质的鉴定和定量检测。
背景技术：
蛋白质组学研究的成功取决于是否能够可靠地定性并定量检测某一生物系统中任何一个蛋白质或一组蛋白。然而，由于常规的生物样品都是含有蛋白质和其他组分的复杂的混合物，使用质谱分析这类样品并不容易。
串联质谱(“MS/MS")系统已经被研发出来用以检测生物样品中的蛋白质。在这类技术中，蛋白质被从样本中分离提取出来，可供选择的手段包括色谱法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术。然后，蛋白质组分经蛋白酶水解，再通过脱盐和浓缩得到多肽组分。所得多肽混合物经质谱仪进行一级质谱分析，即MSl。MSl质谱记录下信号的强度， 其强度与样品中的肽含量相对应。MSl质谱中的目标离子可选择性被分离出来，通过碰撞诱导解离(CID)引发二级质谱事件。碰撞诱导解离(CID)导致选定的肽断裂产生小的片断， 记录这些片断的质谱谱图即二级质谱图(MS》具有肽的特征信息，可通过与数据库进行比较从而对多肽进行鉴定识别。可是，这样的串联质谱(MS/MQ分析系统受MSl质谱分析中仪器对目标肽检测能力的限制，只有相对丰度较高的蛋白质才能被检测到。此外，即使一种特定蛋白质被检测到，其在MSl质谱中的某一特定质/荷比(m/z)的强度也不足以在没有内标物的情况下直接用以定量检测。
质谱仪的定量问题现在通过另一种手段加以解决，那就是添加一个与目标蛋白质或多肽的m/z有一定关系的内标物。定量是通过比较添加至样品中的内标物(其数量为已知)与目标蛋白质或肽的相对强度来实现的。此外，混合物中蛋白质的相对含量也可通过比较多肽在两个不同样品中的相对强度来确定。
目前，搭配稳定同位素标记蛋白质或肽的“鸟枪”质谱(Ms)是一种很有吸引力并被广泛利用的定量蛋白质组学方法。多种将稳定同位素标记引入蛋白质的方法已有报道， 包括代谢标记(例如在细胞培养中利用氨基酸进行稳定同位素标记如“SILAC”)、蛋白质水平的化学衍生(例如同位素编码及亲和标签技术如“ICAT”)或肽水平的化学衍生(例如用以相对和绝对定量的同质元素标记法如“iTRAQ”)、串联质谱标签技术(如“TMT”)、同位素编码蛋白质标记(“ICPL”)以及肽酶标记法等。参见，例如Colzani，Μ.等人，Mol. Cell.Proteomics (2008) 7. 5 :927-937 ；Hanke, S.等人，J. Proteome Res. (2008)7 :1118-1130 ； Thompson, Α.等人，Anal. Chem. 75 :1895-1904 ；Ross, P. L.等人，Mol. Cell. Proteom. 3 1154-1169. Doman，B.等人，Science (2006) 312 :212-217 提供了一篇有关各种基于质谱分析平台的综述。
在SILAC方法中，内标物与目标肽是化学结构一致的肽，通过特定同位素替代进行修饰，因此，质/荷比(m/z)已发生改变，但其色谱分离或化学行为并无变化。例如，内标物通常是所需蛋白质的重同位素形式(即含有诸如15N^O和/或1V等罕见及较重的同位素)。这些重同位素的标准物可添加至初始提取物中，并随目标肽或蛋白质一起介入样品制备和分析。目标肽在MSl中所产生的峰与重内标物的相应峰可直接进行比较，用以量化目标肽。类似方法中，可在样品制备后期掺入重同位素；例如，QconCAT使用串联肽，AQUA 法用肽标准物，或者蛋白质标准物在重水(H218O)中水解。此外，混合物中蛋白质的相对量可使用稳定同位素对蛋白质进行差异标记来测定。Colzani等人描述了 SILAC方法的一种更为复杂的形式，他们采用了重蛋白质的两种同(质量)形式。
虽然这样的鸟枪质谱法量化蛋白质组学平台已被广泛用于量化蛋白质组，但方法的灵敏性、定量的准确性以及可重复性不能满足许多蛋白质组学研究的要求。为了解决这些问题，最近的努力都集中在开发基于质谱来监测特定蛋白质组的方法。预计这些蛋白质组学平台将在不久的将来在临床应用以及基础科学研究中发挥重要作用，特别是可用在不同条件下对蛋白质组进行反复定量。一个特别有希望的目标定量法叫选择反应监测或多反应监测(“SRM”或“MRM”)，该方法运用三重四极杆(QQQ)质谱仪，检测每一目标肽的特定母离子和碎片(子)离子组/队(称为“转化态”)。其他相关方法还包含使用诸如LTQ Orbitrap等高精度扫描质谱仪，运用列入清单的方式对预设母离子进行质谱分析。
然而，这些先进方法仍有其局限性。例如，虽然列入清单法可提供更高灵敏度和重复性，但目标母离子仍必须在MSl全谱扫描时可被检测到以便于产生子离子谱图(MS2或 MS/MS)。这个问题在高复杂性和浓度范围差异大的生物样品中，尤其当目标肽丰度较低时， 就变得很关键了。SRM方法是一种灵敏度高、重复性好、对目标蛋白进行量化的方法，但其应用却受限于必不可少的一步对测定分析的优化过程。这样的优化过程通常包括为每一个目标肽选择最合适的转化态，以及为每一目标肽测定最佳碰撞能量和液相色谱(LC)留柱时间。此外，量化通常是在基于具普通质量精度和分辨率的QQQ仪器上进行的，对每一肽来说，其量化仅由一定数目的转化态来决定，因此，测量精度可能会受到化学杂质和共洗脱离子的影响，尤其表现在对复杂样品的测量中。
现有用于MS2量化的报告离子同重元素标记试剂(例如iTRAQ或TMT)受到以下条件的限制(1)需要在较低质量范围内检测报告离子，这限制了可用仪器的范围；(2)受到具有类似m/z值的共洗脱肽离子的潜在影响。
其他以MS2为基础的使用特定肽的子离子来量化的蛋白质组学方法也有报道。然而，这些方法需要一个放大的前体分离窗(例如10个m/z单位)将轻重同位素标记的前体肽囊括在范围内，用于同时进行CID及随后量化(基于y离子)。虽然使用多个子离子进行量化可提高准确度，但这一优势又会被削弱，因为放宽窗口后碰撞池内存在无关肽离子和更多的化学噪音从而影响定量。
Koehler等人报道了一种在二级质谱中量化同质量肽的方法。Koehler，C.J.等人，J. Proteome Res. 2009，8 (9)，4333-41.在这项研究中，LysC酶水解产生的肽分别由丁二酸酐(Δ O或Δ 4)在N-端、2-甲氧基-4，5- 二氢-IH-咪唑(Δ 4或Δ 0)在C-端赖氨酸残基上进行化学标记，生成同质量肽。尽管同位素标记的同质量肽已被证明对量化有用，但此方法局限于以赖氨酸为末端的肽，同时还需要两步基于胺的标记步骤。更重要的是，蛋白质丰度仅靠Mascot分数半定量估算，而不是经由子离子强度直接测定。
因此，尽管目前有多种针对复杂样品中蛋白质和多肽的鉴定和定量检测的有效策略，仍然需要能够有效鉴定目标肽和蛋白质的蛋白质组学平台，和/或得到通量高、重复性好、且准确的定量检测方法，尤其是在目标浓度较低的情况下。发明内容
一方面，本发明涉及一种用于定量检测目标肽的基于二级质谱的离子定量方法。 在此方法中，目标肽一端(C-端或N-端)经重同位素(“重”)作第一标记修饰，而另一端则由“轻”同位素作第二标记修饰。内标物，或称“MSTIQ标准肽”，系制备产生的与修饰后目标肽质量相同的类似物。就其序列而言，内标物与修饰后目标肽是一致的，(因而内标物在合成反应、采样工作、色谱及提取过程中与修饰后目标肽表现一致)，但在任何情况下对应端均具有重质和轻质标记；在同质量肽对中，成员1的C端重同位素标记与成员2在C端相对应的轻质标记之间的m/z差异(Δm/ζ)，通过成员2的N端重同位素标记与成员1的N 端相对应轻质标记之间的相同Δπι/z得到平衡。本文中，这类同质量肽对的成员也被称作 “轻-重”(“LH”)和“重-轻”(“HL”)肽。将已知浓度的内标物添加至含有修饰后目标肽的样本中，接着用串联质谱对混合物进行分析。
在质谱分析的第一阶段(MSl)，同质量离子对以单一 m/z峰出现；仪器在基本相同 m/z处检测到同质量离子对的两个成员的母离子。这些母离子被选择经CID分裂而用于二级质谱分析。CID过程中产生许多对具特异性序列的子离子对，这些子离子对分别对应于每一对同质量肽的N-端和C-端(例如，b-离子和y-离子)，其质量差异等于同质离子对中重轻同位素标记之间的质量差异。由于任何一对子离子对均来自于该同质量(肽)对的每一个成员，它们的强度比可用来测定修饰后目标肽和内标物的相对量。因为每个肽能够沿着肽骨架分裂并产生相应的子离子，所以分裂模式也被用来鉴别目标肽的序列。参见

图1， 本方法原理概述示意图。
因此，本发明涉及一种样品中目标肽的量化方法，其包含以下步骤(a)对目标肽作如下修饰用重同位素在(1)端作第一标记(A*)，并用轻同位素在(2)端作第二标记(B)， 由此形成(I)型结构A*-肽-B (I);(b)向样品中添加内标物，其中标示肽由与目标肽同序列的肽经如下修饰而组成 ⑴端用轻同位素作第一标记㈧并在⑵端用重同位素作第二标记(B*)，形成(II)型结构A-肽-B* (II)，其中，(A*)与㈧之间的质量差异等于(B)与⑶之间的质量差异，以致于内标物与修饰后目标肽具有相同质量；(c)获得样品的一级质谱；(d)识别与修饰后目标肽和内标物相对应的的一级质谱的离子；(e)对步骤(d)中所识别的修饰后目标肽和内标物离子进行CID分裂，获得其二级质谱；(f)比较修饰后目标肽子离子与内标物子离子的相对强度；以及(g)基于步骤(f)中的比较，从而量化目标肽。
另一方面，本发明涉及一种检测样品中目标肽的标示离子触发分析(“ITA”)方法。在此方法中，将含有修饰后目标肽的样品内掺入标示肽，标示肽是修饰后目标肽的不同同位素形式(具有比修饰后目标肽更轻或更重的同位素)，其数量足以确保一级质谱分析期间对标示肽母离子的检测。作为修饰后目标肽的同位素变种，标示肽在化学合成、采样工作、色谱及提取方法中与修饰后目标肽表现一致。加入标示肽的样品混合物用串联质谱进行分析。在一级质谱分析中，标示肽的母离子出现在与目标肽母离子相差一个已知Δπι/ζ 的地方。由于标示肽丰度在实验中可以被控制，标示肽母离子在MSl被检测到后，质谱仪器经程序设定在测得的标示肽的Δπι/ζ (修饰后目标肽母离子的预期m/z与标示肽母离子预期m/z之间的差异)左右获取MS2质谱，该MS2的获取并不取决于样品中修饰后目标肽的浓度或修饰后目标肽在MSl中的母离子强度。通常经这样的质谱仪的程序设定，可获得在修饰后目标肽的m/z附近较小m/z单位区间(CID分离窗)内的二级质谱。通过对MS2分裂模式进行分析，即可测定样品中是否存在目标肽。
因此，本发明涉及一种检测样品中目标肽的方法，其包含以下步骤(a)对目标肽作如下修饰在(1)端作第一标记(X)并在(2)端作第二标记(Y)，形成(III)型结构X-肽-Y (III)；(b)向样品中添加标示肽，其中标示肽由与目标肽同序列的肽经如下修饰而组成在 (1)端作第一标记(X*)并在(2)端作第二标记(Y*)，形成(IV)型结构 X*-肽-Y* (IV)，其中，(X)、(X*)、(Y)和(Y*)各自独立地含有正常或至少一个重原子同位素，其中标示肽母离子m/z与目标肽母离子m/z之间的差异X足够大，以便标示肽母离子的同位素峰落在八个m/z单位之外，或落在目标肽母离子m/z周围一个较小的CID分离窗之外；(c)获得样品的一级质谱；(d)检测一级质谱中标示肽离子；(e)通过标示肽离子位于χ道尔顿处的 CID分裂，获得二级质谱；并(f)分析表征目标肽子离子的二级质谱。
本发明进一步考虑一种结合ITA和MSTIQ的方法(称为iMSTIQ方法)，用以对目标肽进行检测、识别和量化。参见图2。在此方面，本发明涉及一种分析样品中目标肽的方法，其包含以下步骤(a)目标肽经如下修饰，用重同位素在(1)端作第一标记(C*)、用轻同位素在(2)端作第二标记(D)，形成(V)型结构C*-肽-D (V)；(b)向样品中添加内标物，其中内标物由与目标肽同序列的肽经如下修饰组成在(1) 端经轻同位素作第一标记(C)、在(2)端经重同位素作第二标记(D*)，形成(VI)型结构 C-肽-D* (VI)，其中Cf与C之间的质量差异等于D*与D之间的质量差异，以致于内标物与修饰后目标肽具相同质量；(c)向样品中添加标示肽，其中标示肽由与目标肽同序列的肽，经如下修饰组成(I)用重同位素在(1)端作标记(Cf)、用重同位素在(2)端作标记(D*)，形成(VII)型结构Cf-肽-D* (VII)；或(II)用轻同位素在⑴端作标记(C)并用轻同位素在(2)端作标记(D)，形成(VIII) 型结构C-肽-D (VIII)；其中标示肽母离子m/z与目标肽母离子m/z之间的差异χ足够大，以便标示肽母离子的同位素峰落在八个m/z单位之外，或落在目标肽母离子m/z周围一个较小的CID分离窗之外(e)检测对应于标示肽的一级质谱离子；(f)通过比标示肽母离子的m/z小xfm/ ζ单位处的CID分裂，获得二级质谱；(g)分析表征修饰后目标肽的子离子的二级质谱；(h) 比较修饰后目标肽子离子与内标物子离子的相对强度；(i)并根据步骤(h)中的比较对目标肽进行量化。附图简介
图1. MSTIQ量化策略的示范性实施例的原理概述示意图。肽样品1 (源自测试蛋白质样品)及肽样品2 (市售、肽合成或两者兼而有之)在其C-端经轻(精氨酸和赖氨酸; 白色圆圈)或重(1 -精氨酸或13C61X-赖氨酸；黑色圆圈)氨基酸同位素标记。接着分别用重(黑色五边形)或轻(白色五边形)同位素胺标记试剂处理轻重肽，得到同质量的 HL和LH肽。如图所示示范性MSTIQ胺标记试剂结构。将上述肽混合并进行色谱质谱分析。 MS2中CID之后，生成多个序列特异的子离子对(例如b-离子和y_离子)，其具有4Da的质/荷差异。两种样品中肽的相对丰度由相应子离子对的强度比例来决定。
图2. iMSTIQ策略的MSl阶段的原理概述示意图。掺入肽样品中的标示肽(“HH”) 的检测触发了修饰后目标肽在预定m/z的CID。在两个端部各自含有一个重同位素标记和一个轻同位素标记的修饰后目标肽和内标物(“HL”和“LH”肽)的母离子，均出现在相同的m/z处。
图3.实例5中所述的MSTIQ肽量化试验结果。(a)全扫描MSl光谱(400_1800m/ ζ)，色谱留柱时间59.48min。插图代表性肽“LWTLVSEQTR”的同位素分布谱图([M+2H]2+， m/z688.88)。(b)前体肽形式(a)的全扫描MS2质谱(175-1390m/z)。如图所示多个b_离子对和y-离子对。插图代表性1+子离子对的透视图，相距4Da远；如预计一样，每一对相对峰强度约为1 1。(c)所有七个效价的预期和实际丰度比(In(HL/LH))。如图所示每一效价的中位数(M，点)和分布范围；直方图)。直方图表示分布范围内的数值；每个直方图上、下或旁边的数值分别表示高于、低于分布范围或在分布范围内比值的肽。
图4.实例6中所述ITA检测试验结果。指定数量的八十六个(86)多肽添加至来源于酵母细胞总蛋白提取物的胰蛋白酶水解物，并利用ITA(正方形)或列入清单法(三角形)进行鉴定。图中绘制了由每种方法选择用于CID(虚线)或被鉴定的肽(实线)的百分数与添加至样品中肽的数量的关系。
图5.实例7a中肽的定量检测。图5显示目标肽预期比率(log 10)与MSTIQ内标肽之间的相关性。
图6.实例7b和7c的结果。实例7b (a)全MSl光谱(350-1，800m/z)，色谱留柱时间:41.41min0插图代表性肽“FAISYQEK”的标示肽母离子([M+2H]2+, 572. 3028m/z) 放大图(566-575m/z)。目标肽([M+2H]2+, 568. 2973m/z)及共洗脱非特异性肽([M+2H]2+， 567. 2920m/z)均在CID分离窗内(567. 2-570. 2m/z，直方图)，(b)经(a)中标示肽触发的全MS2光谱(145-1150m/z)。对已经识别的特异性肽子离子对进行标记。目标MSTIQ子离子对强度低于非特异性肽子离子(单个子离子模式)。插图均具有接近1 1相对丰度的代表性子离子对(相距4Da)的MS2光谱放大图。实例7c (c) log(LH/HL)与已知量每一内标(LH)肽(对数级别)比值的曲线。观测到线性回归范围1 ( LH彡30fmol。
图7.实例7c的结果。log(LH/HL)与八个待检肽的已知量LH内标肽(对数) 比值的曲线。将数据代入Iogltl (LH/HL) = lc^1(l(LH)-h (虚线)得到粗制HL肽的量(h)， 其中LH彡3fmol(实心圆；h显示为平均估计值，及2个线性标准误差范围，h = IOu, (10μ_20彡h彡10μ+2°))。注意对于肽DGQLLPSSDYSNIK而言，h不在线性范围内，因此可能不准确(有星号标记)。
图8.实例8的结果。所有六个样品中14个被测试肽的绝对丰度(Y轴)与时间的关系(X轴)。19h时间点处可见对照样品数据，(a)三个非特异性肽的关系图(表1内的组2)。(b)显示出LPS依赖性释放的八个目标肽的关系图，(c)未显示出LPS依赖性释放的三个目标肽的关系图。发明详细描述
术语“标记”是指氨基酸或其他适当的肽修饰化学标记或其组合。例如，标记可能包含一个单独的氨基酸、两个氨基酸、一个非氨基酸化学标记或一个经非氨基酸标记进一步修饰的氨基酸。标记可能是或可能包括部分目标肽序列，例如，可能是或可能包括目标肽的实际C-或N-端残基，或者也可是添加的第二个氨基酸或化学标记，或这个标记可能添加至目标肽序列中。其中标记被添加至目标肽序列时，指被添加到目标肽序列的C-端或 N-端。重同位素标记包含至少一个原子同位素，此原子同位素具有比其天然最丰富质量数更大的质量数(“重原子同位素”)，例如/ 替代12c。重原子同位素具有大于其天然最丰富质量数的质量数，但其原子数相同。与质谱方法有关的是，利用重同位素标记修饰的化合物，将得到一个具有比该化合物天然同位素形式更大m/z的化合物。与相同标记的重同位素类似物相比，轻同位素标记具有更少重原子同位素。同位素“轻”标记可以是同位素正常标记(天然最丰富形式)。因此，术语“重”和“轻”是相对术语。重或轻同位素标记应指稳定原子同位素的标记。
术语“同量异位素”可定义为具有相同质量数但原子数不同的两个或多个原子中的一个。同量异位素具有近似质量，但又不同于精确质量。“同质量肽”是具有相同质量的肽，但在N-端和C-端使用不同稳定同位素进行标记。在这样的“同质量”对中，肽具有相同质量数(因此大致相同的质量)，而且同质量对中一个成员的同位素含量(原子数)的任何增加，可通过同质量对中另一个成员同位素含量的相同增加来达到平衡。例如，目标肽可在其N-端经重同位素标记、在C-端经正常同位素标记。与修饰后目标肽同质量的内标肽则互换轻重同位素进行修饰。
合适的N-端标记包括任何可共价结合至多肽N-端的化学基团。优选的N-端标记为诸如丙氨酸之类的氨基酸、其他包括那些源自mTRAQ 试剂的胺反应化学标记(Applied Biosystems 公司 http//www3. appliedbiοsystems, com/cms/groups/psm support/ documents/Reneraldocuments/cms 054141. pdf)或其重同位素变体。特别优选的N_端标记为丙氨酸、(13C315N)-丙氨酸(所有三个氨基酸碳均用1:3C标记，氨基酸氮则用1N标记)， 以及轻或重的mTRAQ 试剂。11
N-端标记可通过以下方法将目标肽N-端引入或添加至目标序列，例如，诸如氨基酸活化酯形式之类的合适标记试剂或其他胺反应标记试剂的化学反应。
合适的C-端标记包括任何可共价结合至肽C-端的化学基团。在优选实施方案中， C-端标记为蛋白质样品水解后生成的C-端残基的氨基酸。例如，胰蛋白酶通常水解蛋白质得到在C-端具有赖氨酸或精氨酸残基的肽。其他蛋白水解酶可在不同位置分裂蛋白质，得到具有不同端氨基酸的肽。优选的C-端标记为赖氨酸、("C615N2)-赖氨酸(所有六个赖氨酸碳原子均被13C取代，而两个赖氨酸氮原子则被1N取代)、精氨酸或15N4-精氨酸(所有四个精氨酸氮原子被1M取代)。
C-端标记可通过以下方法并入或添加至目标序列中，例如1)重或轻同位素氨基酸代谢标记；幻与重或轻同位素标记进行化学合成；或幻当目标肽C-端残基为精氨酸时， 在轻或重同位素水存在的情况下(例如H218O)，蛋白质样品的胰蛋白酶水解置换完成。
当目标肽含有或添加有C-端赖氨酸或(13C61X)-赖氨酸时，某些N-端标记试剂会同时与肽的N-端以及赖氨酸的侧链氨基发生反应。所述领域的技术人员了解到，为了平衡所需的同位素分布，需要对分析系统中的其他肽进行类似修饰。因此，在某些实施方案中，优选的C-端标记为每个侧链氨基均被丙氨酸或(13C315N)-丙氨酸所修饰的赖氨酸或 (13C615N2)-赖氨酸。更优选的C-端标记为赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、CC615N2)-赖氨酸-丙氨酸或(13C61X)-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸。其他优选的C-端标记为赖氨酸-VTRAQCWRAQ 为mTRAQ标记的重同位素变种)、(13C61X)-赖氨酸-mTRAQ或(1 1 )-赖氨酸-*mTRAQ。 术语赖氨酸-丙氨酸和赖氨酸-mTRAQ及其“重”变种定义为具有连接至赖氨酸侧链氨基酸的丙氨酸或mTRAQ部分。
本发明的优选方案，应在具有高质量精度、高分辨率和高吞吐量的仪器上获得一级和二级质谱。在更优选的方案中，一级和二级质谱可在LTQ Orbitrap仪器上获得。
在本发明的优选方案中，CID分离窗小于8m/z单位。在更优选的方案中，CID分离窗小于3m/z单位。在更进一步的优选方案中，CID分离窗介于lm/z单位与3m/z单位之间。MSTIQ方法
在MSTIQ方法的优选方案中，每个肽的(1)端为其C-端，而每个肽的⑵端为其 N-端。在其他优选方案中，每个肽的⑴端为其N-端，而每个肽的⑵端为其C-端。
所属领域技术人员意识到㈧、(A*)、⑶及(B)可以是任何合适的化学标记，其任何一个均可含有零个或多个重原子同位素，只要所得到的修饰后目标肽和内标物质量相同。
在优选方案中，每个肽的⑴端为其C-端，㈧和(A*)各自独立地为赖氨酸、 赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ或精氨酸或其任何同位素标记变种，而(B)和(B*)则各自独立地为丙氨酸或mTRAQ或其同位素标记变种。在优选方案中，每个肽的(1)端为其 C-端，(A)为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C^N2-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ、赖氨酸-VtraqJ3C61X-赖氨酸-mTRAQ或精氨酸，(α*)为13C^n2-赖氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-mTRAQ、 3C61X-赖氨酸-VTRAQ或1X-精氨酸。在更优选方案中，每个肽的(ι)端为其c-端，每个肽的( 端为其N-端，(A)为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C615N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-rnTRAQ、赖氨酸-VTRAQ J3C61X-赖氨酸-mTRAQ或精氨酸，(A*)为 13C615N2-赖氨酸、13C^N2-赖氨酸-丙氨酸、13C^N2-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-mTRAQ、1^;1、-赖氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸，(B*)为(13C315N)-丙氨酸或源自同位素重mTRAQ试剂，而(B)为丙氨酸或mTRAQ试剂的同位素轻试剂。在其他更优选方案中，每个肽的⑴端为其C-端，(A)为赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸，(A*)为13C61X-赖氨酸-丙氨酸， ⑶为丙氨酸，而(B)为(13C315N)-丙氨酸。
在优选方案中，每个肽的(1)端为其N-端，(B)和(B*)各自独立地为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ或精氨酸或其任何同位素标记变种，而(A)和(A*)则各自独立地为丙氨酸或mTRAQ或其同位素标记变种。在更优选方案中，每个肽的(1)端为其 N-端，(A)为(13C315N)-丙氨酸或源自同位素重mTRAQ试剂，而(A)为丙氨酸或mTRAQ试剂的同位素轻变种。在其他更优选方案中，每个肽的⑴端为其N-端，(A,为(13C315N)-丙氨酸或源自同位素重mTRAQ试剂，(A)为丙氨酸或mTRAQ试剂的同位素轻变种，每个肽的 (2)端为其C-端，(B)为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ、赖氨酸-VtraqJ3C61X-赖氨酸-mTRAQ或精氨酸，而(B)为 13C615N2-赖氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-mTRAQ、13c6' 赖氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸。在其他更优选方案中，每个肽的(ι) 端为其N-端，㈧为丙氨酸，(Α*)为(13C315N)-丙氨酸，每个肽的⑵端为其C-端，⑶为赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸，而(B)为13C61X-赖氨酸-丙氨酸。ITA方法
在ITA方法的优选方案中，每个肽的⑴端为其C-端，而每个肽的⑵端为其 N-端。在其他优选方案中，每个肽的(1)端为其N-端，而每个肽的⑵端为其C-端。
所述领域技术人员意识到(X)、(X*),⑴和(Y*)可以是任何合适的化学标记，其中每一者均可含有零个或多个重原子同位素。
在某些实施方案中，⑴和⑴均为轻同位素。在那些⑴和⑴为轻同位素的方案中，(X*)和(Y*)应优选为重同位素。在那些(X)和(Y)均不具有重原子同位素、标记为部分目标肽序列的方案中，所述领域技术人员认识到结构X-肽-Y与目标肽结构，在化学、 同位素上是一致的。
在ITA方法的其他优选方案中，如上述MSTIQ方法中所述，目标肽一端(C-端或 N-端)经重同位素作第一标记(“重”)修饰，而另一端则经轻同位素作第二标记(“轻”) 修饰。标示肽与修饰后目标肽完全一致，但两个标记均为“重”或“轻”变种。本文中这些优选标示肽也称作“重-重”(“ΗΗ”)肽。在其他优选方案中，⑴和⑴中一者为轻同位素，而另一者则为重同位素，而(X*)和(Y*)两者均为轻同位素或均为重同位素。作为首选， (X*)和(Y*)两者均为重同位素。
因此，在优选方案中，每个肽的(1)端为其C-端，(X)为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、 13C615N2-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、赖氨酸-HiTRAQJ3C61X-赖氨酸-mTRAQ、 赖氨酸-VTRAQ或精氨酸，而(χ*)为13C61X-赖氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-mTRAQ、13C61X-赖氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸。在更优选方案中，每个肽的(1)端为其C-端，每个肽的( 端为其N-端，(X)为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、赖氨酸-HITRAQJ3C61X-赖氨酸-mTRAQ、赖氨酸-VTRAQ或精氨酸，(Y)为丙氨酸或mTRAQ试剂的同位素轻质变种，(χ*) 为13C61X-赖氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、"(;1 -赖氨酸-HiTRAQj3Cf^2-赖氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸，而(Y*)为(13C315N)-丙氨酸或源自同位素重mTRAQ试剂。在其他更优选方案中，每个肽的(1)端为其C-端，每个肽的(2)端为其N-端，⑴为13Cf^N2-赖氨酸-丙氨酸或赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸，⑴为丙氨酸，(X*) 为13Cf^2-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸，而(Y*)为(13C315N)-丙氨酸。
在优选方案中，每个肽的⑴端为其N-端，(X*)为(13C315N)-丙氨酸或源自同位素重mTRAQ试剂，而(X)为丙氨酸或mTRAQ试剂的同位素轻变种。在更优选方案中，每个肽的⑴端为其N-端，(X*)为(13C315N)-丙氨酸或源自同位素重mTRAQ试剂，⑴为丙氨酸或 mTRAQ试剂的同位素轻变种，每个肽的⑵端为其C-端，(Y*)为13C6%2-赖氨酸、1^1 -赖氨酸-丙氨酸、13C^N2-赖氨酸- (13C315N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-mTRAQ、13C^N2-赖氨酸-VTRAQ或1X-精氨酸，而(Y)为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、13Cf^N2-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、赖氨酸-HiTRAQJ3C61X-赖氨酸-mTRAQ、赖氨酸-VTRAQ或精氨酸。 在其他更优选方案中，每个肽的⑴端为其N-端，(X*)为(13C315N)-丙氨酸，⑴为丙氨酸， 每个肽的⑵端为其C-端，(Y*)为13Cf^2-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸，而⑴为13Cf^N2-赖氨酸-丙氨酸或赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸。
在优选方案中，χ大于或等于+3道尔顿，或小于或等于-6道尔顿。
在其他实施例中，步骤(e)进一步包括对标示肽离子进行CID分裂获得二级质谱。 iMSTIQ 方法
在某些实施方案中，每个肽的(1)端为其C-端，而每个肽的(2)端为其N-端。在其他实施方案中，每个肽的(1)端为其N-端，而每个肽的(2)端为其C-端。
所属领域技术人员意识到(C)、(C*)、⑶和(D)可以使任何合适的化学标记，其任何一个可以含有零个或多个重原子同位素，只要所得的修饰后目标肽和内标物质量相同。
在某些iMSTIQ方法的实施方案中，(VII)型结构中的标记(C*)和(D)可能比(V) 和(VI)型结构中的化学标记(C*)和(D)要重。换句话说，当所有(C)或⑶型标记同位素一致时，标示肽中重标记的(Cf)和(D*)同位素含量可能大于修饰后目标肽或内标肽中同位素含量。
在iMSTIQ方法的优先实施方案中，每个肽的⑴端为其C-端，而每个肽的⑵端为其N-端。
在优先实施方案中，每个肽的(1)端为其C-端，(C)和(Cf)各自独立地为赖氨酸、 赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ或精氨酸或其任何同位素标记变种，而(D)和(D*)则各自独立地为丙氨酸或mTRAQ或其同位素标记变种。在更优先实施方案中，每个肽的(1)端为其C-端，(C)为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、赖氨酸-IiiTRAQJ3C61X-赖氨酸-mTRAQ、赖氨酸-VTRAQ或精氨酸，而(Cf)为13Cf^N2-赖氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-mTRAQ、 13C61X-赖氨酸-VTRAQ或1\-精氨酸。在更优先实施方案中，每个肽的(ι)端为其c-端， 每个肽的( 端为其N-端，(C)为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、13C^N2-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、赖氨酸-HiTRAQJ3C61X-赖氨酸-mTRAQ、赖氨酸-VTRAQ或精氨酸，(C*) 为13C615N2-赖氨酸、13C615N2-赖氨酸-丙氨酸、13C615N2-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C615N2-赖氨酸-HITRAQJ3C5I-赖氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸，(D*)为(13C315N)-丙氨酸或源自重同位素 mTRAQ试剂，而(D)为丙氨酸或mTRAQ试剂的轻同位素变种。在其他更优先实施方案中，每个肽的⑴端为其C-端，每个肽的⑵端为其N-端，(C)为赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸，⑶ 为丙氨酸，式(V)中的(C*)为13C61X-赖氨酸-丙氨酸，式(VII)中的(Cf)为13Cf^N2-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸，而(D)为(13C315N)-丙氨酸。
在优先实施方案中，每个肽的(1)端为其C-端，(D)和(D*)各自独立地为赖氨酸、 赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ或精氨酸或其任何同位素标记变种，而(C)和(Cf)则各自独立地为丙氨酸或mTRAQ或其同位素标记变种。在优先实施方案中，每个肽的(1)端为其 N-端，(C*)为(13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ试剂，而(C)为丙氨酸或mTRAQ试剂的同位素轻变种。在其他更优先实施方案中，每个肽的⑴端为其N-端，(C*)为(13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ试剂，(C)为丙氨酸或mTRAQ试剂的轻同位素变种，每个肽的(2) 端为其C-端，(D)为13C61X-赖氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、"C6I-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-HITRAQJ3C61X-赖氨酸-VTRAQ或1X-精氨酸，而⑶为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、赖氨酸-HITRAQJ3C61X-赖氨酸-mTRAQ、赖氨酸-Vtraq或精氨酸。在其他更优先实施方案中，每个肽的(ι)端为其 N-端，(C*)为(13C315N)-丙氨酸，(C)为丙氨酸，每个肽的(2)端为其C-端，式(VI)中的 (D)为13C61X-赖氨酸-丙氨酸，式(VII)中的(D)为13Ce1X-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸， 而⑶为赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸。
在其他实施方案中，iMSTIQ方法中步骤(f)进一步包括对标示肽离子作CID分裂获得其二级质谱。通用方法
同位素标记的内标肽和标示肽的制备重同位素肽可由市售获得，或可利用重 (轻)同位素标签试剂，采用标准的多肽合成方法制得。例如，为了在N-端引入重同位素标记，肽可与重同位素标记的活化氨基酸(例如Boc-(13C315N)-Ala)-Osu，参见实例1 ；“Su” 为琥珀酰亚胺)反应，或直接与重mTRAQ 试剂(产于Applied Biosystems，加州，Foster city)反应。轻同位素多肽可由市售或由标准肽合成方法制得。
样品制备蛋白质样品由个别蛋白或蛋白混合物组成，可源自诸如细胞提取物、血清或其他体液等任何适当来源。蛋白质通常经由胰蛋白酶等适合的蛋白酶，通过标准方法水解而生成一种或多种目标肽，此多肽混合物进一步由C18色谱进行脱盐。
目标肽的修饰为在C-端引入标记，作为范例，蛋白质样品可在相应的SILAC培养基中生长制备。SILAC-特异性的培养基如RPMI-1640培养基(产于Caisson Laboratories, 犹他州，North Logan)，含有同位素重或轻标记的氨基酸，例如赖氨酸和精氨酸及其各种重质变种。此外，C-端标记也可在蛋白质样品水解过程中(之前或之后)进行。为引入N-端标记，水解后的多肽混合物被悬浮于适当缓冲液中，接着用N-端标记试剂(例如轻或重标记的活化氨基酸酯或mTRAQ 试剂)处理。标记试剂上的任何保护基团可用常规的去保护方法去除。随后，样品通常经过Cw色谱纯化。
液相饩谱-质谱分析已知数量的MSTIQ标准肽和(或)ITA标示肽与修饰后目标肽混合。添加内标物的数量以等同于修饰后目标肽的数量为好。然而，因为定量检测在约 1000倍浓度范围内呈线性关系，所以浓度有效范围很大。标示肽的添加水平以能够产生强15烈质谱信号为准，最好是高于噪音约50倍的水平。混合物利用LTQ-Orbitrap 仪器(Thermo Scientific)通过纳米色谱串联质谱进行分析，也可在液质联用(LC-MQ分析前通过强阳离子交换色谱对样品进行分离。
另外，利用LTQ Orbitrap，肽样品经反相HPLC (Agi lent 1100系列)电喷雾电离 LC-MS 分析。HPLC 柱(75 μ mX 15cm)装载有 C18 树月旨(Magic C18 AQ 5 μ m, Michrom BioResources公司，加利福尼亚州奥本)。多肽通过由缓冲液A(0. 1 %甲酸)至缓冲液 B(0. 甲酸，99. 9%乙腈)的浓度梯度来分离8-25%缓冲液B，(ITA实验)或 53min (MSTIQ和 iMSTIQ 实验)；25-35%缓冲液B，6min (ITA 实验)或 IOmin (MSTIQ和 iMSTIQ 实验)；35-80%缓冲液B，8min (ITA实验)或IOmin (MSTIQ和iMSTIQ实验)。应用固定流速350nl/mino
一般来说，通过在400m/z处分辨率为30，000的Orbitrap获得MSl扫描。除MSTIQ 检定以外，MS2扫描则利用正常扫描模式通过LTQ获得，MSTIQ检定中，MS2扫描通过在 400m/z处分辨率为7，500的Orbitrap获得。对于每一 Orbitrap MSl扫描而言，在最长不超过500ms时间内累积到5 X IO5个离子。对于每一 LTQ MS2扫描而言，最长不超过250ms 时间内累积到5X IO3个离子。对于每一 Orbitrap MS2扫描而言，最长不超过1000ms时间内累积到2X IO5个离子。CID碰撞能量规范设置为35%的能量。
在ITA方法中，在列入清单的标示肽m/z的20ppm窗口内检测到离子将触发MSTIQ 肽的二级质谱分析。检测到符合输入标准的m/z离子时，在远离标示肽离子的设定m/z离子处获取MS2扫描。例如，对于带有+2电荷的标示肽离子而言，其m/z和修饰后目标肽相差4个单位，仪器可设定在比标示肽m/z小4. 5个单位处且位于两个道尔顿窗口内获取离子。通过精确的质量测量、液相色谱(LC)留柱时间及标示肽单同位素m/z的小峰-1/z单位的存在，很容易在质谱中识别标示肽。这一小峰是由于制备标示肽的重同位素标记试剂中含有微量轻同位素杂质造成的。这些独一无二的标示肽特征已经被实验观测到(参见， 例如，实例7b及相关图)。
肽的鉴定和定量检测可利用SEQUEST数据库搜索算法，自MS2数据中对肽进行鉴定(Eng，J. K.，等人，J. Am. Soc. Mass Spectrom. (1994)5 :976-989).对于定量分析而言，标示肽的洗脱图谱可用来鉴别正确的MS2扫描以用于量化的目的。其次，获取修饰后目标肽和内标物的所有预定特异性肽的子离子对的离子强度，并测定每一子离子对的丰度比。针对所有子离子对的比值取一平均值。离群值可被检测到并被除去。就每一特定肽而言，对来自所有MS2扫描所测得的丰度比值，取一平均值即得最终肽比值。
为了计算肽丰度比，每一子离子对强度i可按A=进行计算，同时利用 “绝对差中间值原则”检测离群值(参见Wilcox，R. R. Introduction to Robust Estimation and Hypothesis Testing,第二版，Elsevier Academic Press, 2005,第 101 页)如果Xi-Ml > 3. 321*m，则Xi为离群值；常数3. 321的选择有5%的机会与从一个正常分布样品中去除非离群值相吻合，其中 M = HiediankJ 和Hi = MAD(Xi) = 1. 4826*median{| Xi-M|}表示基于样本中间值绝对偏差的标准差稳健估计(R中间值函数)。每个识别肽的最终量化为去除离群值后的平均IxJ。这种“修剪”平均估计具有已知标准差 恭·,其中 为Winsor 化方差(参见Wilcox，supra，第63页)。最终，只有至少两个MSTIQ标记子离子对得到了修剪平均值，肽才考虑为“可被量化的”。如果强度大于等于SNR*BG，则认为观测到MSTIQ离子；除非另外规定，SNR等于2。某些潜在的MSTIQ碎片对可因为以下三个理由中的一个从量化中去除⑴去除所有b1+和y1+子离子对；(2)去除在另一预定MSTIQ离子士 1. 5Da范围内、含有预定m/zMSTIQ离子的任何子离子对，或预定离子的中性丢失(b-离子，丢失NH3 ； y-离子，丢失H2O)；以及(3)去除任何至少一个MSTIQ离子强度未被观测到的子离子对。如果一个离子的强度(源自HL或LH)高于背景信号强度，且离子对强度均为非零强度，子离子对通常被视为可量化的。
对于iMSTIQ检定而言，利用所述的MSTIQ相同条件，获得定量自动扫描选择。此外，标示肽离子洗脱图谱被用来辅助进行扫描选择。也可提取预定单同位素标示肽离子峰的离子强度(士20ppm)，以及+1/z和-1/z强度峰值。区分洗脱的标示肽离子与其他离子可基于以下两个标准。首先，如果预定标示肽离子单同位素峰强度存在0. 05-0. 35x (-1/z峰) 和0.5-1. (+1/z峰)的强度，则认为扫描含有标示肽离子。其次，仅考虑MSl中标示离子强度大于标示离子洗脱峰值的10%而触发的MS2扫描。那些不满足这类具有高强度和共洗脱标示离子条件的MS2扫描将被除去。除了这些差异外，扫描质谱的选择和定量检测与 MSTIQ相同。实例7中iMSTIQ研究自动选择扫描质谱进行分析，而实例8巨噬细胞研究中则依靠完全手动选择扫描质谱进行分析。实例
以下实例仅作说明本发明用，而非限制本发明。 实例1Boc-L-丙氨酸N- 丁二酰亚胺酯(Boc-Ala-OSu)的制备
为了制备轻同位素MSTIQ试剂Boc-Ala-OSu，Boc-丙氨酸(1当量，NovaBiochem 公司)、N-羟基丁二酰亚胺(1当量，Sigma公司，密苏里州圣路易斯)及N，N' - 二异丙基碳二亚胺(DIC，1当量，Sigma公司)的混合物溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF，0. 3M，Fisher 公司)，室温下培养过夜。过夜培养后，含有Boc-Ala-OSu的上清液分离后直接使用。或者， Boc-Ala-OSu 也可购自 Sigma-Aldrich 公司。
重同位素MSTIQ试剂，Boc- (13C315N) -Ala-OSu,可利用上述方法由同位素标记 Boc-(1V315N)-Ala(马赛诸塞州，安杜佛，Cambridge Isotope Laboratories 公司)制成。实例2用MSTIQ N-端标记试剂进行目标肽的标记
根据标准方法由巨噬细胞裂解物制备胰蛋白酶肽。
在不断搅拌中，向0. 5M HEPES缓冲液(pH 8，20 μ L)胰蛋白酶肽(30 μ g)悬浮液中滴加Boc-(13C315N)-Ala-OSu (30 μ L，0. 15M，溶于DMF)。培养；35分钟后，在不断搅拌中添加浓盐酸(45 μ L)对混合物进行处理。室温下30分钟后，混合物在冰上冷却，并用IM Tris 碱(pH 8. 3，50 μ L)处理以去除未反应的MSTIQ试剂。在不停地漩涡震荡混合下，重复滴加 IM NaOH(5χ 156 μ L)以中和部分酸，直至pH值达3左右。接着利用Cw色谱纯化标记肽。实例3MSTIQ标准肽的制备
变化1包含目标肽序列、具有轻同位素C-端赖氨酸标记的肽可通过标准肽化学方法制备或购买(Peptide 2. O Inc.，Chantilly, VA ；Genscript Co.，Scotch Plains, NJ)。 对于本文中所述实验，可购买到粗制纯度水平的轻肽。接着如实例3中所述，通过与重同位素MSTIQ试剂(B0c-(13C315N)-Ala-OSu)反应对肽进行标记并纯化。
变化2具有N-端丙氨酸残基和重同位素C-端13C615N-赖氨酸残基的MSTIQ标准肽可在市场上购买(Sigma公司；纯度> 95% ；同位素含量98% 13C, 98% 15N)。实例4ITA标示肽的制备
如下制备源自目标肽序列、在N-端修饰有重同位素丙氨酸残基、在C-端修饰有重同位素赖氨酸残基的示范性ITA标示肽缺乏N-端丙氨酸残基但拥有C-端重同位素赖氨酸残基(13C615N)的肽可购自市场(Sigma公司；纯度> 95%;同位素含量98% 13C, 98% 15N)。 如实例2所述，通过与同位素重MSTIQ试剂(Boc- (13C315N) -Ala-OSu)反应对肽的N-端进行标记。实例5MSTIQ法定量检测评估
通过测量小鼠巨噬细胞中蛋白质的相对水平、并将这些测量结果与已知水平进行比较来评估MSTIQ量化。
实例5a 37°C下，RAW264. 7 细胞(ATCC，Manassas, VA)生长在 5% CO2 SILAC 特异性RPMI-1640培养基(犹他州北洛根Caisson实验室)中，并用10%透析胎牛血清(加利福尼亚州，圣迭戈，Invitrogen公司)Λ% Pen/Strep (Invitrogen公司)、2mM L-谷氨酰胺 anvitrogen公司)以及添加的轻Lys-Arg氨基酸或重Lys (13C^N2)-Arg (15N4)氨基酸进行补充。如下分别批次处理“重” “轻”样品经过五次传代后，在收获前4小时，利用IOOng/ ml LPS(Sigma公司)激活细胞。收集的细胞在冰上于25mM HEPESU50mM NaCl、5mM MgCl2, 1% TritonX-100,0. 05% SDSUmM EDTA和蛋白酶抑制剂混合物(Roche)中裂解30分钟。 4°C下，以18，200g的转速离心IOmin后，进一步处理之前收集的细胞裂解物上清液，并贮存于-80°C下。利用 lmg/ml(w/v) RapiGest (Waters，Milford, ΜΑ)和 0· SDS (Mediatech, 彻111(1011，￥4)，使细胞裂解物中的蛋白质在951下变性101^11，用51111 TCEP(三(2-羧乙基) 膦，Thermo Scientific，Waltham，ΜΑ)使其在60°C下还原lh，接着利用12. 5mM碘代乙酰胺 (Sigma)在黑暗中进行烷基化，历时30min。样品在经IOOmM TEAB (三乙基碳酸氢铵，Thermo Scientific)稀释10倍后，加入测序级修饰胰蛋白酶(Promega)以酶/基质比1 50 (w/ w)消化，37°C下过夜。接着将所得重或轻肽(经SILAC在C-端标记过)分别用轻(Δ 0)或重(A4)mTRAQ 试剂(Applied Biosystems公司)进行标记，生成同质量肽。
这两种同质量肽样品以1 30、1 IOU 3、1 1、3 UlO 1和30 1的比率进行混合。混合物进行^-|^/^3分析之前，先在此14洗脱板(Waters)上纯化。混合物通过基于强度的数据依赖性采集(DDA)，并随后进行X ！ Tandem搜索，对其构成的多肽进行分析识别。应用DDA模式在每个MSl扫描中检测到的最丰富母离子上进行4次MS2扫描。选择信号超过500计数的MSl离子用于CID。使用l.Om/z的分离窗，动态剔除所选择的母离子，为期60s。
利用上述X ！ Tandem软件，在小鼠国际蛋白质指数(IPI)数据库(v. 3. 56) 对七个数据集进行两次搜索，并加入反相序列作为随机对照。查询参数变化如下在 Cys (+57. 021464)进行固定修饰；对N-端(+144. 1021)和Lys (+144. 1021)上的固定修饰进行一次查询，以说明 HL 肽修饰；对 N-端(+140. 095)、Lys (+148. 1092)和 Arg (+3. 98814)上的固定修饰进行其他查询，以说明LH肽修饰。利用TPP软件处理查询数据，完成肽的鉴定。
使用ISBquant软件(可自系统生物学研究所索取)，对在七个效价中至少有一个可被高可信度地确定和鉴别的肽(符合胰蛋白酶水解完全模式，不含有不完全酶解位点， 带有+2和+3价电荷，P^tideftOphet概率> 0. 9)进行定量分析。除了这些正确识别的扫描质谱外，ISBquant也考虑了其他质谱的量化，包括理论和测量m/z均在0. 5单位范围内， 且质谱中观测到至少有7个HL或7个LH子离子均在背景水平以上的质谱(BG，定义为扫描中所有非零强度的25% )。这使得一些不能超过0. 9的P印tideProphet阈值的肽也可被定量分析。质谱的选择进一步受到识别最高质量的扫描质谱的限制，而仅比最高质量质谱保留时间小于士 Imin的质谱才可用于量化。出于这个目的，扫描质谱的质量可由观测到的 HL或LHMSTIQ离子的数量(数额较大)来判定；其关系被每一扫描中的中位观测MSTIQ离子强度破坏。除了自动选择扫描质谱(应用于图3)外，ISBquant可以由用户手动选择扫描质谱进行定量分析。
此实验结果如图3所示。图3(a)显示了全MSl扫描，而图3(b)显示了一个代表性肽“LWTLVSEQTR”的MS2光谱，其在1 1混合物中被识别。同质量MSTIQ标签肽对的单同位素峰[M+2H]2+出现在MSl光谱的688. 88m/z处。这个母离子的分裂在MS2光谱中产生了一系列可看做同位素对的b-离子和y-离子。三个有代表性子离子对(b4+、y7+和y9+) 的光谱如放大图中所示(插图)。每一子离子对观测到两个经四个m/z单位隔离的峰，并且正如试验设计，其相对峰强度约为1 1。
每一效价比列的实验中HL和LH肽的相对丰度，通过在至少一个效价内检查总计 1080 个明确识别的肽(PeptideProphet ρ 彡 0. 9,FDR ^ 1. 5% )来评估。ISBquant (同质量量化)软件(系统生物学研究所提供)利用可定量特异性肽子离子对强度，来计算每一肽的丰度比(HL/LH)。每一效价比列中量化的所有肽的比率均归纳在图3(c)中。在相对丰度的全范围(1 30至30 1)内，观察到MSTIQ实测比率和预期比率之间线性关系(R2 =0.9992)良好。该方法的准确性由计算中位数的两个标准差内的个别肽量化直方图来显示；50%的量化具有小于等于13%的相对偏差。参见图3(c)。
这些结果表明，MSTIQ是一个供较宽动态范围内对复杂混合物中的肽进行准确定量的有效方法。实例6ITA方法对灵敏度改善
将ITA肽检测方法的灵敏度与列入清单法的灵敏度进行比较。用对预定肽选择进行MS2分析并识别该肽的能力来评估此方法。
收获YPD培养基中生长至对数期的酵母菌株(BW741，Mata, his3Al, leu2A0, metl5 Δ 0,uraS Δ 0)，并用含有蛋白酶抑制剂混合物(Roche公司，德国曼海姆)的裂解缓冲液(50mM HEPES, pH8. 0,1% SDS, 150mMNaCl)中进行裂解。接着将蛋白质提取物进行丙酮沉淀，然后溶于含有IM尿素的IOmM Tris盐酸缓冲液(pH 8. 0)。接着利用5mM DTT处理蛋白质混合物，随后利用15mM碘乙酰胺进行烷基化，胰蛋白酶水解过夜。胰蛋白酶水解肽用于质谱分析之前，先经Cw离心柱(Nest集团公司，马萨诸塞州，索斯巴勒)纯化。
与小鼠或人类蛋白质相对应的六十五个含有赖氨酸端基的AQUA 肽，经6mM甲基硫代磺酸甲酯(MMTS)进行烷基化，接着按照厂家说明，以重(Δ4)或轻(AO)mTRAQ· 试剂 (Applied Biosystems公司)来进行标记，生成具有8Da质量差异的重轻同质量肽。另有二十一赖氨酸端基AQUA 肽(重质形式)及其合成轻质肽变种也包括在内。将500fmol 肽重质变种(标示肽)添加至Iyg酵母肽混合物中，而肽轻质变种(“经修饰的目标肽”， 用作修饰后目标肽)以在四个实验中每一个的浓度都不同的较低飞摩尔(fmol)水平添加到样品中(0. 75,3. 75,7. 5 或 15fmol)。
分别利用LTQ-Orbitrap仪器，通过ITA法或列入清单法对样品进行分析。对每个 MSl扫描可获得五个MS2扫描。MS2分析的阈值设置为2，000，对每1个事件动态剔除设定在10秒，并使用1. lm/z CID分离窗。的用于电荷状态检查仅将带+2或+3电荷离子进行分析。在列入清单方法中，修饰后目标肽m/z置于原始列入清单上，在此m/z上的离子检测触发了该m/z上离子的分裂。对于ITA来说，将标示肽离子的m/z值置于原始列表上，在此标示离子m/z上的离子检测也会触发此修饰后目标肽m/z上的离子分裂(例如Δπι/ζ ="4m/z单位，带+2个电荷的离子)。对于带+2个电荷的离子，“添加/减去”功能设置为 “-4. 0000”;对于带+3个电荷的离子，则应用“-2. 6667”。利用X ！ Tandem，针对酵母数据库，辅以目标肽序列，对两次分析数据进行搜询。从每次分析中得到的正确识别的肽如补充表1中所示(FDR < 5% )。
针对酵母菌数据库(yeast, nci. 20080206)，利用X ！ Tandem，辅以目标肽序列， 对所得MS2进行搜询。应用以下搜询参数全胰蛋白酶裂解特异性；质量差前体离子 士20ppm，子离子0. 4Da ；不允许存在漏切位点；在Cys (+45. 9877Da)进行固定修饰，在 Met (+15. 9949) ,Lys (+148. 1092)和N-端(+140. 095)进行差异修饰。利用 Trans Proteomic Pipeline 软件(TPP, http//tools, proteomecenter. orR/wiki/index, php ？ title = Software :TPP)处理查询数据，完成肽的识别。
如图4总结，就正确选择用于MS2分析的目标肽及其明确识别而言，在四个效价试验中，ITA均较列入清单法更为出色。当分析最低数量的目标肽时，ITA方法的性能尤为强劲。在含有0.75fmol目标肽的样本分析中，ITA正确触发了 97%目标肽的MS2分析，而列入清单法仅正确地触发了肽的MS2分析。这一触发方面的改进反映为肽识别率有所改善当分析样品中含有0.75fmol目标肽时，经由ITA法，48%的肽被识别出来，而使用列入清单法则只有19%肽被识别。重要的是，在所有四个实验中，ITA始终显示出较高的正确 MS2触发率(分别是96. 51%、97. 67%、98. 84%和98. 84%)。这些结果表明ITA确保了目标肽MS2事件的可靠触发，并表明ITA显著改善了肽识别率。实例7iMSTIQ方法定量限的测定
将MSTIQ标记肽掺入分离自人血清的糖肽样品，来估算iMSTIQ定量极限(LOQ)。
人血清(10mg，137 μ L ；纽约希克斯维勒Bioclamation公司)如前所述，用于N-糖肽的基于酰胼的固相捕获(Tian，Y.，Zhou，Y.，Elliott，S.，Aebersold，R. & Zhang，H. N-连接糖肽的固相提取。Nat Protoc 2,334-339(2007)).所得N-糖肽混合物溶于137 μ 1 0. 甲酸。
实例7a对于目标肽(SQVQASYIFK)而言，如下法所示制备同质量MSTIQ肽对(LH， HL)和标示肽。MSTIQ肽的制备
权利要求
1.样品中目标肽的定量检测，包含以下步骤(a)对目标肽作如下修饰用重同位素在 ⑴端作第一标记(A*)，用轻同位素在⑵端作第二标记(B)，由此形成⑴型结构A*-肽-B (I);(b)向样品中添加内标物，其中内标物由与目标肽序列相同的多肽组成并经如下修饰 用轻同位素在(1)端作第一标记(A)，用重同位素在( 端作第二标记(B*)，形成(II)型结构A-肽-B* (II)，其中，(A*)与㈧之间的质量差异等于(B)与⑶之间的质量差异，以致于内标物与修饰后的目标肽质量相等；(c)获得样品的一级质谱；(d)识别与修饰后目标肽和内标物相对应的一级质谱的离子；(e)对步骤(d)中所识别的修饰后目标肽和内标物离子进行CID分裂，获得其二级质谱；(f)比较修饰后的目标肽子离子和内标物子离子的相对强度；(g)基于步骤(f)中的比较，从而量化目标肽。
2.在权利要求项1的方法中，每个肽的⑴端为其C-端，每个肽的⑵端为其N-端。
3.根据权利要求项1中所述的方法，其中每个肽的(1)端为其N-端，每个肽的(2)端为其C-端。
4.根据权利要求项1中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其C-端，(A)和(A*)各自独立地为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ、或精氨酸或其任何同位素标记变种，而 ⑶和(B)则各自独立地为丙氨酸或mTRAQ或其同位素标记变种。
5.根据权利要求项1中所述的方法，其中每个肽的(1)端为其C-端，(A)为赖氨酸、 赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ、赖氨酸-VTRAQJ3C61X-赖氨酸-mTRAQ或精氨酸，而QO为13C^N2-赖氨酸、13C^N2-赖氨酸-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-mTRAQ、13C61X-赖氨酸-VTRAQ 或 15N4-精氨酸。
6.根据权利要求项1中所述的方法，其中每个肽的(1)端为其C-端，每个肽的(2)端为其N-端，(A)为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13Cf^N2-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ、赖氨酸-VTRAQj3C61X-赖氨酸-mTRAQ或精氨酸，(A*)为13C^N2-赖氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-mTRAQ、 13Cf^2-赖氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸，(B*)为(13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ试剂，而(B)为丙氨酸或mTRAQ试剂的轻同位素变种。
7.根据权利要求项1中所述的方法，其中每个肽的(1)端为其C-端，㈧为赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸，(A)为13C61X-赖氨酸-丙氨酸，⑶为丙氨酸，而(B)为(13C315N)-丙氨酸。
8.根据权利要求项1中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其N-端，⑶和(B)各自独立地为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ、或精氨酸或其任何同位素标记变种，而 (A)和(A*)则各自独立地为丙氨酸或mTRAQ或其同位素标记变种。
9.根据权利要求项1中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其N-端，(A*)为 (13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ试剂，而(A)为丙氨酸或mTRAQ试剂的轻同位素变种。
10.根据权利要求项1中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其N-端，(A*)为(13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ试剂，(A)为丙氨酸或mTRAQ试剂的轻同位素变种，每个肽的⑵端为其C-端，(B)为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、 13C615N2-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ、赖氨酸-VTRAQj3C61X-赖氨酸-mTRAQ或精氨酸，而(B)为13C6I-赖氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、 13C615N2-赖氨酸-mTRAQ、1:3C6' 5N2-赖氨酸-VTRAQ 或 15N4-精氨酸。
11.根据权利要求项1中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其N-端，㈧为丙氨酸， (A*)为(13C315N)-丙氨酸，每个肽的⑵端为其C-端，⑶为赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸，而 (B*)为13Cf^N2-赖氨酸-丙氨酸。
12.—种样品中目标肽的检测方法，包含以下步骤(a)目标肽作如下修饰在(1)端作第一标记(X)、在(2)端作第二标记(Y)，形成(III)型结构X-肽-Y (III)；(b)向样品中添加标示肽，其中标示肽由与目标肽同序列的肽作如下修饰而组成在 (1)端作第一标记(X*)、在(2)端作第二标记的，形成(IV)型结构X*-肽-Y* (IV)，其中，(X)、(X*)、(Y)和(Y*)各自独立地含有正常或至少一个重原子同位素，其中标示肽母离子m/z与目标肽母离子m/z之间的差异X足够大，以便标示肽母离子的同位素峰落在八个m/z单位之外，或落在目标肽母离子m/z周围一个较小的CID分离窗之外；(c)获得样品的一级质谱；(d)在一级质谱中检测标示肽离子；(e)通过标示肽离子位于χ道尔顿处的CID分裂，获得二级质谱；并(f)分析表征目标肽子离子的二级质谱。
13.根据权利要求项12中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其C-端，每个肽的⑵ 端为其N-端。
14.根据权利要求项12中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其N-端，每个肽的⑵ 端为其C-端。
15.根据权利要求项12中所述的方法，其中(X)和(Y)均为轻同位素。
16.根据权利要求项15中所述的方法，其中(X*)和(Y*)均为重同位素。
17.根据权利要求项12中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其C-端，⑴为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、13C^N2-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ、 13C61X-赖氨酸-mTRAQ、赖氨酸-Vtraq或精氨酸，而(χ*)为13C61X-赖氨酸、13Cf^N2-赖氨酸-丙氨酸、13C61X-赖氨酸- (13C315N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-mTRAQ、13C61X-赖氨酸-VTRAQ或1精氨酸。
18.根据权利要求项12中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其C-端，每个肽的⑵端为其N-端，(X)为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、13C6^N2-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ、13C:N2-赖氨酸-mTRAQ、赖氨酸-VTRAQ或精氨酸，(Y)为丙氨酸或 mTRAQ试剂的轻同位素变种，(X)为13C6I-赖氨酸、"C6I-赖氨酸-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-mTRAQ、13C^N2-赖氨酸-VTOaQ或15N4-精氨酸，而 (Y*)为(13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ试剂。
19.根据权利要求项12中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其C-端，每个肽的⑵ 端为其N-端，(X)为13Cf^N2-赖氨酸-丙氨酸或赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸，(Y)为丙氨酸， (X*)为 13C61X-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸，而(Y*)为(13C315N)-丙氨酸。
20.根据权利要求项12中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其N-端，(X)为 (13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ试剂，而(X)为丙氨酸或mTRAQ试剂的轻同位素变种。
21.根据权利要求项12中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其N-端，(X)为 (13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ试剂，(X)为丙氨酸或mTRAQ试剂的轻同位素变种， 每个肽的⑵端为其C-端，(Y*)为13Cf^2-赖氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-mTRAQ、13C^N2-赖氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸，而 (Y)为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、13C^N2-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ、13Cf^N2-赖氨酸-mTRAQ、赖氨酸-VTRAQ或精氨酸。
22.根据权利要求项12中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其N-端，(X)为 (13C315N)-丙氨酸，⑴为丙氨酸，每个肽的(2)端为其C-端，(Y*)为13C61X-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸，而⑴为13Cf^N2-赖氨酸-丙氨酸或赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸。
23.根据权利要求项12中所述的方法，其中χ大于等于+3道尔顿，或小于等于-6道尔顿。
24.根据权利要求项12中所述的方法，其中步骤(e)也包括对标示肽离子进行CID分裂而获得其二级质谱。
25.一种样品中目标肽的分析方法，包含以下步骤(a)目标肽作如下修饰在(1)端作重同位素第一标记(C*)并在(2)端作轻同位素第二标记(D)，形成(V)型结构C*-肽-D (V)；(b)向样品中添加内标物，其中内标物由与目标肽同序列的肽经如下修饰组成(1)端作轻同位素第一标记(C)、(2)端作重同位素第二标记(D*)，形成(VI)型结构C-肽-D* (VI)，其中Cf与C之间的质量差异等于D*与D之间的质量差异，以致于内标物与修饰后目标肽质量相同；(c)向样品中添加标示肽，其中标示肽由与目标肽同序列的肽组成并作如下修饰(I)在端⑴作重同位素标记(C*)并在(2)端作重同位素标记(D)，形成(VII)型结构Cf-肽-D* (VII)；或(II)在(1)端作轻同位素标记(C)并在在(2)端作轻同位素标记(D)，形成(VIII)型结构C-肽-D (VIII)；其中标示肽母离子m/z与目标肽母离子m/z之间的差异χ足够大，以便标示肽母离子的同位素峰落在八个m/z单位之外或落在目标肽母离子m/z周围的一个较小CID ； (e)在一级质谱中检测标示肽离子；(f)对比标示肽母离子小χ个m/z单位的离子进行CID分裂，获得其二级质谱；(g)分析表征修饰后目标肽子离子的二级质谱；(h)比较修饰后目标肽子离子与内标物子离子的相对强度；(i)基于步骤(h)中的比较对目标肽进行量化。
26.根据权利要求项25中所述的方法，其中每个肽的(1)端为其C-端，每个肽的(2) 端为其N-端。
27.根据权利要求项1中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其C-端，(C)和(Cf)各自独立地为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ、或精氨酸或其任何同位素标记变种， 而(D)和(D)则各自独立地为丙氨酸或mTRAQ或其任何同位素标记变种。
28.根据权利要求项25中所述的方法，其中每个肽的(1)端为其C-端，(C)为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、13C^N2-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ、 13C61X-赖氨酸-mTRAQ、赖氨酸-VTRAQ或精氨酸，而(Cf)为13C61X-赖氨酸、13Cf^N2-赖氨酸-丙氨酸、13C61X-赖氨酸- (13C315N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-mTRAQ、13C61X-赖氨酸-VTRAQ或1精氨酸。
29.根据权利要求项25中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其C-端，每个肽的⑵端为其N-端，(C)为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ、13C^N2-赖氨酸-mTRAQ、赖氨酸-VTRAQ或精氨酸，(Cf)为13Cf^N2-赖氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-mTRAQ、 13C515N2-赖氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸，(D*)为(13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ试剂，而(D)为丙氨酸或mTRAQ试剂的轻同位素变种。
30.根据权利要求项25中所述的方法，其中每个肽的(1)端为其C-端，每个肽的(2) 端为其N-端，(C)为赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸，⑶为丙氨酸，(V)型结构中的(Cf)为 13C61X-赖氨酸-丙氨酸，(VII)型结构中的(Cf)为13C61X-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸，(D) 为(13C315N)-丙氨酸。
31.根据权利要求项25中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其C-端，⑶和(D)各自独立地为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ、或精氨酸或其任何同位素标记变种， 而(C)和(Cf)则各自独立地为丙氨酸或mTRAQ或其任何同位素标记变种。
32.根据权利要求项25中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其N-端，(C)为 (13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ试剂，而(C)为丙氨酸或mTRAQ试剂的轻同位素变种。
33.根据权利要求项25中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其N-端，(C)为 (13C315N)-丙氨酸或源自重同位素mTRAQ试剂，(C)为丙氨酸或mTRAQ试剂的轻同位素变种， 每个肽的⑵端为其C-端，(D)为13Cf^2-赖氨酸、13C61X-赖氨酸-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、13C61X-赖氨酸-mTRAQ、13C^N2-赖氨酸-VTRAQ或15N4-精氨酸，而 (D)为赖氨酸、赖氨酸-丙氨酸、13C^N2-赖氨酸-丙氨酸、赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸、赖氨酸-mTRAQ、13Cf^N2-赖氨酸-mTRAQ、赖氨酸-VTRAQ或精氨酸。
34.根据权利要求项25中所述的方法，其中每个肽的⑴端为其N-端，(C)为 (13C315N)-丙氨酸，(C)为丙氨酸，每个肽的(2)端为其C-端，(VI)型结构中的(D)为 13C^N2-赖氨酸-丙氨酸，(VII)型结构中的(D*)为13C61X-赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸，而 ⑶为赖氨酸-(13C315N)-丙氨酸。
35.根据权利要求项25中所述的方法，其中步骤(f)也包括对标示肽离子进行CID分裂而获得其二级质谱。
全文摘要
样品中肽的质谱量化方法，其中改良包含提供经同位素在N-端和C-端进行标记的内标肽。
文档编号C07H21/02GK102510903SQ201080025558
公开日2012年6月20日 申请日期2010年4月14日 优先权日2009年4月14日
发明者严威, 杰夫瑞涅西, 罗杰 申请人:系统生物学研究所