从hPS细胞来源的定形内胚层诱导获得特定内胚层的利记博彩app

专利名称：从hPS细胞来源的定形内胚层诱导获得特定内胚层的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及控制人多潜能干细胞包括人胚泡来源的干(hBS)细胞分化和获得特定内胚层细胞的方法。
背景技术：
前肠衍生器官胰、肺、甲状腺、肝、食道和胃起源于定形内胚层，内胚层为原肠胚形成期间形成的三个胚层之一。特异性转录因子沿着定形内胚层的前部和后部轴(A-P轴) 以特定的方式表达，定形内胚层最终形成原始消化道。Forkhead框Al (FOXAl)和F0XA2 两者均表达于整个消化道并且因而对于所有胃肠道来源的器官的发育是重要的(Ang等人，1993)。在前肠内胚层的前面部分中，注定变成肺和甲状腺的区域表达NK2同源框
I(NKX2. I)，而肝发育自表达造血表达的同源框(HHEXl)的区域。胰和十二指肠起源自表达胰十二指肠同源框(PDX-I)的前肠内胚层的后面部分。消化道内胚层的后面部分发育成为中肠和后肠，中肠和后肠变成小肠和大肠，表达尾型同源框I (CDXl)和CDX2。成纤维细胞生长因子(FGF)家族控制发育的许多方面，例如细胞迁移、增殖和分化。至少有四种与具有不同亲和力的不同FGF配体结合的不同酪氨酸激酶受体 (FGFR1-FGFR4)。此外，FGFR1-FGFR3的选择性剪接产生具有单独表达模式和配体特异性的“Illb”和“IIIc”同工型。FGF信号转导涉及沿着A-P轴和在胰分化期间消化道的成型 (patterning)。涉及小鼠胚和鸡胚外植体的在先研究已经证实FGFl和FGF2由心脏中胚层分泌并且其可被这些因子的外源性加入代替。在胚胎发生的早期，腹部内胚层与心脏中胚层相邻，而背部内胚层与脊索接触。心脏中胚层对于肝和肺发育是必需的。特别地，FGF2使多能腹部前肠内胚层以浓度依赖性方式成型为肝和肺，而心脏中胚层和FGF的缺失则促进胰形成。尽管FGF2的存在对于腹胰发育不是绝对必需的，但已证实FGF2在背胰形成期间的诱导性作用。背部内胚层最初与分泌激活蛋白β B和FGF2的脊索接触，导致Shh表达的抑制，这对Pdxl表达和背胰发育是必需的。此外，低水平的FGF2诱导培养的小鸡背部内胚层中Pdxl的表达。此外，FGF2还暗示对正在发育的胰中的胰上皮细胞的增殖具有诱导作用并且在成年鼠β细胞中与其它FGF共同表达。I型糖尿病的普遍性增加以及尸体器官供体胰岛(cadaveric donor islet)的缺乏使得对于开发如下方案引发了极大兴趣用于指导人胚泡干细胞(hBS细胞)分化成产生胰岛素的β细胞。为更好理解ES细胞向胰内胚层和表达胰岛素的细胞的细胞命运特化的分子机制，需要精细的培养条件。尽管已公布了大量报道体外从hPS细胞获得产生胰岛素的细胞的分化方案，没有一种描述了用于分化过程的单个生长因子的特定作用或讨论了潜在的分子机制。此外，还不清楚这些表达胰岛素的细胞是否代表真正的β细胞。为理解 hPS细胞来源的定形内胚层转变成Η)Χ1阳性β祖细胞，我们检验了 FGF2的作用。我们的结果表明在不存在外源性FGF2的情况下，定形内胚层分化成以肝细胞和肠样细胞为特征的前肠和中肠内胚层。重要的是，外源性加入的FGF2以剂量依赖性方式使 hPS细胞来源的定形内胚层成型。特别地，在对不同浓度FGF2的应答中，生成肝的、胰的、肠的和前部前肠祖先。此外，生长因子的逐步加入使我们得以进一步剖析调节胰特化的分子程序，显示胰祖先/roxi表达的诱导依赖于MAPK信号转导途径中FGF2介导的激活。这是首次将FGF2单独与hPS细胞来源的胰内胚层的分化相关联；在此之前，用于获得胰内胚层的方法依赖于在生长因子例如FGF成员与视黄酸酯的组合存在下(参见WO 07/127927)或在这些生长因子与另外的培养基补充物例如B27 (W0 09/012428)存在下培养细胞。此处显示的数据因此将有助于开发用于诱导hPS细胞成为前部内胚层和后部内胚层衍生器官肺、 食道、胃、肝、胰和肠的新的可重现的方案。如上所述，当前有关hPS细胞分化成胰的认识主要包括对小鸡、小鼠和有限程度的人细胞的研究。尽管已经报道了 hPS细胞分化方案，但还不清楚这些表达胰岛素的细胞是否代表真正的β细胞，这是由于它们的低胰岛素含量和缺乏生理学上葡萄糖介导的胰岛素释放。各种方案在生长因子组成、浓度和加入时间方面存在差异，这一事实表明有必要精确限定在该分化过程中单个生长因子的特定作用和作用模式，以便提供控制细胞分化的方法。发明描述本发明涉及将特定浓度的FGF2用作关键因子以控制从hPS细胞来源的定形内胚层细胞分化成特定内胚层细胞。本发明还提供获得内胚层细胞的方法，所述方法包括FGFR的使用和MAPK信号转导途径的激活。如图IA所图示描述的，分化程序可包括一个或多个步骤，例如两步，其包括第一步，指导向定形内胚层的分化，而第二步是指导向特定内胚层的进一步分化。促进分化成定形内胚层的第一步可包括在第一步期间更换的不同的生长培养基组合物，如图IA所图示描述且如实施例2所例证的。本发明优先涉及从定形内胚层细胞开始的第二步。为指导向特定内胚层细胞的分化，需要大量的条件以确保生长和生存力。此外需要作为生长因子的关键组分以控制分化。在本发明中，通过使定形内胚层细胞接受不同浓度的成纤维细胞生长因子FGF2， 将定形内胚层细胞的分化定向成为某些类型的特定内胚层细胞。低浓度的FGF2产生肝内胚层细胞，中等浓度的FGF2产生胰内胚层细胞，而相对高浓度的FGF2产生肠和/或肺内胚层细胞或其混合物。FGF2的浓度是培养基中的浓度且范围为O. I至500ng/ml。为引导向肝细胞命运的分化，可按O. l-16ng/ml或O. l-10ng/ml的范围在培养基中加入FGF2。这导致表达AFP的肝内胚层细胞的产生，并且一种或多种选自以下的标记表达于肝内胚层细胞F0XA2、白蛋白(ALB)、HNF4A、HNF6 (0NECUT1)、ProxI、CKl7、CK19、Hex、 FABp I、AAT、Cyp7A1、Cyp3A4、Cyp3A7 和 Cyp2B6。通常肝内胚层细胞表达以下标记AFP、ALB、 HNF6和HNF4A和/或AFP、HNF4A、Proxl。在本发明的一方面，FGF2浓度的范围为4ng/ml 至6ng/ml,例如5ng/ml,且特定内胚层细胞为肝内胚层细胞。通常，肝内胚层细胞表达AFP并且所得到的肝内胚层细胞表达上述标记的至少4 种、至少5种、至少6种例如至少7种、至少8种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11 种、至少12种或全部。如本文所公开的，通过使定形内胚层细胞接受低浓度的FGF2(0. l_16ng/ml)获得的肝内胚层细胞表达AFP、ALB、ONECUTI、HNF4A。
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基于形态学研究，在仅用激活蛋白A或低浓度例如4ng/mlFGF2处理的培养物中， 清楚观察到肝细胞样细胞，而在较高浓度例如16-256ng/ml的FGF2却未观察到这些细胞。 此外，随着FGF2浓度的增加，集落变得更密且出现稠密的簇。如图I. B)所说明的，表达白蛋白(ALB)的细胞的量随着FGF2浓度的增加而减少。 此外，抗体染色(未显示)表明ALB和AFP —致的共表达。与仅用激活蛋白A处理的参考样品相比，肝细胞相关标记ALB、HNF4A和ONECUT随着FGF浓度增加而下调。因而本发明的一方面涉及FGF2控制(即促进或抑制)hPS细胞向肝细胞命运的分化的用途。为引导DE-细胞向胰内胚层的分化，当按16-150ng/ml的范围,例如64ng/ml加入培养基时，FGF2刺激胰内胚层细胞的形成。得到的胰内胚层细胞表达PDX-I和一种或多种如下标记 NGN3、CPAl、S0X9、HNF6、HNFI b、E-钙黏着蛋白、MNXl、PTFIA 和 NKX6-1。通常胰内胚层细胞表达I3DXl和上述标记中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、 至少7种、至少8种或全部。从本文的实施例可看出，得到的胰内胚层细胞表达roxi和NKX6-1、和/或TOX1、 S0X9、ONECUTI和 F0XA2。此外，胰内胚层细胞表达至少一种选自胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽和ghrelin的胰激素。为引导定形内胚层细胞向肠和/或肺内胚层分化，按150_500ng/ml的范围向培养基加入FGF2。得到的肠内胚层细胞表达⑶X2和一种或多种如下标记⑶Xl、F0XA2、PITX2、 FABp2、TCF4、绒毛蛋白和MNX1。通常，得到的肠内胚层细胞表达⑶Xl和上述标记的至少2 种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或全部。从本文的实施例中显示得到的肠内胚层细胞表达⑶XI、⑶X2和MNXl。得到的肺内胚层细胞表达一种或多种如下标记NKX2-1、SHH、PTCHU FGFlO和 SPRY2。通常，得到的肺内胚层细胞表达上述标记的至少2种、至少3种或全部。得到的前部前肠内胚层细胞表达S0X2。当FGF2以150_500ng/ml的浓度使用时，预期主要使用范围内下端浓度获得肠内胚层细胞，而主要使用范围内上端浓度获得肺内胚层细胞。还可获得肠内胚层细胞和肺内胚层细胞的混合物。用于获得特定内胚层细胞的原材料是定形内胚层细胞。定形内胚层细胞可通过依据合适方案(参见例如图IA的前两列)或实施例2处理hPS细胞而获得，或定形内胚层可通过其它类型的多潜能细胞系例如iPS细胞或显示分化成定形内胚层的潜能的细胞而获得。定形内胚层细胞的特征为表达以下标记S0X17、F0XA2、CXCR4以及标记S0X7的下调。更具体地，定形内胚层细胞在蛋白质水平共表达S0X17和CXCR4;且显示 cereberus、Foxa2、GSC、HHEX的基因表达。在激活蛋白A处理的样品中0ct_4在第3天被下调(参照实施例3)。在上述选择浓度的FGF2存在下，将定形内胚层细胞在合适的培养基中进行培养， 以便指导定形内胚层细胞发育成为特定内胚层细胞，参照上述。更多详情在本文的实施例中给出。简言之，定形内胚层细胞的分化通过在含有FGF的合适培养基(例如KO-DMEM培养基)中培养多至20天例如8-12天来诱导，培养基任选含有抗生素(例如青霉素-链霉素例如按I %的浓度)、通常存在于培养基中的一种或多种营养物或其它物质(例如1%的 Glutamax、I %非必需氨基酸、O. ImM β -巯基乙醇)和knockout血清替代品(例如10-15% 例如12% )。培养基保持新鲜并具有随时间一致的浓度水平。本发明的重大方面是发现了仅FGF2足以诱导胰特异性基因和，其提供了精确而简单干细胞分化指南。如图2所说明的，在所有用FGF2处理的样品中，PDXU S0X9和NGN3被上调，下述情况除外当仅用4ng/ml FGF2处理样品时，与对照样品相比I3DXl保持不变。当用64ng/ ml FGF2处理时，NGN3被上调，但比32ng/ml FGF2和256ng/ml FGF2的程度较低，这可能表明TOX1/NKX6-1和NGN3的表达之间的负相关或可能表明在64ng/ml FGF2下TOX1/NKX6. 1+ 细胞的存在比表达更高水平NGN3的细胞更丰富。在加入约64ng/ml浓度的FGF2样品中， NKX6-1和roxi两者显示峰值表达。在64ng/ml FGF2的PDXl+集落的免疫荧光染色显示相应的模式，这进一步支持这些观察结果。此外，明显的是所有I3DXl+细胞为S0X9、ONE⑶Tl 和F0X2A阳性，而对于肠标记⑶X2和增殖标记PH-3，大部分TOXl+细胞为阴性。一些表达 PDXl和NKX6-1两者的细胞可存在于roxi阳性集落内。为使得DE细胞有效分化成特定内胚层细胞，向DE细胞加入不同浓度的FGF2。为显示响应FGF2浓度的转录变化，通过RNA分析监测表达模式。如图3所描述的，该结果清楚显示FGF2指导分化，这是因为包括NKX2-1、SHH、PTCHl、SPRY2和FGFlO的肺相关标记以及小肠标记⑶X2和MNXl均显示明显的上调并且在256ng/ml FGF2处峰值表达。与⑶X2 相反，小肠标记CDXl在测试范围内仍未受FGF2水平的影响。在256ng/ml FGF2的TOXl阳性群的支持性免疫荧光研究进一步显示所有I3DXl阳性细胞均为S0X9和ONE⑶Tl阳性，而仅少数PDXl+细胞为⑶X2阳性。PDXl+细胞无一共同表达NKX6-1或S0X2。此外，S0X2+细胞为CDX2阴性。此外，当在256ng/ml FGF2生长时，免疫荧光双重染色显示几乎所有的⑶X2阳性细胞共表达F0XA2，而仅一些⑶X2+细胞表达MKI67。如图4A所描述的，FGF2以剂量依赖性方式影响FGFR(FGF-受体)基因的转录。从图4A可明显看出，在响应增加的FGF2浓度中，FGFRl和-3被上调，而由于增加的FGF2水平，FGFR2和-4显示相反的机制，其转录水平下降。本发明还提供i)用于制备肝内胚层细胞的方法，所述方法包括将定形内胚层细胞孵育在含有O. I至16ng/ml FGF2的培养基中约6至20天例如6至8天或9至12天，ii) 通过此方法可获得的肝内胚层细胞和iii)通过此方法获得并具有本文所限定的特征的肝内胚层细胞。此外，本发明还提供i)用于制备胰内胚层细胞的方法，所述方法包括在含有16至 150ng/ml FGF2的培养基中将定形内胚层细胞孵育约2至20天例如6至8天，ii)通过此方法可获得的胰内胚层细胞和iii)通过此方法获得并具有本文所限定的特征的胰内胚层细胞。此外，本发明还提供i)用于制备肠和/或肺内胚层细胞的方法，所述方法包括将定形内胚层细胞在含有150至500ng/ml FGF2的培养基中孵育约6至20天例如6至8天，ii)通过此方法可获得的肠和/或肺内胚层细胞和iii)通过此方法获得并具有本文所限定的特征的肠和/或肺内胚层细胞。假定，用于制备肝、胰或肠内胚层细胞的方法包括诱导FGFR，值得注意的是FGFR 为 FGFRl、FGFR2、FGFR3 和 / 或 FGFR4。通过向定形内胚层细胞的培养物加入FGF来诱导FGFR。合适的FGF可单独选自 FGF2或与选自以下的第二 FGF结合FGF4、FGF7和FGFlO及其任何结合。申请人进行的研究已显示FGF4、FGF7和FGF10，当替代FGF2单独使用时，都不能够诱导hPS-来源的定形内胚层向PDX-I阳性胰内胚层分化。如图4B和C所述，可想象MAPK信号转导途径由FGFR诱
导激活。附图简述图LA)向特定内胚层的两步分化程序的图示。分化方案分成两步第一步指导向定形内胚层的分化，而第二步指导向特定内胚层的分化。B)与仅用激活蛋白A处理的对照样品相比，肝细胞相关标记ALB、HNF4A和0NECUT1随着增加的FGF2浓度(ng/ml)均被下调。由于HHEX还在前部前肠内胚层中表达，因此在最高FGF2浓度256ng/ml下，HHEX与其它肝标记被下调的程度不同。在第11天，获取样品用于实时PCR分析。数据表示为均值表达+/-SEM(n = 4)。这些图表示第11天与在对照样品中检测到的相比的倍数增加。对照样品任意设置为数值I。图2. A) FGF2足以用于诱导胰特异性基因。I3DXl、S0X9和NGN3在所有FGF2处理的样品中被上调，下述情况除外当仅用4ng/ml FGF2处理时，PDXl与对照样品相比保持不变。当用64ng/ml处理时，NGN3被上调但程度比32ng/ml和256ng/ml低，这可能表明PDXl/ NKX6-1和NGN3表达之间的负相关，或者可能表明在64ng/ml FGF2下，PDX1/NKX6. 1+细胞比表达更高水平NGN3的细胞存在更加丰富。NKX6-1仅在64ng/ml下被上调。I3DXl和NKX6-1 在64ng/ml下具有峰值表达。在所有样品中均检测到F0XA2和CPAl并且保持不变。在第 11天，获取样品用于实时PCR分析。数据表示为均值表达+/-SEM(η = 4)。这些图表示第 11天与在对照样品中检测到的相比的倍数增加。对照样品任意设置为数值I。B)用不同FGF2浓度处理的hPS细胞的定量TOXl免疫荧光染色。仅用激活蛋白 A或4ng/ml FGF2处理的培养物中，不存在I3DXl+细胞，而在用32、64和256ng/ml FGF2处理的培养物中，总存在I3DXl+细胞。在64ng/ml处观察到roxi+细胞的最高百分比。这通过显微术和Imaris成像软件的使用而评估，如图2B)中的条柱所定量的。数据表示为均值+SEM (n = 7-10)。获得以下P-值对照对比32ng/ml (P < 0.01),对照对比64ng/ml (P < O. 001)，对照对比 256ng/ml (P < O. 001)，32ng/ml 对比 64ng/ml (P < O. 001)，32ng/ml 对比 256ng/ml (P < O. 01)和 64ng/ml 对比 256ng/ml (P < O. 01)。认为 P < O. 05 是显著的。图3.肺和肠特异性标记的RNA分析。在256ng/ml下前部前肠特异性标记S0X2 被显著上调，而肺相关标记例如NKX2-1、SHH、PTCHl、SPRY2和FGFlO均在256ng/ml下具有峰值表达。小肠标记⑶Xl保持未受影响，然而另一小肠标记⑶X2，和MNXl两者均在256ng/ ml下被上调。在第11天获取样品用于实时PCR分析。数据表示为均值表达+/-SEM(η = 4)。这些图表示第11天与在对照样品中检测到的相比的倍数增加。对照样品任意设置为数值I。 图4. A)在第11天的FGF受体表达。FGFRl和FGFR3的表达随着FGF2浓度升高而被上调，同时FGFR2和4被下调。用于实时PCR分析的所有样品均在第11天获取。数据表示为均值表达+/_SEM，n = 3-4。这些图表示第11天与在对照样品中检测到的相比的倍数增加。对照样品任意设置为数值I。B)由FGF2激活的细胞内信号转导途径以及它们相应抑制剂的示意图，用红色表示。C)体外FGF信号转导的抑制减少roxi的表达。用SU5402 (10 μ M)或MAPK 抑制剂υ 026(10μΜ)拮抗FGF信号转导导致roxi表达显著减少而用PI3K抑制剂 LY294002(12. 5μΜ)处理对TOXl表达没有显著影响。数据表示为均值表达+/_SEM，η = 4-6。这些图表示第11天与在对照样品中检测到的相比的倍数增加。对照样品任意设置为数值I。D)显示产生肝、胰和肺所需不同的FGF2阈值示意图。低FGF2浓度促进向肝细胞样细胞(由ALB的表达表示)的分化，而中等FGF2水平使hPS细胞来源的前肠内胚层分化成胰(由I3DXl的表达表示)，而高浓度促进向肺和肠细胞的分化(由NKX2-1和CDX2的表达表示)。图5.使用4种不同细胞系在4组独立实验中对Η)Χ、ΝΚΧ6-1和ALb的RNA表达分析。在所有实验中，与对照(仅AA处理)相比，在FGF2处理的样品中roxi表达被上调，在 256ng/ml处除外，在此处，PDXl表达被下调或无表达。此外，PDXl的峰值表达总在64ng/ ml处。随着FGF2浓度升高，NKX6-1表达也被上调，然而，在SA121tryp、HUES-4和HUES15 中，在256ng/ml处未被上调，在第11天在HUES-3和SA181tryp中是这种情况。随着FGF2 浓度升高，Alb表达一致地被下调。上组显示来自细胞系SA181tryp、SAl2Itryp的数据， 下组HUES-4和HUES15。在第11天，获取样品用于实时PCR分析。数据表示为均值表达 +/-SEM(n = 2-3)。这些图表示第11天与在对照样品中检测到的相比的倍数增加。对照样品任意设置为数值I。图6.用于PCR和基因表达分析的基因特异性引物列表。图7.定形内胚层、肝内胚层、胰内胚层和肠内胚层细胞标记特征。缩写AA;激活蛋白A白蛋白(ALB)甲胎蛋白(AFP)尾型同源框2(CDX2)趋化因子(C-X-C基序)受体4 (CXCR4)定形内胚层(DE)FBS ;胎牛血清FGF2 ;成纤维细胞生长因子2成纤维细胞生长因子(FGF)Forkhead 框 A2 (F0XA2)造血表达的同源框(HHEX)肝细胞核因子4，a (HNF4A)
hBS细胞；人胚泡来源的干细胞hPS细胞；人多潜能干细胞KO-SR ；knockout 血清替代品胰和十二指肠的同源框I (roxi)运动神经元和胰同源框I(MNXl)NK2 同源框 I (NKX2-1)NK6 同源框 I (NKX6-1)音猬同系物(果蝇属)(SHH)，SRY (性别决定区 Y)-框 9 (S0X9)SRY(性别决定区 Y)-框 17(S0X17)定义本文所用的"人多潜能干细胞"(hPS)指可来源于任何来源的细胞，其在适当条件下能够产生不同细胞类型的人子代，所述细胞类型为全部3个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物。hPS细胞在8-12周龄SCID小鼠中可具有形成畸胎瘤的能力和/或在组织培养物中形成全部3个胚层的可识别细胞的能力。包括在人多潜能干细胞定义中的有各种类型的胚胎细胞，包括在文献中常表示为人胚胎干(hES)细胞的人胚泡来源的干(hBS) 细胞(参见例如，Thomson等人(1998),Heins等人·(2004),以及诱导的多潜能干细胞(参见例如 Yu 等人，(2007) Science 318 :5858) ;Takahashi 等人，(2007) Cell 131(5) :861)。 本文描述的各种方法和其它实施方案可需要或利用来自各种来源的hPS细胞。例如，适合使用的hPS细胞可从正在发育的胚胎得到。除此之外或作为选择，合适的hPS细胞可从建立的细胞系和/或诱导的人多潜能干(hiPS)细胞获得。本文所用的"hiPS细胞"指诱导的人多潜能干细胞。本文所用术语"胚泡来源的干细胞"表示为BS细胞，且将人的形式称为"hBS细胞"。在文献中该细胞通常称为胚胎干细胞，且更具体地为人胚胎干细胞(hESC)。用于本发明的多潜能干细胞因而可以是从胚泡制备的胚胎干细胞，参见例如WO 03/055992和W 2007/042225，或是市售的hBS细胞或细胞系。然而，进一步设想任何的人多潜能干细胞可用于本发明，包括分化的成体细胞，通过用某些转录因子例如0CT4、S0X2、NANOG和LIN28 处理成体细胞将分化的成体细胞重编程为多潜能细胞，如Yu，等人，2007，Takahashi等人 2007和Yu等人2009中公开的。本文所用的饲养细胞意欲指单独或结合使用的支持细胞类型。该细胞类型可进一步为人或其它物种来源。可从以下组织获得饲养细胞包括胚胎组织、胎儿组织、新生儿组织、幼体组织或成体组织，且进一步包括从皮肤包括包皮、脐带、肌肉、肺、上皮、胎盘、输卵管、glandula、间质或乳房来源的组织。饲养细胞可来源于属于人成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、角质形成细胞、内皮细胞和上皮细胞的细胞类型。可用于获得饲养细胞的特定细胞类型的实例包括胚胎成纤维细胞、胚外内胚层细胞、胚外中胚层细胞、胎儿成纤维细胞和/或纤维细胞、胎儿肌肉细胞、胎儿皮肤细胞、胎儿肺细胞、胎儿内皮细胞、胎儿上皮细胞、脐带间充质细胞、胎盘成纤维细胞和/或纤维细胞、胎盘内皮细胞。本文所用术语"mEF细胞"意指小鼠胚胎成纤维细胞。本文所用术语"小分子"意指活化优选信号转导途径的化合物。实施例实施例I人ES细胞的体外培养如先前所述(Cowan等人,2004 ；Heins 等人,2004)将未分化 hPS (从 D. A. Melton, Howard Hughes Medical Institute (Harvard University, Cambridge, MA) (Cowan 等人， 2004)获得的膜蛋白酶适应的 SA181 和 SA121 (Cellartis, Gothenburg, www. ceilartis. com)、HUES-3 > HUES-4 和 HUES-15)增殖，还可从 http://mcb. harvard, edu/me I ton/hues/ 获取实验方案。简言之，在含有K0-DMEM、10% knockout血清替代品、lOng/ml bFGF、l%非必需氨基酸、1% GlutamaX、l%青霉素-链霉素、β-巯基乙醇(所有试剂均来自GIBC0， Invitrogen)和 10% plasmanate (Talecris Biotherapeutics Inc)的 hBS 培养基中将细胞保持在有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF) (Department of Experimental Biomedicine/TCF from Sahlgrenska Academy at the University of Gothenburg, Sweden)上。用0. 05 %胰蛋白酶/EDTA (GIBC0，Invitrogen)将细胞传代并以介于I 3 和 I : 6 之间的分传比重新铺板。由 Institute of Clinical Genetics, University of Linkoping, Sweden通过标准的G显带技术对细胞系进行核型分析。对于每一分析,评价 15-20个中期。SA121、HUES-4和HUES-15核型分析为正常，而HUES-3 (亚克隆52)已获得额外的染色体17(82% )并且SA181已获得额外的染色体12(45% )。实施例2依据图IhPS细胞向定形内胚层细胞和特定内胚层细胞的分化以12，000-24, 000细胞/cm2的密度接种hPS细胞并培养至汇合。然后如先前所述使hPS细胞分化成定形内胚层(D' Amour等人，2005)。简言之，在PBS中洗涤细胞并且在低血清中(0-0，2% FBS)用含 100ng/ml 激活蛋白 A(R&D systems)和 25ng/ml 无翅型 MMTV 整合位点家族、成员3A(Wnt3a)的RPMI 1640 (GIBC0, Invitrogen)处理三天。在第三天，用PBS洗涤细胞并在基于KO-DMEM的培养基中以不同浓度(依据结果说明为0-256ng/ml)加入人FGF2 (Invitrogen)，所述培养基含有I %青霉素-链霉素、I % Glutamax、I %非必需氨基酸、0. ImM β-巯基乙醇和12% knockout血清替代品(所有试剂均来自Invitrogen)。每天更换培养基。不含FGF2的对照培养物平行生长并且每天监测细胞形态。在每一时间点，对每一独立实验取2至4个生物重复。更具体地，根据所分析的时间点的数目，将每一孔分成4-5块。实施例3特定内胚层细胞的表征FGF抑制测定在第3天在DE诱导后，通过向培养基加入SU5402 (Calbiochem ;10M)、 LY294002 (CelI Signalling technology ; 12.5 μ Μ)和 U1026(Cell Signalling technology ;10 μ M)，进行FGF受体抑制测定。用等体积的稀释剂DMSO处理对照培养物。 每天加入补充有适当抑制剂的新鲜培养基。在不同时间点(第9-12天)从单独的孔中取
2至3个样品，用于每一独立实验的mRNA分析。RNA提取、逆转录和实时PCR
用GenElute Mammalian 总 RNA试剂盒(Sigma-Aldrich)提取总 RNA。用 NanoDrop ND-1000分光光度计(Nanodrop Technologies)测量总RNA浓度。使用2. 5 μ M随机六聚物和2. 5 μ M oligo (dT) (Invitrogen)，按照制造商的说明书，用Superscript III进行逆转录。实时PCR 测量在 ABI PRISM 7900HT Sequence Detector System (Applied Biosystems) 上进行。使用含有 ΙΟμΙ SuperMix-UDG w/R0X、400nM 的每一引物、O. 125x SYBR Green 1(所有试剂均来自Invitrogen)的20μ1反应物。可获得作为补充数据的引物序列(图 6)。预期PCR产物的形成通过琼脂糖凝胶电泳和解链曲线分析证实。针对ACTB或RPL7表达将基因表达数据标准化。作为额外的标准化对照，还针对总RNA浓度将数据标准化，这生成相似的数据。如(Bustin, 2000 ;Stahlberg等人,2005)所述进行实时PCR数据分析。hPS细胞的免疫组织化学分析在室温下，将hPS细胞固定于4%低聚甲醛15分钟并且在PBS-T (含O. 1% Triton X-100的PBS)中洗涤3次。在室温下，用含O. 5% Triton X-100的PBS将固定的细胞透化15分钟并在补充有5%正常驴血清(Jackson Immunoresearch)的PBS-T中封闭Ih,然后用以下的第一抗体和稀释度在4°C孵育过夜山羊多克隆抗体(pAb)抗-F0XA-2(Palle Serup 惠赠；Santa Cruz Biotechnology ；1 : 200)、豚鼠 pAb 抗-PDX-1 (Chris Wright ； β CellBiologyConsortium ；1 : 1500)、山羊抗-PDX-1(Chris Wright ； β CellBiologyConsortium ；1 : 1500)、兔 pAb 抗-NKX6. I(β CellBiologyConsortium ； 20 I : 4000)、小鼠抗-CDX-2 (Jonathan Draper 惠赠；Biogenex ； I : 500)、兔 pAb 抗-S0X-9 (Chemicon ; I : 500)、兔抗-HNF-6 (Santa Cruz Biotechnology ；1 : 400)、小鼠 mAb-抗 PH-3 (Cell Signaling technology ；1 : 50)、兔 pAb-抗 MKi67 (Novocastra ; I : 200)、兔抗-S0X2 (Palle Serup 惠赠；Chemicon ; I : 250)、山羊抗-白蛋白(Bethyl laboratories ; I 300)。孵育过夜后，在PBS中将细胞洗涤3次5分钟；并在室温下， 在补充有5%血清的PBS-T中用相应的荧光第二抗体(Alexa 488，Cy3和647 Jackson Immunoresearch和Invitrogen ;按照制造商的说明书稀释)孵育60分钟。通过4', 6' - 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) (Sigma-Aldrich ；1 1000)孵育4分钟使细胞核可见。 用表面荧光显微术(Zeiss Axioplan 2)检测并分析免疫荧光染色。数据分析使用Imaris成像软件(Bitplane)计算F1DXl阳性细胞的百分比。对于每一参数选择10个随机选择的视野。使用DAPI染色，软件估计细胞的总面积。roxi阳性细胞的面积以同样的方式计算。最终，通过将roxi阳性细胞的面积除以DAPI阳性面积，计算roxi阳性细胞的百分比。实时PCR测量的原始数据从SDS 2. 2. I输出并用Microsoft Excel graph pad分析。通过多变量比较(单向AN0VA)用Bonferroni校正在统计学上分析所有数据。 所有值均表示为均值土平均标准误差(SEM)并且若P < O. 05则认为显著。实施例4低剂量的FGF2促进肝细胞命运而中等浓度的FGF2指导hPS细胞向胰细胞命运的分化对于本发明，检验了激活蛋白A/Wnt3a处理的hPS细胞是否能够产生前部和后部的前肠内胚层两者，腹胰和背胰分别起源于前部和后部的前肠内胚层。事实上，通过评估特有的前肠/中肠标记的表达，我们展示激活蛋白A/Wnt3a处理的hPS细胞自发分化成前肠和中肠内胚层(

图1B)。此外，在前肠来源的器官中，肝祖先占优势(图1B，2A)。总而言之， 这些发现表明前部前肠内胚层自发分化成肝，但前部和后部前肠内胚层两者都不自发地特化成为腹胰和背胰内胚层。为测试FGF2是否能够指导前肠内胚层分化成胰命运，评估了不同FGF2浓度(0、4、16、32、64和256ng/ml)诱导I3DXl表达的能力。浓度部分地基于小鼠外植体的研究(Deutsch等人，2001)。对5个不同的细胞系应用分化方案(图1A) :HUES_3 亚克隆52、HUES-4、HUES-15和胰蛋白酶适应的SA181和SA121，以避免细胞系特异性优化。 用FGF2浓度(16-256ng/ml)处理的细胞变得更密且包含更多簇。在用低剂量FGF2 (4ng/ ml)处理的hPS细胞培养物中观察到肝细胞样细胞。mRNA分析和免疫荧光染色显示肝标记白蛋白(ALB) ,one cut同源框I (ONE⑶Tl先前被称为HNF6)、肝细胞核因子4 a (HNF4A)的剂量依赖性表达，而HHEX表达以非剂量依赖性方式仅适度下降(至少在所测试的FGF2浓度范围内)。增加的FGF2浓度下调ALB、ONE⑶Tl和HNF4A的表达。这也通过ALB染色在蛋白质水平得到证实，其中在O和4ng/ml FGF2观察到大量ALB+细胞而在256ng/ml FGF2 未观察到ALB+细胞(图1B)。已知多个转录因子参与胰特化。然而，大部分这些因子还表达于其它器官中。因此，选择标记的组合以确定分化细胞的胰命运PDX1、SRY(性别决定区Y)-框9(S0X9)、 NK6同源框1(^ 6-1)、油1^转录因子恥111'(^611丨11-3(如吧)、？(《42并且还监测了羧肽酶 Al (CPAl)的表达。在所有样品中均检测到后部前肠相关标记的表达，并且若干胰内胚层标记包括PDX1、NKX6-1、S0X9和NGN3的表达以FGF2剂量依赖性方式被上调。在大多数实验中，在第9天已经可检测到低水平的NKX6-1但从第11天以后表达更加明显。CPAl和 F0XA2表达于所有样品中但不受FGF2处理的影响(图2A，补充图I)。胰特异性转录因子 Ia(PTFlA)是碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子家族的成员，其在早期胰内胚层表达，对胰特异性转录因子Ia的表达分析表明其以低mRNA水平表达(数据未显示)。由于所有的胰组织来源于Pdxl阳性群并且为证实mRNA数据，进行roXl染色。我们检测了用32-256ng/ml FGF2处理的样品中专有的PDXl+细胞(图2B)。与未用FGF2处理的对照细胞相比，PDXl+细胞的数目显著高于FGF2处理的细胞(32-256ng/ml)。在用64ng/ ml FGF2(图2B)处理的培养物中获得最多数目的PDXl+细胞(15-20% )。尽管最高FGF2 浓度的作用在细胞系之间有差异，但趋势是一样的；在256ng/ml FGF2下TOXl表达降低或无表达(补充图I)。由于Pdxl还表达于后部胃、十二指肠和CNS (仅mRNA转录物)，另外的胰标记的表达用于证实朝向胰命运的分化。所有roxi+细胞共表达F0XA2、ONE⑶Tl和S0X9。尽管大多数的PDXl+细胞不共表达中肠/后肠标记⑶X2，但检测到了一些双阳性细胞。roxi和 NKX6-1在小鼠和人的胰上皮共表达但是不在十二指肠和胃中共表达(Nelson等人，2007)。 共表达roxi和NKX6-1的胰祖先仅存在于分别用32ng/ml和64ng/ml FGF2处理的样品中 (图2A)。然而，与I3DXl+群相比，NKX6-1+细胞的数目相对小。使用5个不同的hPS细胞系在32-256ng/ml FGF2下TOXl表达的强烈诱导在多个实验中再现(补充图I)。因此，增加的FGF2浓度在以肝细胞命运为代价的情况下有助于胰细胞命运(图2A和补充图I)。增殖标记磷酸-组蛋白-H3 (PH3)的免疫荧光检测证明仅少数PDXl+细胞复制，表明PDXl+细胞的出现是分化而不是先前已存在的roxi+细胞增殖的结果。实施例5
高剂量的FGF2指导hPS细胞分化成前部前肠和小肠细胞随着肝细胞标记八1^、!1即44和0肥^1'1的表达伴随FGF2浓度增加而下降(图1B)， 前部前肠相关标记SRY(性别决定区Y)框2(S0X-2)的表达水平升高，在256ng/ml处观察到最高水平(图2A)。一致的是，Sox-2的表达被限制在E13. 5小鼠胚胎中的前部前肠衍生器官，例如食道、肺和胃(补充图2)。由于肺和甲状腺产生于前部前肠内胚层的同一区域， 与这些器官相关的标记的表达模式通过mRNA分析评估。虽然甲状腺-特异性标记甲状腺球蛋白(TG)随着增加的FGF2浓度而被下调(数据未显示)，但肺和甲状腺特化的最早标记 NKX2-1 (Serls等人，2005)在256ng/ml处被上调，这表明向肺细胞类型分化。与肺命运的诱导相关但不受限于肺命运的诱导的另外的标记也被上调，这些标记例如成纤维细胞生长因子10 (FGFlO)、sprouty同系物2 (果蝇属)(SPRY2)、音猬同系物(果蝇属)(SHH)和SHH 受体补缀(patched)同系物I (果蝇属)(PTCHl)(图3)。由肺泡II型上皮细胞和Clara细胞IOkDa蛋白(CClO)产生的肺表面活性剂蛋白 C(SP-C)不能在mRNA样品中检测到，这表明NKX2-1+细胞代表早期肺祖细胞。在最高FGF2浓度时(256ng/ml)，中肠/后肠标记⑶X2和MNXl的表达显著升高， 这表明高浓度的FGF2还诱导肠细胞类型的形成。CDXl表达保持不变而未在任何浓度检测到大肠标记⑶X4。⑶X2表达在蛋白水平得到证实并且在256ng/ml处获得最多数目的 ⑶X2+细胞。重要的是，⑶X2+细胞共表达F0XA2，不包括滋养外胚层的形成。为确定增加的CDX2+细胞数是由于增殖还是由于中肠内胚层再特化所导致，进行用增殖标记MKI67的双重染色。大部分CDX2+细胞对于MKI67抗原为阴性，暗示是再特化而非增殖。尽管许多roXl+细胞在256ng/ml FGF2下仍然表达，但无一表达NKX6-1，这表明从64至256ng/ml增加的FGF2浓度阻滞胰内胚层的形成(图5)。此外，尽管大部分PDXl+ 细胞是CDX2阴性，但与在64ng/ml相比在256ng/ml观察到更多的H)X1+/CDX2+细胞。基于E18.5小鼠胚胎的roxi/⑶X2双重染色，我们的结论是roxi+/⑶X2+细胞代表十二指肠细胞类型。此外，我们能确认在分化的hPS细胞和在E18. 5小鼠胚胎中，PDXl和⑶X2阳性细胞均不共表达S0X2。总之，这些数据表明响应外源性FGF2的对肝、胰、肺和肠标记的剂量依赖性诱导(图4D)。实施例6ERK1/2促分裂原活化蛋白激酶信号转导对于roXl诱导是必需的FGF通过它们相应的FGFR的若干信号转导途径包括磷脂酰肌醇_3激酶(PI3K)和 ERK1/2促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)而活化(图4B)。在所有样品中均检测到FGFR mRNA 表达。此外，随着FGF2浓度增加，观察到FGFRl和3水平升高以及FGFR2和4水平降低的趋势(图4A)。为确定FGFR-介导的信号转导对于向胰内胚层的分化是否是必需的，研究了 FGFR酪氨酸激酶抑制剂SU5402、MAPK抑制剂U 1026和PI3K抑制剂LY294002的作用(图 4C)。用SU5402的处理显著降低roXl阳性细胞的数目，这表明FGF2 (64ng/ml)介导经FGFR 的roXl+细胞诱导。此外，在U1026存在下用FGF2的处理减少I3DXl表达，这表明经FGFR 信号转导的MAPK途径的激活对于I3DXl的诱导是必需的。与此相反，当细胞在LY294002存在下用FGF2处理时，PDXl表达保持不变，表明活性PI3K途径对于roXl的诱导不是必需的。 这些结果证明在hPS细胞中的FGF2诱导的roXl表达依赖于FGFR信号转导的MAPK途径下游的特异性活化。
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权利要求
1.特定浓度的FGF2用于控制来源于hPS细胞的定形内胚层细胞向特定内胚层细胞的分化的用途。
2.前述权利要求中任一项的用途，其中所述hPS细胞是hBS细胞。
3.权利要求I的用途，其中培养基中FGF2的浓度小于或等于500ng/ml。
4.前述权利要求中任一项的用途，其中FGF2的浓度的范围为约O.I至约16ng/ml并且所述特定内胚层细胞是肝内胚层细胞。
5.前述权利要求中任一项的用途，其中FGF2的浓度的范围为4ng/ml至6ng/ml，例如 5ng/ml，并且所述特定内胚层细胞是肝内胚层细胞。
6.权利要求4-5的用途，其中所述肝内胚层细胞表达AFP和一种或多种下列标记 F0XA2、白蛋白(ALB)、HNF4A、HNF6 (ONECUT)、Proxl、CK17、CK19、Hex、FABpl、AAT、Cyp7A1、 Cyp3A4、Cyp2B6、Cyp3A7。
7.权利要求4-5的用途，其中所述肝内胚层细胞表达下列标记ALB、HNF6和HNF4A。
8.权利要求4-7中任一项的用途，其中所述肝内胚层细胞表达两种或更多种下列标记AFP、HNF4A、Proxl。
9.权利要求1-3中任一项的用途，其中FGF2的浓度的范围为约16至约150ng/ml，例如64ng/ml，并且所述特定内胚层细胞是胰内胚层细胞。
10.权利要求9的用途，其中胰内胚层细胞表达I3DXl和一种或多种下列标记NGN3、 CPA1、S0X9、HNF6、HNF1 b、E-钙黏着蛋白、MNXl、PTFl A 和 NKX6-1。
11.权利要求9或10的用途，其中所述胰内胚层细胞表达I3DXl和NKX6-1。
12.权利要求9-11中任一项的用途，其中所述胰内胚层细胞表达下列标记S0X9、 ONECUTI、F0XA2。
13.权利要求9-12中任一项的用途，其中所述胰内胚层细胞表达至少一种选自胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽和ghrelin的胰激素。
14.权利要求1-3中任一项的用途，其中FGF2的浓度的范围为约150至约500ng/ml并且所述特定内胚层细胞是肠和/或肺内胚层细胞。
15.权利要求14的用途，其中所述特定内胚层细胞是表达⑶X2和一种或多种下列标记的肠细胞CDXI、F0XA2、PITX2、FABp 2、TCF4、绒毛蛋白和 MNXI。
16.权利要求14或15的用途，其中所述特定内胚层细胞是表达⑶XI、⑶X2和MNXl的肠内胚层细胞。
17.权利要求14的用途，其中所述特定内胚层细胞是表达一种或多种下列标记的肺内胚层细胞NKX2-1、SHH、PTCHl 和 SPRY2。
18.前述权利要求中任一项的用途，其中所述分化包括在含有FGF2的培养基中对定形内胚层细胞的孵育，所述FGF2的浓度适于分化成合乎需要的分别如权利要求4、9和14所限定的内胚层命运。
19.用于制备肝内胚层细胞的方法，所述方法包括将定形内胚层细胞在含有O.I至 16ng/ml FGF2的培养基中孵育约2至20天,例如6至8天或9至12天。
20.通过权利要求19中限定的方法可获得的肝内胚层细胞。
21.具有如权利要求6-8中任一项所限定的特征的权利要求18的肝内胚层细胞。
22.用于制备胰内胚层细胞的方法，所述方法包括将定形内胚层细胞在含有16至150ng/ml FGF2的培养基中孵育约2至20天，例如6至8天。
23.通过权利要求22中限定的方法可获得的胰内胚层细胞.
24.具有如权利要求10-13中任一项所限定的特征的权利要求21的胰内胚层细胞。
25.用于制备肠和/或肺内胚层细胞的方法，所述方法包括将定形内胚层细胞在含有 150至500ng/ml FGF2的培养基中孵育约2至20天，例如6至8天。
26.通过权利要求25中限定的方法可获得的肠和/或肺内胚层细胞。
27.具有如权利要求14-17中任一项所限定的特征的权利要求24的肠和/或肺内胚层细胞。
28.用于制备肝、胰或肠内胚层细胞的方法，所述方法包括诱导FGFR。
29.权利要求28的方法，其中FGFR是FGFRl、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4。
30.权利要求28或29的方法，其中通过向定形内胚层细胞的培养物加入FGF来诱导 FGFR。
31.权利要求28-30中任一项的方法，其中MAPK信号转导途径通过FGFR-诱导激活。
32.用于制备以下细胞的权利要求28-31中任一项的方法i)具有如权利要求6-8中任一项所限定的特征的肝内胚层细胞， )具有如权利要求10-13中任一项所限定的特征的胰内胚层细胞，或iii)具有如权利要求15-17中任一项所限定的特征的肠和/或肺细胞。
33.前述权利要求中任一项的方法，其中所述胰内胚层细胞包括表达增殖标记例如 MKI67.PH3.Brdu 的祖细胞。
全文摘要
本发明涉及控制人多潜能干细胞包括人胚泡来源的干(hBS)细胞分化和获得特定内胚层细胞的方法。特别地，本发明涉及将特定浓度的FGF2用作关键因子以控制来源于hPS细胞的定形内胚层细胞分化成特定内胚层细胞。本发明还提供获得内胚层细胞的方法，所述方法包括FGFR的使用和MAPK信号转导途径的激活。
文档编号C07K14/50GK102596989SQ201080025037
公开日2012年7月18日 申请日期2010年5月28日 优先权日2009年5月29日
发明者H·塞姆布, J·阿梅里 申请人:塞拉蒂斯股份有限公司, 诺沃-诺迪斯克有限公司