专利名称：一种连续提取番茄红素的方法
技术领域：
本发明属于生物分离领域，涉及一种连续提取番茄红素的方法。利用该方法可以 有效地从毛霉菌属真菌三孢布拉霉菌(Blaleslea trispora)发酵菌丝体中提取番茄红素。
背景技术：
番茄红素是一种脂溶性天然色素，属于类胡萝卜素。番茄红素具有比其他类胡萝 卜素更为优越的性能，如其抗氧化性在类胡萝卜素中最强，猝灭单线态氧能力是VE的100
倍，是β-胡萝卜素的2倍多，清除自由基的能力也优于其他类胡萝卜素。其具有极强的抗 氧化作用，可抑制癌细胞生长，减缓低密度脂蛋白(LDL)的氧化，防治动脉硬化，保护心血 管，清除香烟和汽车废气中的有毒物质等。番茄红素的生产方法主要有天然提取、化学合成、微生物发酵等，而微生物发酵 法生产番茄红素具有成本低、污染小、安全及工艺简单等优势，近年来成为研究热点之一。 目前，不少研究人员开始研究利用微生物生产番茄红素，其中研究最多的是利用三孢布拉 霉(Blakeslea trispora)真菌发酵获得番茄红素的方法(CN 1353765A ；CN 1370241A ；US 2005/0106657A1 ；US 3369974 ；GB 1008469)。目前报道的提取方法绝大多数为有机溶剂提 取，溶剂消耗大，提取过程中番茄红素受到光照、空气等影响极易氧化，番茄红素损失较大。 专利CN1760282A报道超临界CO2萃取番茄红素，提取率高，无溶剂残留，提取时间短，但因 设备昂贵，成本高而无法实现工业化生产。
发明内容
本发明的目的是在于克服现有技术的不足，而提供一种适合于工业化生产番茄红 素，并且生产成本低、操作方便安全、提取率高的利用三孢布拉霉菌工业化生产番茄红素的 方法。本发明的目的可以通过下列技术措施来达到一种利用混合溶剂连续提取番茄红素的方法，其特征在于包含以下步骤a.三孢布拉霉菌发酵菌丝体加入乙醇进行脱水处理，过滤分离菌丝体与乙醇处理 液；对湿菌丝体通过真空干燥和粉碎，得到干燥菌丝体；b.经步骤a处理的菌丝体，加入混合溶剂进行固相_液相萃取在连续提取系统 的各提取单元中加入经步骤a处理的菌丝体，采用混合提取溶剂连续循环提取一定时间使 各单元按浓度梯度排列，再阶段逆流提取至番茄红素提取干净，收集萃取液；c.步骤(b)中萃取液经真空浓缩，得到番茄红素浓缩液。所述的方法，其中步骤a中乙醇浓度在50% -100%之间，乙醇与三孢布拉霉菌发 酵菌丝体的体积质量比(L/Kg)在1 1-10 1，常温下处理5-180分钟。 所述的方法，其中乙醇处理液经低压蒸馏处理可循环使用。 所述的方法，其中步骤a中真空干燥温度在30°C -80°C，真空干燥时间在1_24小
时，优选4-12小时。
所述的方法，其中步骤b中固相-液相萃取阶段所用的混合提取溶剂以正己烷 为主要溶剂，以丙酮、乙酸乙酯或石油醚为辅助溶剂，主要溶剂与辅助溶剂的体积比为 1 1-10 1，优选正己烷/丙酮混合溶剂，正己烷与丙酮的体积比为1 1-5 1，优选 2:1-5:1。所述的方法，其中步骤b中连续提取系统由6-16根层析柱、储液罐、循环泵、阀门 和管道组成；每一提取单元由2-5根层析柱串联而成，包括配套储液罐、循环泵、阀门和管 道；连续提取系统能避光操作。所述的方法，其中步骤b中每个单元按浓度梯度排列按以下操作实现单元1-5分 别加入等量经步骤a处理的菌丝体，单元5加入新鲜混合提取溶剂提取t ( 一次阶段提取时 间)后排出提取液，单元2-4分别进行t1/4、t2/4、t3/4(即为1/4、2/4、3/4阶段提取时间)的 提取，将单元2和4的溶剂互换，最后在单元5加入新鲜混合提取溶剂，使各个单元按照图 2过程一开始提取时所示的浓度梯度排列，即制造好浓度梯度。所述的方法，其中连续提取系统每一过程均提取t1/4后对番茄红素被提净的单元 5进行排渣装料，对不饱和溶剂按番茄红素浓度递减的反方向迁移至隔一单元；经过六个 操作过程，所有单元又回到起始浓度状态，实现连续操作，如图2所示。所述的方法，其中连续提取的方式为逆流提取；提取温度在于20-60°C，优 选30-50°C ；提取溶剂用量在于5-40mL/g菌丝体，优选5_20mL/g菌丝体；回流速度为 0. 6-3. 6BV/h (BV为床体积)，优选0. 6-1. 8BV/h ；回流次数在于3_6次，优选2_3次；提取时 间为2-8h，优选于2-4h ；提取单元组数为3-6组，优选5-6组。所述的方法，其中各提取单元中加入等量经步骤a处理的菌丝体。进一步，具体操作过程如下(1)三孢布拉霉菌发酵液经过滤处理后，得到湿菌丝体。(2)将步骤(1)中的湿菌丝体进行预处理，其预处理条件优选为a).湿菌丝体与乙醇在常温下搅拌，过滤得到脱水菌丝体和乙醇处理液，湿菌丝体 与乙醇质量体积比为1 1-1 10之间，优选于1 1-1 5之间；b).乙醇处理液经低压蒸馏处理可循环使用；脱水湿菌丝体通过真空干燥和粉 碎，得到干燥菌丝体。(3)经步骤(2)的干燥菌丝体，加入混合溶剂进行固相_液相萃取，在连续提取系 统的各提取单元中加入等量经步骤(2)处理的菌丝体，采用混合提取溶剂连续循环提取一 定时间使各单元按浓度梯度排列，再阶段逆流提取至番茄红素提取干净，收集萃取液。其提 取条件优选于a).各单元浓度梯度排列按以下操作实现单元5加入新鲜混合提取溶剂提取 t ( 一次阶段提取时间)后排出提取液，单元2-4分别进行t1/4、t2/4、t3/4阶段提取时间的提 取，将单元2和4的溶剂互换，最后在单元5加入新鲜混合提取溶剂，使各个单元按照图2 过程一开始提取时所示的浓度梯度排列，即制造好浓度梯度；b).连续提取过程按以下操作实现每一过程均提取t1/4后对番茄红素被提净的 单元5进行排渣装料，对不饱和溶剂按番茄红素浓度递减的反方向迁移至隔一单元；经过 六个操作过程，所有单元又回到起始浓度状态，实现连续操作，如图2所示；c).混合提取溶剂以正己烷为主要溶剂，丙酮为辅助溶剂，其体积比为1 1-10 1之间，优选于2 1-5 1之间；d).连续提取的方式为逆流提取；e).提取温度在于20_60°C之间，优选于30_50°C之间；f).提取溶剂用量在于5_40mL/g菌丝体之间，优选于5_20mL/g菌丝体之间；g) ·回流速度为0. 6-3. 6BV/h的流速之间，优选于0. 6-1. 8BV/h之间；h).回流次数在于2-6次之间，优选于2-3次之间；i).提取单元组数为3-6组，优选于5-6组之间；j).提取时间为2_8h，优选于2_4h之间。(4)将步骤(3)中萃取液经真空浓缩，得到番茄红素浓缩液。连续提取系统主要包括层析柱、储液罐、循环泵、控制阀、管道。连续提取系统中的层析柱是指可装填菌丝体进行萃取的柱状容器。本发明的优点在于1、本发明采用混合溶剂提取番茄红素，充分发挥各溶剂对番茄红素的溶解作用。2、本发明的技术优势在于操作的连续性，且可避光操作，减少了间歇操作对番茄 红素不稳定的影响。3、本发明与传统溶剂提取法比，溶剂消耗少，处理量大，提取时间短，能耗低，成本 相对较低，易工业化生产。
图1为实施例中的连续提取系统装置简图，该系统由5个提取单元组成，每个提取 单元包括层析柱、储液罐、循环泵、控制阀、管道。图中1管道，2层析柱，3储液罐，4控制 阀，5循环泵，6总管道(连接各单元)。图2为连续提取工艺流程示意图。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。本发明所述的三孢布拉霉菌发酵菌丝体是采用下列方法制备得到的本发明采用三孢布拉霉菌(Blaleslea trispora) (+)(-)为发酵菌种，经摇瓶一级 种子培养、二级种子发酵培养和发酵罐三级发酵培养得到三孢布拉霉菌发酵液；发酵完成 后采用板框压滤法去除发酵液中过多的水分，湿菌丝体经95%乙醇搅拌处理2h，再经板框 压滤干燥得预处理菌丝体，酒精处理液经精馏塔回收利用。本发明采用的提取过程结合图1和图2，提取“过程一”至“过程五”各提取单元溶剂迁移路线、进料和排 渣、加入新鲜溶剂和提取液导出等操作规律(系经过多个过程后建立的)，“过程六”及以后 的四个提取过程为“过程一”至“过程五”的重复。具体操作包括a.造梯度先分别将单元1和5装入预处理后菌丝体，单元5加入新鲜混合提取 溶剂提取一次阶段提取时间t后排出提取液，单元2-4分别进行t1/4、t2/4、t3/4阶段提取时 间的提取，将单元2和4的溶剂互换，最后在单元5加入新鲜混合提取溶剂，使各个单元按照图2过程一开始提取时所示的浓度梯度排列，即制造好图2所示浓度梯度；b.排渣装料每一过程均再提取t1/4后对番茄红素被提净的单元5进行排渣，装 料；c.饱和溶剂迁移将单元1的饱和溶剂转移入储液罐中，本过程只涉及溶剂已饱 和的单元(即被提净单元5的下一单元)；d.不饱和溶剂迁移①3— 1;②5 — 3;③2 — 5;④4 — 2，本过程涉及4个单 元，其迁移遵循规律即按番茄红素浓度递减的反方向迁移至隔一单元；e.填充溶剂对单元4填入新鲜混合提取溶剂；f.经过六个操作过程，所有单元又回到起始浓度状态，实现连续操作。实施例1将三孢布拉霉菌(Blaleslea trispora)原菌株单菌落自斜面接种到500mL摇瓶 中进行摇瓶种子培养，装液量10%，培养温度30°C，转速200r/min，培养30h。将一级摇瓶 种子液接种至2. 5L摇瓶中进行二级种子培养，培养温度维持在30°C，转速200r/min，培养 30h。种子培养完毕将其接种到50L发酵罐中进行发酵培养，装料系数60 %，装料量30L，培 养温度维持在30°C，转速200r/min，通气量0. 2-0. 5L/min,培养120h。发酵完成后得28L发酵液，采用离心法去除发酵液中过多的水分，得到3kg湿菌 丝体，然后加入3L 95%乙醇混合搅拌2h，再经板框压滤得到0. 8kg菌丝体，湿菌丝体通过 真空干燥(真空干燥温度在30°C -80°C之间，真空干燥时间优选4-12小时)和粉碎，得到 预处理后的干燥菌丝体，乙醇处理液经低压蒸馏处理可循环使用；预处理菌丝体用正己烷 /丙酮混合溶剂(体积比为1 1-10 1，优选3 1)采用连续提取系统进行逆流提取 (提取过程如前所述)，提取条件为提取温度30°C，提取溶剂用量10mL/g菌丝体，回流速 度1. 2BV/h,回流2-3次，提取时间2-4h，提取单元组数5组；提取液经真空浓缩得到番茄红 素浓缩液。实施例2取实施例1所述经预处理的菌丝体10g，置500mL圆底烧瓶中，加入400mL正己 烷/丙酮混合提取溶剂，40°C搅拌提取lh，提取三次，该操作条件下番茄红素的提取率达 81. 42%o取实施例1所述经预处理的菌丝体50g装入层析柱中，加500mL正己烷/丙酮混 合溶剂，30°C下以1. 2BV/h的流速逆流循环提取1. 5h，回流三次，该操作条件下番茄红素的 提取率达88%。实施例3取实施例1所述经预处理的菌丝体250g，等量加入如图1所示的具有5个提取单 元的连续提取系统的各层析柱中，单元5加入新鲜溶剂一次阶段提取1. 5h后排出提取液， 单元2-4分别进行22. 5min、45min、67. 5min的一次阶段提取，将单元2和4的溶剂互换，最 后在单元5加入新鲜溶剂，使各个单元按照图2所示的浓度梯度排列；继续提取22. 5min后 对已被提净的单元5进行排渣装料，将单元1的饱和溶剂转移至储液罐中；对不饱和溶剂按 番茄红素浓度递减的反方向迁移至隔一单元；迁移完后对单元4填入新鲜溶剂。各单元提 取条件为温度30°C，提取单元组5组，每组10mL/g菌丝体的溶剂，以1. 2BV/h的流速逆流 循环提取1. 5h。其他同实施例1，该操作条件下番茄红素的提取率可达94. 76%。
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各种工艺的提取结果见表1 表1提取工艺比较
搅拌提取 81.423 120 40
单柱提取 884.5 60 30
连续逆流提取 94.761.875 20 30 连续动态逆流提取的番茄红素提取率最高，分别比搅拌法和单柱法高了 13. 34% 和6. 76%，提取时间比单柱法缩短了三分之一，溶剂用量仅为搅拌法的1/6，提取温度近乎 常温，显示出了连续逆流提取的优越性。
权利要求
1.一种利用混合溶剂连续提取番茄红素的方法，其特征在于包含以下步骤a.三孢布拉霉菌发酵菌丝体加入乙醇进行脱水处理，过滤分离菌丝体与乙醇处理液； 对湿菌丝体通过真空干燥和粉碎，得到干燥菌丝体；b.经步骤a处理的菌丝体，加入混合溶剂进行固相-液相萃取在连续提取系统的各 提取单元中加入经步骤a处理的菌丝体，采用混合提取溶剂连续循环提取一定时间使各单 元按浓度梯度排列，再阶段逆流提取至番茄红素提取干净，收集萃取液；c.步骤(b)中萃取液经真空浓缩，得到番茄红素浓缩液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中乙醇浓度在50%-100%之间，乙 醇与三孢布拉霉菌发酵菌丝体的体积质量比在1 1-10 1，常温下处理5-180分钟。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于乙醇处理液经低压蒸馏处理可循环使用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中真空干燥温度在30°C-80°C，真空 干燥时间在1-24小时，优选4-12小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中固相-液相萃取阶段所用的混 合提取溶剂以正己烷为主要溶剂，以丙酮、乙酸乙酯或石油醚为辅助溶剂，主要溶剂与辅 助溶剂的体积比为1 1-10 1，优选正己烷/丙酮混合溶剂，正己烷与丙酮的体积比为 1:1-5: 1，优选 2 1-5 1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中连续提取系统由6-16根层析柱、 储液罐、循环泵、阀门和管道组成；每一提取单元由2-5根层析柱串联而成，包括配套储液 罐、循环泵、阀门和管道；连续提取系统能避光操作。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中每个单元按浓度梯度排列按以下 操作实现单元1-5分别加入等量经步骤a处理的菌丝体，单元5加入新鲜混合提取溶剂提 取t(一次阶段提取时间)后排出提取液，单元2-4分别进行t1/4、t2/4、t3/4(即为1/4、2/4、 3/4阶段提取时间)的提取，将单元2和4的溶剂互换，最后在单元5加入新鲜混合提取溶 剂，使各个单元按照图2过程一开始提取时所示的浓度梯度排列，即制造好浓度梯度。
8.根据权利7所述的方法，其特征在于连续提取系统每一过程均提取t1/4后对番茄红 素被提净的单元5进行排渣装料，对不饱和溶剂按番茄红素浓度递减的反方向迁移至隔一 单元；经过六个操作过程，所有单元又回到起始浓度状态，实现连续操作，如图2所示。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于连续提取的方式为逆流提取；提取温度在 于20-60°C，优选30-50°C ；提取溶剂用量在于5_40mL/g菌丝体，优选5_20mL/g菌丝体；回 流速度为0. 6-3. 6BV/h (BV为床体积)，优选0. 6-1. 8BV/h ；回流次数在于3-6次，优选2-3 次；提取时间为2-他，优选于2-4h ；提取单元组数为3-6组，优选5-6组。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于各提取单元中加入等量经步骤a处理的菌 丝体。
全文摘要
本发明属于生物分离领域，公开了一种连续提取番茄红素的方法。该方法将三孢布拉霉菌发酵菌丝体加入乙醇进行脱水处理，过滤分离菌丝体与乙醇处理液；对湿菌丝体通过真空干燥和粉碎，得到干燥菌丝体；将所得干燥菌丝体加入混合溶剂进行固相-液相萃取在连续提取系统的各提取单元中加入菌丝体，采用混合提取溶剂连续循环提取一定时间使各单元按浓度梯度排列，再阶段逆流提取至番茄红素提取干净，收集萃取液；萃取液经真空浓缩，得到番茄红素浓缩液。该方法采用混合溶剂提取番茄红素，充分发挥各溶剂对番茄红素的溶解作用，操作具有连续性且可避光操作，溶剂消耗少，处理量大，提取时间短，能耗低，成本相对较低，易工业化生产。
文档编号C07C7/10GK102140052SQ20101061557
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者万红贵, 卢定强, 吴启赐 申请人:南京工业大学