专利名称：一种日本脑炎颗粒疫苗及其制备方法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种嵌合表达日本脑炎病毒多表位抗原的病毒样颗粒疫苗及其制备方法 和应用，属于生物技术领域，专用于人和易感动物的日本脑炎的免疫预防。
背景技术：
H 1 ^(Japanese Encephalitis, JE) : 一 禾中由 H ^ H iit #(Japanese Encephalitis Virus, JEV)引起的人畜共患虫媒传染病，人和马呈现脑炎症状，猪主要表 现为繁殖障碍，其它动物大多隐性感染。该病主要发生于东南亚地区，我国是日本脑炎重要 疫区之一，每年人类的发病数仅次于印度。近年来，随着全球气候变暖以及生态环境变化导 致日本脑炎分布范围扩大、流行时间变长，危害程度日益增强。日本脑炎病毒虽然存在5个基因型，但该病毒只有一个血清型。大量的研究表明 体液免疫尤其是病原特异性中和抗体水平与人和动物的抗日本脑炎感染水平高度一致，细 胞免疫水平决定了感染机体对该病毒的清除能力。接种疫苗是疫区内人和易感动物预防日本脑炎的重要措施之一。商品化应用的日 本脑炎疫苗有两种，一种为日本脑炎灭活疫苗，早期为鼠脑纯化病毒灭活疫苗，少数人应 用后有负反应，近来改用中国仓鼠肾细胞(BHK21)或非洲绿猴肾细胞(VERO)为生产基质， 一般需要接种2至3次；另一种为日本脑炎弱毒活疫苗，由我国生物制品检定所研制，毒株 为JEV SA14-14-2，该疫苗一次免疫接种即可产生较好的免疫保护效果，但由于日本脑炎疫 苗弱毒存在潜在毒力反强风险，世界卫生组织至今没有批准该疫苗在全球广泛应用。基因工程亚单位疫苗由于安全性好、受母源抗体干扰小、能够配套试剂盒区分疫 苗免疫和野毒感染等优点具有广阔的应用前景。然而基因工程亚单位抗原免疫原性相对较 弱、抗体应答慢，为了更好的激发机体的免疫系统，使其对日本脑炎病毒有足够的抵抗力， 有必要寻求安全高效的方法提高基因工程亚单位疫苗的免疫效果。病毒样颗粒(Virus-like particle, VLP)是由病毒结构蛋白自行装配而成的高 度结构化的蛋白颗粒，缺乏病毒核酸，无感染性。一些VLP表面能够重复高密度展示外源抗 原表位，从而诱导针对外源抗原表位高效免疫应答。近来的研究表明，一些VLP能有效通过 MHC I类和MHC II类途径递呈抗原，诱导CTL细胞应答，激发Thl和Th2型免疫反应，一些 病毒的VLP可诱导树突状细胞和单核巨嗜细胞群在体内外的成熟和细胞因子的表达。因 此，应用嵌合病毒样颗粒抗原制备疫苗具有安全高效的特点。人类乙肝病毒的核心抗原(HBc)在病毒感染过程能够自发组装成病毒样颗粒，包 裹病毒的核酸。HBc自发形成的病毒样颗粒有两种大小，分别为由180个和240和单体核心 抗原组成的二十面体。HBc全长为183 Aa，其中75-82Aa为抗原显现区，展示病毒样粒子表 面，构成中间穗状区。HBc的C末端39个Aa富含精氨酸，具有结合包装病毒核酸的功能，去 除后不影响HBc形成病毒样颗粒。截断的HBc (l_149Aa)能在大肠杆菌中高效表达，并自 主装配成病毒样颗粒，HBc (l-149Aa)HBc的中间穗状区和截断的C末段都暴露在病毒粒子 的表面，这些区域可融合表达外源的抗原表位[Birkett A, Lyons K, Schmidt A, et al. A modified hepatitis B virus core particle containing multiple epitopes of thePlasmodium falciparum circumsporozoite protein provides a highly immunogenic malaria vaccine in preclinical analyses in rodent and primate hosts. Infect Immun 2002; 70 (12) : 6860 - 6870. [PubMed: 12438363]。一些融合外源 B 细胞抗原表位或 T细胞抗原表位的HBc仍可组装成嵌合VLP，诱导免疫动物产生强烈的免疫应答，尤其是在 HBc分子中间的穗状区插入的外源抗原表位诱导的免疫效果最佳。作为一种新型的抗原表 位递呈系统，HBc-VLP已被成功用于艾滋病、丙型肝炎以及疟疾新型疫苗的研制，有的已进 入临床二期研究。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种新型的日本脑炎颗粒疫苗。该疫苗安全高效，不含感染性病 毒核酸，抗原纯度高，能够快速诱导接种机体产生抗日本脑炎病毒感染的保护性免疫应答。 用于人和易感动物对日本脑炎的免疫预防，安全、高效的预防日本脑炎的发生。技术方案
本发明提供了一种用于预防日本脑炎的病毒样颗粒疫苗，该疫苗的抗原成份为嵌合 JEV中和抗原表位和CTL抗原表位的乙肝病毒核心抗原自主装配的病毒样颗粒，通过大肠 杆菌可溶性表达、纯化制备。日本脑炎病毒样颗粒抗原用生理盐水适当稀释或与免疫佐剂 配伍后制成本发明所述的日本脑炎颗粒疫苗。有益效果
日本脑炎颗粒疫苗接种小鼠后快速诱导产生病原特异性中和抗体，二免2周后小鼠获 得对致死剂量日本脑炎病毒攻击的抵抗力，并显示出较强的免疫记忆，病原特异性中和抗 体水平显著升高，100%保护小鼠对日本脑炎强毒的攻击。
图1.表达载体PETj8a-VLP-con构建示意图 图2.表达载体PETj8a-VLP-JEV构建示意图 图3. HBV核心抗原(A:VLP-con)电镜照片(X 150，000倍)
图4嵌合表达日本脑炎病毒表位抗原的病毒样颗粒(B: VLP-JEV)电镜照片(X 150，000
倍)
图5.日本脑炎颗粒疫苗接种小鼠产生的抗日本脑炎病毒EDIII蛋白抗体水平 图6.日本脑炎颗粒疫苗接种小鼠产生的抗日本脑炎病毒抗体水平 图7.日本脑炎颗粒疫苗接种小鼠产生的中和抗体水平 图8.日本脑炎颗粒疫苗接种小鼠的攻毒保护情况。
具体实施例方式本具体实施方式
涉及的实验方法或步骤，参照《分子克隆实验指南》(第二版)广60 页、672 681页和822 847页。实施例1
一、乙肝病毒核心抗原骨架蛋白(HBc-con)原核表达载体PET28a-VLP-C0n的构建 参照GenBank数据库中乙肝病毒基因序列(AY707087. 1)人工设计合成乙肝病毒核 心抗原骨架蛋白(HBc-con)编码基因(其核苷酸序列为kq NO. 3)。与乙肝病毒核心抗原l-149Aa的编码基因相比，HBc-con编码基因在231位和238位有2个人工构建的酶切位点 BamH I和EcoR I，HBc_con在HBc第78位和79位Aa插入四个氨基酸PEFS ；在乙肝病毒 核心抗原骨架蛋白(HBc-con)编码基因的两端分别添加Nco I和)(h0 I位点，以便乙肝病 毒核心抗原骨架蛋白(HBc-con)编码基因导入PET-28a载体；乙肝病毒核心抗原骨架蛋白 (HBc-con)编码基因没有带终止密码子，以便利用PET-28a表达盒下游的his标签。乙肝病 毒核心抗原骨架蛋白(HBc-con)编码基因经Nco I和Xho I位点导入PET48a，获得乙肝 病毒核心抗原骨架蛋白(HBc-con)原核表达载体，命名为PET28a-VLP-C0n，测序结果表明 与设计一致。二、嵌合日本脑炎病毒抗原表位的病毒样颗粒抗原(VLP-JEV)原核表达载体 PET28a-VLP-JEV 的构建
设计三对引物，通过重组PCR方法、酶切和连接的方法分别将日本脑炎病毒E蛋 白上的两个中和抗原表位和一个CTL抗原表位导入HBc骨架蛋白。两个中和抗原表位 “ 327SYSGSDGPCKI337” [ffu S-C, Lin C-ff. Neutralizing peptide ligands selected from phage-displayed libraries mimic the conformational epitope on domain III of the Japanese encephalitis virus envelope protein. Virus Res 2001；76:59-69.]禾口 "384VVGRGDKQI392 " [Seif, S. Α.，Morita, K.，Matsuo, S.，Hasebe, F. and Igarashi, Α. , Finer mapping of neutralizing epitope (s) on the C-terminal of Japanese encephalitis virus Ε-protein expressed in recombinant Escherichia coli system. Vaccine 1995. 13: 1515-1521.]展示在HBc的抗原中间穗状区，即HBc第78位和79 位 Aa 之间，CTL 抗原表位 “6CICYHASVTDI 68“ [Takada, K. , Masaki, H. , Konishi, Ε., Takahashi, M. and Kurane, I. , Definition of an epitope on Japanese encephalitis virus (JEV) envelope protein recognized by JEV-specific murine CD8+ cytotoxic T lymphocytes. Arch Virol 2000. 145: 523-534.]插入 HBc 的 C 末段。PI: CGATCCATGGACATTGACCCTTNco I Mseq NO. 4
P2:5~-TCTGGATCCTCGATTTTGCACGGGCCATCGCTGCCGCTATAGCTCAAGTTATTACCCAC-3' BamH I 见 seq NO. 5
P3: 5‘-ATAGAATTCGTGGTGGGCCGTGGCGATAAACAGATCTCCCCAGCATCTAGG -3 seq N06
P4: CAACTCGAGAACCACAGTAGTTTCCXho I 见 seq NO. 7
P5: CGATCCATGGACATTGACCCTTNco I 见 seq NO. 8
P6: -CAACTCGAGGATATCGGTCACGCTCGCATGATAGCAAACCACAGTAGTTTCC-3' seq NO. 9
Pl 和 P2 引入 JEV 中和抗原表位“ 327SYSGSDGPCKI337，，；见 seq NO. 10 P3 和 P4 引入 JEV 中和抗原表位“384VVGRGDKQI3i32” ；见 seq NOll P5 和 P6 引入 JEV CTL 抗原表位 “6° CYHASVTDI 68”。见 seq NO. 12。所述的PCR 的条件均为 94°C、5min ;94°C、30sec, 50°C、30sec, 72°C、30sec, 30 个 循环；72°C、7 min。重组基因经Nco I和Bio I位点导入ΡΕΤ48ει，获得嵌合日本脑炎病毒抗原表位 的病毒样颗粒抗原(VLP-JEV)原核表达载体，命名为PET28a-VLP-JEV，经测序验证正确。
三、日本脑炎颗粒抗原在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化
将PET28a-VLP-Con和PET28a_VLP_JEV转化大肠杆菌(BL21 DE3 )，将阳性菌株在LB培 养基中37°C培养至细菌浓度为0D600 ^ 0. 4，然后在18 20°C环境中用终浓度为0. ImM异 丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达12tTl5h。离心收集菌体，超声波裂解，将大肠杆菌裂解 液上清12000rpm离心30分钟后，用终浓度为20%的硫酸胺沉淀颗粒抗原、生理盐水溶解后 0. 22 μ m过滤，应用kpharose CL-4B分子筛层析纯化，获得颗粒抗原，其氨基酸序列为kq NO. 1、核苷酸序列为kq NO. 2。HBc-con和VLP-JEV能在大肠杆菌中高效可溶性表达，并自 主装配成病毒样颗粒(图1)
四、日本脑炎颗粒疫苗小鼠免疫保护试验 试验方案
6周龄BALB/C小鼠，分为5组，每组5只，分别免疫接种生理盐水稀释的VLP-Con、 VLP-JEV以及ISA206佐剂乳化VLP-JEV，每只小鼠免疫的颗粒抗原含量均为50 μ g ；商品疫 苗对照组为猪用日本脑炎弱毒疫苗(武汉科前兽医生物制品有限公司)，每只小鼠接种1/10 猪用剂量；空白对照每只小鼠接种100μ L生理盐水。首免后2周加强免疫一次，各组疫苗 种类与剂量与初免相同。二免后2周免疫小鼠用10倍半数致死剂量(LD5tl)的日本脑炎强 毒(JEV NJ08株)脑内接种攻毒，观察3周。免疫接种前、首免后1周、二免后1周及攻毒后 1周分别眼眶静脉采血，分离血清检测抗体。ELISA抗体的检测采用纯化的重组ED3蛋白为 包被抗原。中和抗体的检测采用病毒(JEV SA14-14-2)空斑减少试验，将病毒空斑减少50% 的最大血清稀释系数定义为中和抗体效价，每组取3个样品测定。试验结果 ELISA抗体
无佐剂的日本脑炎颗粒疫苗和配伍ISA206佐剂的日本脑炎颗粒疫苗免疫小鼠均产生 了针对重组日本脑炎病毒ED3抗原和日本脑炎病毒的抗体反应(图2和图3 )。初次免疫接种 后1周，免疫无佐剂的日本脑炎颗粒疫苗组小鼠产生的日本脑炎抗体水平略高于与ISA206 佐剂的日本脑炎颗粒疫苗，但二免后1周佐剂组日本脑炎抗体水平高于无佐剂组。日本脑 炎颗粒疫苗免疫小鼠产生的针对ED3抗原的抗体水平与日本脑炎商品化疫苗相近，但针对 全病毒的抗体水平颗粒疫苗低于商品化疫苗，推测日本脑炎病毒存在其它的显性抗原表 位。中和抗体
接种日本脑炎颗粒疫苗和商品化弱毒疫苗小鼠均产生了日本脑炎病毒中和抗体(图 4)，二免后1周应用ISA206佐剂的日本脑炎颗粒疫苗免疫小鼠的中和抗体滴度为1:40，与 商品化疫苗相近，无佐剂日本脑炎颗粒疫苗组小鼠的中和抗体稍低，为1:20。日本脑炎颗粒 疫苗接种小鼠在攻毒后一周病毒特异中和抗体水平均有显著提高，表明日本脑炎颗粒疫 苗能诱导较强的免疫记忆反应。攻毒保护
小鼠攻毒保护试验结果(图5)显示接种ISA206佐剂日本脑炎颗粒疫苗和商品化弱 毒疫苗小鼠用10倍LD5tl的日本脑炎病毒强毒(JEV NJ08株)攻毒后均没有死亡，100%免 疫保护；无佐剂日本脑炎颗粒疫苗免疫组小鼠的存活率为70%;接种无日本脑炎抗原表位 的颗粒抗原组小鼠全部死亡。日本脑炎颗粒疫苗能够诱导小鼠产生良好的免疫保护，添加ISA206佐剂日本脑炎颗粒疫苗的免疫保护效果优于无佐剂日本脑炎颗粒疫苗，与商品化弱 毒疫苗相似，这与疫苗接种后诱导的日本脑炎特异性中和抗体水平较为一致。
权利要求
1.一种日本脑炎颗粒疫苗，其特征在于其氨酸酸序列Skq NO. 1。
2.一种日本脑炎颗粒疫苗，其特征在于其核苷酸序列为SeqNO. 2。
3.—种日本脑炎颗粒疫苗的制备方法，其特征在于由日本脑炎病毒两个中和抗原表位 和一个CTL抗原表位分别通过基因重组技术展示在乙肝病毒核心抗原l-149Aa的中间穗状 区和C末段制备获得；其具体步骤如下(1)通过重组PCR的方法或全基因合成方法将日本脑炎病毒囊膜蛋白的中和抗原表位 “ 327SYSGSDGPCKI337”和“384VVGRGDKQI392 ”的编码基因插入乙肝病毒核心抗原l-149Aa的中间 穗状区第78位和79位Aa之间，将日本脑炎病毒囊膜蛋白的CTL抗原表位“6° CYHASVTDI 68”的编码基因插入乙肝病毒核心抗原l_149Aa编码基因C末段；(2)将上述基因插入原核表达载体，并转化大肠杆菌，诱导表达，通过westen-Blot鉴 定获得日本脑炎病毒抗原表位的重组蛋白，通过大肠杆菌裂解上清的电镜观察鉴定表达抗 原形成病毒样颗粒；(3)阳性菌株20°C诱导培养16 18小时，离心收集菌体，用生理盐水稀释为10g/L；超 声波裂解破碎菌体，12000rpm离心10分钟收集上清液；用浓度为20%的硫酸胺沉淀蛋白， 用0. OlM pH7. 2的PBS溶解沉淀，0. 22Mm滤膜过滤后应用kpharose CL-4B层析柱纯化病 毒样颗粒抗原，其氨基酸序列为NO. 1。
4.根据权利要求3所述的一种日本脑炎颗粒疫苗的制备方法，其特征在于所述的嵌合 日本脑炎抗原表位的乙肝病毒核心抗原在大肠杆菌中低温可溶性表达时能自发形成病毒 样颗粒。
5.一种日本脑炎颗粒疫苗的应用，其特征在于将日本脑炎颗粒疫苗用适量生理盐水稀 释或与免疫佐剂配伍，用于人或易感动物日本脑炎的免疫预防。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种嵌合表达日本脑炎病毒多表位抗原的病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用。本发明涉及的疫苗抗原为嵌合表达日本脑炎病毒中和抗原表位和CTL抗原表位的乙肝病毒核心抗原自发装配而成的病毒样颗粒，通过大肠杆菌可溶性表达、纯化制备。日本脑炎病毒样颗粒抗原用生理盐水适当稀释或与免疫佐剂配伍后制成本发明所述的日本脑炎颗粒疫苗。动物试验表明，该疫苗安全高效，接种小鼠产生较高水平的日本脑炎病毒中和抗体，100%保护小鼠对日本脑炎强毒的攻击。
文档编号C07K14/005GK102127554SQ20101059968
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者张羽, 曹瑞兵, 陈溥言 申请人:南京农业大学