专利名称：一种蛋白及其编码基因与应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种蛋白及其编码基因与应用。
技术背景
重金属一般是指比重大于4或5，密度大于4^g/cm3的金属，约有45种，如铜、 铅、锌、铁、钴、镍、钒、铌、钽、钛、锰、镉、汞、钨、钼、金、银等金属。砷，虽 然是非金属元素，但因其具有很高的毒性，往往被归为重金属行列。
过量的重金属对植物具有很强的毒害作用，能够影响到植物的生长发育。陈庆 华等人用重金属Cr6+处理玉米幼苗，结果发现植物体内的丙二醛(MDA)及电导度强度与 Cd的浓度呈极显著的相关性，而叶绿素含量及超氧化物岐化酶60D)则随着处理浓度的 增加而降低。杜天庆等人，采用Cd、Pb, Cr处理小麦幼苗，也发现了类似结果，这说明 Cd、Pb> Cr对植物细胞造成了严重的破坏作用，导致质膜的选择透性减弱，结构破坏， 功能丧失。
自然界中，植物为了适应重金属含量日益升高的生存环境，已经拥有各种对重 金属的解毒和忍耐机制。这些机制主要包括(1)防止重金属进入体内，例如根际微生 物限制金属离子的移动、被根部细胞壁和分泌物束缚、减少跨细胞质膜的输入；(2)主 动将重金属外排；(3)植物体内的螯合作用；(4)植物体内区隔化作用；(6)细胞的自我 修复等作用。
目前的研究结果表明，植物对重金属的抗性机制主要表现为络合作用和区室 化作用。重金属离子与植物体内专一性的结合肽结合后，会降低其在胞内的自由离子 浓度，从而减轻其对植物的毒性。同时，植物会进一步将重金属加以区域化隔离，如 将其区隔于液泡中，以避免细胞中具有重要生物学功能的大分子结构受到金属离子的 伤害。目前研究最多的重金属结合肽为植物络合素(Phytochelatins-PCs)和金属硫蛋白 (Metallothionein) 金属硫蛋白是一类由基因家族编码合成的多肽，而植物络合素是一类 酶促反应合成的富含半胱氨酸的多肽。目前的研究认为植物络合素在重金属解毒中起 重要作用。
红树植物是生长在热带、亚热带海湾河口的优势植物，是该生态系统的重要初 级生产者，对维护环境的生态平衡具有十分重要的作用。作为沿海地区唯一的森林生态 系统，红树林对海湾河口区域的环境具有较高承载力和耐受性，尤其对重金属红树表现 出了优越的抗性。
红树植物重金属抗性分子机制的研究是开发植物修复工程植物的前提和基础。 近年来，人们越来越重视从分子水平探讨红树植物对重金属具较高耐受性的分子生态机 理，以期鉴定可能在红树植物中普遍存在的高效的重金属结合物质及其控制基因。发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白及其编码基因。
本发明提供了一种蛋白质，人工合成，命名为KcPCSl，是如下1)或2)的蛋白 质
1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且与耐逆性相关的由1)衍生的蛋白质。
上述序列2由496个氨基酸残基组成，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
所述蛋白质的编码基因也是本发明保护的范围。
上述序列1由1991个核苷酸组成，编码区为序列表中序列1自5’末端第 140-1627位核苷酸。
所述编码基因为如下1)、2)、3)、4)或5)的基因
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)序列表中序列1自5’末端第140-1627位核苷酸所示的DNA分子；
3)序列表中序列1自5’末端的第140-1658位核苷酸所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)或幻或幻限定的DNA分子杂交且编码耐逆性相关蛋白 的DNA分子；
5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有90%同源性且编码耐逆性相关蛋 白的DNA分子。
含有所述编码基因的重组载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒也是本发明保 护的范围。
所述重组载体为在载体pFL61的BamHI和SalI识别位点间插入所述编码基因得 到的重组载体；
所述重组菌为将所述的重组载体导入宿主菌得到的重组菌，所述宿主菌优选为 酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
扩增所述编码基因全长或任一片段的引物对也是本发明保护的范围，所述引物 对如下所示一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所 示。
本发明的另一个目的是提供一种培育重组酵母的方法。
本发明的方法为将所述的编码基因导入宿主酵母得到的重组酵母，所述重组酵 母的耐逆性高于所述宿主酵母，所述宿主菌优选为酵母Saccharomyces cerevisiae)。
所述耐逆性为耐重金属和/或耐盐，所述重金属优选为镉，所述重金属不为 砷。
所述重组酵母不抗砷。
所述的编码基因通过所述的重组载体导入宿主酵母。
所述蛋白质在重金属污染修复和/或提高植物的耐逆性中的应用，或所述编码 基因在重金属污染修复和/或提高植物的耐逆性中的应用，或所述重组载体在重金属污 染修复和/或提高植物的耐逆性中的应用，或所述重组菌在重金属污染修复和/或提高植 物的耐逆性中的应用；上述应用均为本发明保护的范围。
所述耐逆性为抗重金属和/或耐盐；
所述重金属为镉，所述重金属不为砷。
本发明的实验证明，将licPCS 1基因进行了酵母转化，检测了转化子对镉和砷的 抗性，在野生型酵母中表达KcPCSl基因后，发现转基因酵母对镉Cd的抗性明显增强， 其体内的Cd含量也显著的高于转入空载体的酵母细胞。由于秋茄的生境是高盐环境，检 测了 KcPCSl基因酵母转化子的盐抗性，结果表明KcPCSl基因对酵母盐的抗性有明显提 高，这个结果表明植物络合素对除重金属之外的其他非生物胁迫如盐胁迫等也存在着一 定的作用。
图1为总RNA的琼脂糖凝胶电泳图
图2为秋茄cDNA琼脂糖凝胶电泳图
图3为保守片段琼脂糖凝胶电泳检测图
图4为RACE实验琼脂糖凝胶电泳检测图
图5为酵母表达载体pFL61-KcPCSl检测电泳图
图6为酵母转化子阳性克隆PCR鉴定
图7为表达KcPCSl基因对Cd抗性实验
图8为表达KcPCSl基因对As抗性实验
图9为表达KcPCSl基因对Cd吸收实验
图10为表达KcPCSl基因对盐抗性实验具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
秋茄CKadelia candel, Kc)(可购自雷州市附城南渡河管理处育苗场)采自于福建省厦门市陨等湖，移栽于温室培养。
大肠杆菌DH 5 α (购于北京全式金生物技术有限公司)
酵母Maccharomyces cerevisiae) W303 (野生型)(可购自 Thermo Fisher Scientific 公司，货号为YSC1059)
pGEM-Basy(Prcm^ga公司，氨苄霉素Amp抗性，用于T/A克隆)
pFL61 (Amp抗性，酵母穿梭表达载体)(可购自ATCC公司，ATCC Number 77215 )
实验常用药品购于北京化工厂，如NaCl，LiCl,乙醇，LiAc;
细菌营养物Pepton，Trypton,Yeast Extract 购于 OXOID 公司；Agar 购于绿生 源生物有限公司；-Leu DO Supplement购于大连宝生物公司；
生物酶试剂实验到Taq酶，内切酶均购于购于大连宝生物公司；反转录酶购 于Prormg公司；Marker，DL-2000购于北京全式金生物技术有限公司；
试验用试剂盒RACE试剂盒购于大连宝生物公司；普通质粒小题试剂盒，胶 回收试剂盒购于天根生物公司。
实施例1、KcPCSl基因的获得5
一、KcPCSl 的获得
1、秋茄总RNA提取
a、将用于RNA提取的研钵、药匙、镊子、试剂瓶等均在条件干热灭菌Zh 以上；无Rase塑料管和枪头购于Invitrogen公司。
b、取 0.5ml 提取缓冲液(IOOmmol · L-I Tris-HCl, pH 8.5 ； 500mmol · L_lEDTA.500mmol · L-I NaCl ； 20% SDS ； 5mmol · L-I DTT, pH = 8.5 ； 1.5% (ν/ν) β 一巯基乙醇)装1.5ml离心管中65°C预热；
c、取0. 秋茄(Kadelia candel，Kc)幼嫩叶片，置于液氮中，加入适量PVP研磨至粉末，迅速转移至提取液中，剧烈震荡离心管，将其混勻；
d、将离心管室温平放5min，12000转4°C离心ΙΟη ι，小心取上清至新离心 管；
e、向管中加入0.1ml 5mol · L-1 NaCl，充分混勻，加入0.3ml三氯甲烷，漩涡 震荡2min,充分混勻，40C 12000转离心IOmin ；
f、离心后，溶液分为两层，小心取上层溶液至新离心管，重复步骤5，第二次 抽提，取上层溶液，置于新离心管；
g、向上清中加入1/4体积的2-丁氧乙醇，室温放置20min，4°C 12000转离心 IOmin ；取上清至新管；
h、加入 1/4 体积的 IOmol · L-I LiCl,混勻，_20°C过夜；4°C，12000 转离心 15min,弃上清；沉淀用Iml 75% (V/V)乙醇，洗涤1-2次，晾干；取30 μ 1 DEPC水溶 解沉淀，得到RNA。
采用Trizol提取的秋茄叶片RNA为对照。
1.2%琼脂糖电泳，结果如图1所示，1道Trizol提取的秋茄叶片RNA; 2、 3、4道为改良方法提取的秋茄叶片RNA，从图中看出，2、3、4道能够清晰的观察到 28s, 18s, 5. 三条条带，而Trizol法提取的RNA已经发生了严重的弥散现象，这说明改 良法提取的RNA质量远高于Trizol法提取的RNA，具有较好的完整性。
同时，分别测RNA ^Onm和280nm下的吸光值，结果显示改良法提取的 RNA, OD260与OD2m的比值在1.8-2.0之间。若OD26。/OD28。值小于1.8，说明提取的 RNA中含有蛋白污染；若OD26tZOD28tl值大于2.2，说明所提取的RNA发生了降解。从 实验获得RNAOD26(l/OD28(l值范围，进一步验证了，改良法获得的RNA较为完整，并且具 有较高的纯度。
2、cDNA 合成
选用Promage反转录试剂盒(Cat.No.A3800)，按照说明书操作。
a、取2 μ 1上述得到的RNA，置于冰浴；
b、分别加入1 μ 1 Oligo (dT) 15、2 μ 1水(无RNA酶)，混勻将溶液离心至管 底；
c、70 "C 5min,立即转移至冰浴，力卩入 4 μ 1 ImProm-II 5X Reaction Buffer、2 μ 1 MgC12、1 μ 1 dNTP Mix、1 μ 1 20U RNA 酶抑制剂、1 μ 1 ImProm-II ReverseTranscriptase,最后加入6 μ 1水(无RNA酶)，定容终体积20 μ 1 ；混勻将溶液离心至管底；
d、25°C孵育 5η ι，42°C延伸 60η ι ； 72°C灭火反转录酶 15min，得到 cDNA。
琼脂糖凝胶电泳，结果见图2所示，1道，Trizol提取的秋茄叶片RNA合成 cDNA ； 2、3、4道，为改良方法提取的秋茄叶片RNA合成cDNA ；从图中看出，改良 法获得RNA合成的cDNA在0.1-2kb，而Trizol法获得的RNA合成的cDNA均在Ikb以 下，说明改良法提取的RNA质量较高，有较高的转录活性，普通的Trizol法提取的RNA 质量不能满足以后的实验要求。
3、秋茄KcPCSl保守片段的克隆
设计一对引物，命名为
pcs-5， 5，-AAATGGAAAGGGCCTTGGAG-3 ‘
pcs—3， 5，-CAGCATTATATAGCCACCAATAGG-3 ‘
以上述得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，结果见图3所示，M道，Marker DL-2000 ； 1道，PCR产物，可以看出获得221bp片段。
4、秋茄KcPCSl全长基因的克隆
通过RACE手段获得全长cDNA。设计一对特异引物，命名为
pcsgsp-3， 5，-GGATTGCTGCGAGTCTTTGGATAA-3 ‘
pcsgsp-5， 5，-TCTGATTGAAAGCCTTCCTGTTGT-3 ‘
以及一对锚定引物，命名为
pcs3-T 5' -CATGTGCCTCTTCTGAGAACTGT-3‘
pcs5-T 5’ -TGACAGTTCTCAGAAGAGGCACA-3 ‘
1)3，RACE
a、使用 TaKaRa 3 ‘ -Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code No.D314)进行反转录实 验；
反应体系
_
Total RNA (lug/ul)1 μ 1
3，RACE Adaptor (5umol/L) 1 μ 1
dNTP Mixture (lOmmol/L each) 1 μ 1
RNase Free dH204.5 μ 1
反应条件70°C，IOmin,立即冰上放置2min ；
然后加入下列组分
权利要求
1.一种蛋白质，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且 与耐逆性相关的由1)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。
3.根据权利要求1或2所述编码基因，其特征在于所述编码基因为如下1)、2)、 3)、4)或5)的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5’末端第140-1627位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5’末端的第140-1658位核苷酸所示的DNA分子；4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA分子杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA 分子；5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有90%同源性且编码耐逆性相关蛋白的 DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为在载体pFL61的 多克隆位点插入权利要求2或3所述编码基因得到的重组载体。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为将权利要求4或 5所述的重组载体导入宿主菌得到的重组菌，所述宿主菌优选为酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
7.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或任一片段的引物对，所述引物对如下所 示一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。
8.一种培育重组酵母的方法，为将权利要求2或3所述的编码基因导入宿主酵母得到 的重组酵母，所述重组酵母的耐逆性高于所述宿主酵母。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述耐逆性为耐重金属和/或耐盐，所 述重金属优选为镉。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述的编码基因通过权利要求4 或5所述的重组载体导入宿主酵母，所述宿主菌优选为酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
11.权利要求1所述蛋白质在重金属污染修复和/或提高植物的耐逆性中的应用，或 权利要求2或3所述编码基因在重金属污染修复和/或提高植物的耐逆性中的应用，或权 利要求4或5所述重组载体在重金属污染修复和/或提高植物的耐逆性中的应用，或权利 要求4或5所述重组菌在重金属污染修复和/或提高植物的耐逆性中的应用；所述耐逆性为耐重金属和/或耐盐；所述重金属为镉。
全文摘要
本发明公开了一种蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的一种蛋白质，人工合成，命名为KcPCS1，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与耐逆性相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，将KcPCS1基因进行了酵母转化，发现转基因酵母对镉Cd的抗性明显增强，其体内的Cd含量也显著的高于转入空载体的酵母细胞。
文档编号C07K14/415GK102020707SQ20101052875
公开日2011年4月20日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日
发明者何振艳, 陈宏林, 麻密 申请人:中国科学院植物研究所