专利名称：组织型纤溶酶原激活剂及其片段的亲和肽及其用途的利记博彩app
技术领域：
本发明公开了一种可用于分离纯化组织型纤溶酶原激活剂及其片段的亲和肽，属 于生物技术领域。
背景技术：
组织型纤溶酶原激活剂是纤维蛋白溶解系统中与纤维蛋白溶解相关的一种重要 的丝氨酸蛋白酶类。它能将纤溶酶原激活为纤维蛋白溶解酶，即纤溶酶，被激活的纤溶酶 可催化溶解纤维蛋白，使血栓溶解。由于其特异性及内源性使它被广泛用于急性血栓栓塞 性疾病的临床治疗。目前，应用基因工程的方法已可获得组织型纤溶酶原激活剂突变体 (Val4-Cys261)，研究如何获得低价、安全的组织型纤溶酶原激活剂有良好的应用前景。亲和层析是利用生物分子间专一的亲和力进行分离的一种层析方法。这种专一吸 附能力是由于共价偶联在惰性载体上的物质(配基)与待纯化的物质间专一、可逆的亲和 力(包括静电作用、氢键、疏水作用等)。可用配基是亲和层析的核心部分。用作亲和层析配基分离纯化组织型纤溶酶原激活剂的有苯甲脒及其衍生物，还有 基于组织型纤溶酶原激活剂与纤溶蛋白酶原结合位点设计的肽配基。一些研究通过由三、 四个氨基酸组成的小肽探索组织型纤溶酶原激活剂活性位点的亲和性，已获得肽配基如 QDES。此外还有根据组织型纤溶酶原激活剂与纤维蛋白的特异性结合位点设计的肽配基， 如GPRP，KKKK，KKKKGPRG ；通过组织型纤溶酶原激活剂与纤溶酶原结合位点设计的配基，如 KCPGRVRVVGGC等。相对于仿生亲和配基，肽配基具有高效、安全等优点，即使配基不慎脱落， 也不易造成机体中毒。我国的报道多涉及组织型纤溶酶原激活剂突变体研究，缺少分离纯 化组织型纤溶酶原激活剂的有效方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种组织型纤溶酶原激活剂及其片段的亲和肽及其用途， 可用于分离纯化组织型纤溶酶原激活剂及其片段。为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是该组织型纤溶酶原激活剂及其片段 的亲和肽具有如下结构X1X2X3X4X5X6X7其中，X1为丙氨酸或甘氨酸；X2为脯氨酸或苏氨酸；X3、X4均为谷氨酸；X5为异亮氨 酸、亮氨酸或缬氨酸；X6为甲硫氨酸；X7为天冬氨酸。进一步地，本发明在所述X5和X6之间设有一个氨基酸残基，所述氨基酸残基为异 亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。进一步地，本发明所述X1X2X3X4X5X6X7的序列为选自SEQ ID Nos. 1至12中的任一 种。进一步地，本发明所述氨基酸残基的序列为选自SEQ ID Nos. 13至46中的任一 种。
进一步地，本发明用于分离纯化或检测组织型纤溶酶原激活剂或其片段。进一步地，本发明通过将所述亲和肽连接于固相支持物上以分离纯化或检测组织 型纤溶酶原激活剂或其片段。与现有技术相比，本发明的优点是(1)本发明的亲和肽对组织型纤溶酶原激活剂及其片段具有较强的亲和性，因此 对组织型纤溶酶原激活剂及其片段有较好的分离纯化效果。(2)本发明的亲和肽包含七至八个氨基酸残基，属于小肽，稳定性好，即使不慎脱 落也不易引起机体免疫反应，有较好的安全性。(3)本发明的亲和肽与组织型纤溶酶原激活剂的作用位点为其37环上带正电的 残基，因此本发明的亲和肽也可与组织型纤溶酶原激活剂片段有特异性的相互作用，进而 用于分离纯化组织型纤溶酶原片段。
图1为序列如SEQ ID No. 1所示的亲和肽与组织型纤溶酶原激活剂结合示意图；其中，1表示组织型纤溶酶原激活剂，2表示组织型纤溶酶原激活剂上与配基相吸 附的残基，3表示序列如SEQ ID No. 1所示的亲和肽。
具体实施例方式实施例1 组织型纤溶酶原激活剂及其片段亲和肽配基的设计本发明的亲和肽采用分子动力学方法，是以组织型纤溶酶原激活剂与纤溶酶原激 活物抑制剂作用位点为基础设计的。组织型纤溶酶原激活剂和纤溶酶原激活物抑制剂的三维结构取自蛋白质数据库 (Pdb)。选取纤溶酶原激活物抑制剂的B链，其残基序列如下所示=Met-Ala-Pr0-Glu-Glu-I Ie-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-Phe-Val-Val-Arg-His-Asn-Pro-Thr-Gly-Thr-Val-Le u-Phe-Met-Gly-Gln-Val-Met-Glu-Pro，以此三十三肽为亲和肽，在常温和水环境下对组织 型纤溶酶原激活剂进行至少4ns的分子动力学模拟，过程中让亲和肽与组织型纤溶酶原激 活剂自由吸附，计算体系接近平衡时该三十三肽与组织型纤溶酶原激活物的相互作用能大 小。其中两个谷氨酸与天冬氨酸是该亲和肽与组织型纤溶酶原激活物相互作用的主要位点 (Lamba, D. etc.，J. Mol. Biol.，1996，258，117-135)，因此该三十三肽可简化为包含这三个 带负电残基的八肽片段Ala-Pro-Glu-Glu-IIe-IIe-Met-Asp作为亲和肽，计算该八肽与组 织型纤溶酶原激活剂的相互作用能，比原三十三肽的亲和性略高。因此以该八肽为模板，根 据亲疏水性对带负电残基周围的疏水基(X1X2X5X6位点)进行突变研究，突变的目标氨基酸 残基包括色氨酸、苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸，从中选择与组织型纤溶酶原相互作用较 强的肽作为优选的亲和肽。以上所设计的亲和肽具有第一种结构或第二种结构，其中，第一禾中结构为=X1X2X3X4X5X6X7其中，X1为丙氨酸或甘氨酸；X2为脯氨酸或苏氨酸；X3、X4均为谷氨酸；X5为异亮氨 酸、亮氨酸或缬氨酸；X6为甲硫氨酸；X7为天冬氨酸。第二种结构为在第一种结构的X5和X6之间还设有一个氨基酸残基，所述氨基酸残基为异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。实施例2 组织型纤溶酶原激活剂及其片段的亲和肽与其相互作用能分析采用实施例1中所述方法，以苏氨酸突变体系(即分别将X2X5X6位点突变为苏氨 酸)为例，利用公式(1)计算各亲和肽与组织型纤溶酶原激活剂的相互作用能，结果如表1 所示。Eint = Ep+l-Ep-El (1)公式⑴中，Eint表示组织型纤溶酶原激活剂与亲和肽间的相互作用能，Ep+l表示 组织型纤溶酶原激活剂与亲和肽的总势能，Ep表示组织型纤溶酶原激活剂的势能，&表示 亲和肽的势能。表1组织型纤溶酶原激活剂与不同亲和肽配基结果分析
亲和肽序列 相互作用能/(kcal/mol)
ATQQIIMD-389
APQQTIMD-262
Γ APQQIID-253^^
ATQQIMD-374
APQQTMD-290
ATQQTMD-293
APQQIMD-507从表1可看出，X2位点对亲疏水性变化并不敏感，相对的，X5位点则对亲疏水性变 化敏感，甲硫氨酸缺失的亲和肽体系模拟过程中稳定性较差，相互作用能相对较低，在其它 甲硫氨酸缺失的实验中也有相同的特点。结合上述结果再对各位点进行突变研究，对X2位 点尝试丝氨酸等各类亲疏水性残基，保留X6位的甲硫氨酸，对X5位点在其他甲硫氨酸缺失 的模拟实验中，取丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸等疏水性氨基酸进行突变研究，根据相互 作用能进行优选。本发明具有第一种结构的亲和肽优选如SEQ ID Nos. 1至12所示的序列。第二种结构为在第一种结构的X5和X6之间设有一个氨基酸残基，所述氨基酸残 基为异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。本发明具有第二种结构的亲和肽优选如SEQ ID Nos. 13至46所示的序列。其中，本发明最优选的是具有如SEQ ID Nos. 1所示序列的亲和肽，其亲和性约是 模板亲和肽的2. 3倍。结构如SEQ ID Nos. 1所示的亲和肽与组织型纤溶酶原激活剂相互 作用如图1所示，卡通模式表示组织型纤溶酶原激活剂1，表面模式表示组织型纤溶酶原激 活剂上与配基相吸附的残基2，范德华模式表示结构如SEQ ID No. 1所示的亲和肽3。由图 1可知，结构如SEQ ID Nos. 1所示的亲和肽与组织型纤溶酶原激活剂紧密结合，具有良好的 亲和性。实施例3 组织型纤溶酶原激活剂及其片段的亲和肽配基连接于固相载体聚乙烯醇水凝胶体系由六条聚乙烯醇相互交联而成，每条链均由40个聚乙烯醇单体构成，且每条链上连接5个结构如SEQ ID Nos. 1所示的亲和肽，进行至少4ns的分子动 力学模拟，利用公式(1)计算固定化后该亲和肽与组织型纤溶酶原激活剂的相互作用能， 与未固定化该亲和肽与组织型纤溶酶原激活剂的相互作用能相当。由此可知，固定化后的 亲和肽具有良好的亲和性，可用于分离纯化或检测组织型纤溶酶原激活剂或其片段。综上，本发明的组织型纤溶酶原激活剂及其片段的亲和肽具有良好的亲和性，可 用于组织型纤溶酶原激活剂的分离纯化或检测。本发明的组织型纤溶酶原激活剂及其片段的亲和肽可通过化学生物学中多肽的 常规方法合成，例如Merrifield固相合成法中常用的Fmoc方法。
权利要求
一种组织型纤溶酶原激活剂及其片段的亲和肽，其特征在于具有如下结构X1X2X3X4X5X6X7其中，X1为丙氨酸或甘氨酸；X2为脯氨酸或苏氨酸；X3、X4均为谷氨酸；X5为异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸；X6为甲硫氨酸；X7为天冬氨酸。
2.根据权利要求1所述的组织型纤溶酶原激活剂及其片段的亲和肽，其特征在于在 所述X5和X6之间设有一个氨基酸残基，所述氨基酸残基为异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。
3.根据权利要求1所述的组织型纤溶酶原激活剂及其片段的亲和肽，其特征在于所 述X1X2X3X4X5X6X7的序列为选自SEQ ID Nos. 1至12中的任一种。
4.根据权利要求2所述的组织型纤溶酶原激活剂及其片段的亲和肽，其特征在于所 述氨基酸残基的序列为选自SEQ ID Nos. 13至46中的任一种。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的亲和肽的用途，其特征在于用于分离纯化或 检测组织型纤溶酶原激活剂或其片段。
6.根据权利要求5所述的亲和肽的用途，其特征在于通过将所述亲和肽连接于固相 支持物上以分离纯化或检测组织型纤溶酶原激活剂或其片段。
全文摘要
本发明公开一种组织型纤溶酶原激活剂及其片段的亲和肽及其用途，属于生物技术领域。该亲和肽的结构为X1X2X3X4X5X6X7，其中，X1为丙氨酸或甘氨酸，X2为脯氨酸或苏氨酸，X3、X4均为谷氨酸，X5为异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸，X6为甲硫氨酸，X7为天冬氨酸。优选在所述X5和X6之间设有一个氨基酸残基，所述氨基酸残基为异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。本发明的亲和肽通过固定于固相支持物上，可用于组织型纤溶酶原激活剂及其片段的分离纯化或检测，具有亲和性强、安全性好、稳定性高等优点，有良好的应用前景。
文档编号C07K1/22GK101948509SQ20101029868
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者吴韬, 张锦, 王 琦 申请人:浙江大学