专利名称：一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法
技术领域：
本发明涉及一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法。
背景技术：
禽类免疫球蛋白IgY具有生物学活性，用途广泛，可用于血清学免疫诊断(夹心法 ELISA检测、免疫扩散、免疫吸附和补体结合等)和免疫治疗(鸡鸭的病毒性疾病、婴儿和 幼畜的轮状病毒感染等)。通常IgY是从禽类蛋中获得，主要是产蛋母鸡用特定抗原免疫 后，约7 10天后抗体从血液转移至卵黄，再从卵黄中分离到IgY，相关此研究的报道较多， 例如专利CN1752105、CN1935841和CN101125886。但是，卵黄中脂肪含量很高(约30% )， 从卵黄中提取IgY需要去除大量的脂类物质，规模化分离较为困难，因此直接从血液中分 离IgY将更为有利。另一方面，我国是禽类(特别是鸡)养殖大国，禽类血液除了少部分食 用外，一般作为废弃物排放，既浪费了宝贵的天然蛋白质资源，又造成了一定的环境污染问 题。因此，综合利用禽类血液，特别是提取高附加值的活性蛋白，具有重要的经济价值和社 会效益。混合模式层析是近年发展起来的新型生物分离技术，其功能配基同时兼有两种 或两种以上的功能基团，可以与目标蛋白产生多种相互作用模式，主要是疏水和静电相互 作用。混合模式吸附剂的配基密度通常比较高，吸附容量大，可以通过静电相吸来强化吸 附或静电排斥来协助解吸，特别适合于大规模的分离纯化，已经在免疫球蛋白的分离纯化 中得到应用，是Protein A亲和层析的潜在替代方法。商业化的混合模式吸附剂有MEP HyperCel，由Pall公司生产。一些新型的混合模式吸附剂也有报道，如以巯基甲基咪唑 或巯基苯并咪唑为配基的介质，制备方法见专利CN101279244、CN101279243和文献(Ind. Eng. Chem. Res47(23) :9566_9572，2008)。本发明有效地结合了辛酸沉淀与混合模式层析两种分离方法，采用辛酸沉淀去除 部分杂蛋白，用混合模式吸附剂直接处理辛酸沉淀的上清液，充分利用混合模式吸附的高 吸附容量、高抗体选择性的特性，开发一种从鸡血中分离IgY免疫球蛋的经济高效方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法。从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法包括如下步骤1)配制0. IM的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，将鸡血与抗凝剂按照体积比为9 1的 比例混合均勻，用离心机以2500 3000rpm转速离心10 20分钟，得到血浆；2)将血浆与浓度为60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4. 2 5. 0)按照体积比为1 4混合均勻，得到稀释血浆，加入辛酸，辛酸加入量为30 60μ 1/ml稀释血浆，4 8°C静 置1 4小时，用离心机以8000 IOOOOrpm转速离心20 30分钟，取上清液，得到免疫 球蛋白IgY粗品溶液；3)调节免疫球蛋白IgY粗品溶液的pH至7. 0 8. 5，用0. 45 μ m滤膜过滤后，上样到填充有混合模式吸附剂的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对 应的洗脱缓冲液，得到免疫球蛋白IgY溶液；4)将免疫球蛋白IgY溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于90%的免疫球蛋白IgY产品。所述的混合模式吸附剂为以巯基甲基咪唑为配基的层析介质，或者以巯基苯并咪 唑为配基的层析介质，或者商业化介质MEP HyperCel ；平衡缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH 值为7. 0 8. 5 ；洗脱缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液，pH值为3. 6 4. 2。本发明针对鸡血资源的综合开发，通过辛酸沉淀与混合模式层析的有机结合，能 很好地从鸡血中分离纯化高纯度的免疫球蛋白IgY。采用辛酸沉淀去除部分杂蛋白，混合模 式吸附剂直接处理辛酸沉淀后的上清液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量和高抗体选 择性，提高分离效率，简化分离步骤，得到一个经济高效的提取免疫球蛋白IgY的方法。本 发明的优点在于1)快速、成本低廉；2)分离步骤少、工艺简单、易于放大；3)过程处理量 大、分离效率高；4)免疫球蛋白IgY的纯度高。
附图是本发明混合模式层析分离鸡血免疫球蛋白IgY的电泳谱图。
具体实施例方式本发明提供一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法。将新鲜抗凝血液离心去 除红细胞，得到血浆；用辛酸法沉淀去除部分杂蛋白，得到上清液；将上清液通过混合模式 层析柱进行分离，得到免疫球蛋白IgY。本发明方法分离得到的免疫球蛋白IgY纯度大于 90%。从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法包括如下步骤1)配制0. IM的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，将鸡血与抗凝剂按照体积比为9 1的 比例混合均勻，用离心机以2500 3000rpm转速离心10 20分钟，得到血浆；2)将血浆与浓度为60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4. 2 5. 0)按照体积比为1 4混合均勻，得到稀释血浆，加入辛酸，辛酸加入量为30 60μ 1/ml稀释血浆，4 8°C静 置1 4小时，用离心机以8000 IOOOOrpm转速离心20 30分钟，取上清液，得到免疫 球蛋白IgY粗品溶液；3)调节免疫球蛋白IgY粗品溶液的pH至7. 0 8. 5，用0. 45 μ m滤膜过滤后，上 样到填充有混合模式吸附剂的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对 应的洗脱缓冲液，得到免疫球蛋白IgY溶液；4)将免疫球蛋白IgY溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于90%的免疫球蛋白IgY产品。所述的混合模式吸附剂为以巯基甲基咪唑为配基的层析介质，或者以巯基苯并咪 唑为配基的层析介质，或者商业化介质MEP HyperCel ；平衡缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH 值为7. 0 8. 5 ；洗脱缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液，pH值为3. 6 4. 2。以下通过实施例对本发明作进一步的描述实施例1
取新鲜鸡血，按照9 1(体积比)的比例加入0. IM的柠檬酸钠溶液抗凝，用离 心机以2500rpm转速离心20分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入5ml 60mM的 乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4. 2)混合均勻，得到稀释血浆约10ml，加入600 μ 1辛酸，搅拌均 勻，4°C静置4小时，待杂蛋白沉淀完全，以SOOOrpm离心30分钟，得到上清液9. 6ml。上清 液用0.45 μ m滤膜过滤，调节pH值为7.0，取Iml作为进样样品。层析柱(内径Icm)中填 充5ml以2-巯基-1-甲基咪唑为配基的层析介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液 (pH7. 0)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH3. 6)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得 到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为95. 2%。实施例2取新鲜鸡血，按照9 1 (体积比)的比例加入0. IM的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心 机以3000rpm转速离心10分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入IOml 60mM的乙 酸-乙酸钠缓冲液(pH4. 2)混合均勻，得到稀释血浆约15ml，加入450 μ 1辛酸，搅拌均勻， 8°C静置1小时，待杂蛋白沉淀完全，以IOOOOrpm离心20分钟，得到上清液14. 2ml。上清 液用0.45 μ m滤膜过滤，调节pH值为7. 5，取Iml作为进样样品。层析柱(内径Icm)中填 充5ml以2-巯基-1-甲基咪唑为配基的混合模式介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓 冲液(pH7. 5)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH3. 8)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干 燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为96. 2%。实施例3取新鲜鸡血，按照9 1(体积比)的比例加入0. IM的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心 机以2700rpm转速离心15分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入15ml 6OmM的 乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4. 8)混合均勻，得到稀释血浆约20ml，加入800 μ 1辛酸，搅拌均 勻，4°C静置1小时，待杂蛋白沉淀完全，以SOOOrpm离心30分钟，得到上清液19. 4ml。上清 液用0.45 μ m滤膜过滤，调节pH值为8.0，取Iml作为进样样品。层析柱(内径Icm)中填 充5ml以2-巯基-1-甲基咪唑为配基的层析介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液 (pH8. 0)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4. 0)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得 到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为97. 6%。实施例4取新鲜鸡血，按照9 1 (体积比)的比例加入0. IM的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心 机以3000rpm转速离心10分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入20ml 60mM的乙 酸_乙酸钠缓冲液(pH5. 0)混合均勻，得到稀释血浆约25ml，加入800 μ 1辛酸，搅拌均勻， 8°C静置4小时，待杂蛋白沉淀完全，以IOOOOrpm离心20分钟，得到上清液24. 3ml。上清 液用0.45 μ m滤膜过滤，调节pH值为8. 5，取Iml作为进样样品。层析柱(内径Icm)中填 充5ml以2-巯基-1-甲基咪唑为配基的混合模式介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓 冲液(pH8. 5)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4. 2)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干 燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为98. 5%。实施例5取新鲜鸡血，按照9 1(体积比)的比例加入0. IM的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心 机以2500rpm转速离心20分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入5ml 60mM的乙 酸_乙酸钠缓冲液(pH4. 2)混合均勻，得到稀释血浆约10ml，加入600 μ 1辛酸，搅拌均勻，4°C静置1小时，待杂蛋白沉淀完全，以IOOOOrpm离心20分钟，得到上清液9. 2ml。上清液用 0.45 μ m滤膜过滤，调节pH值为7.0，取Iml作为进样样品。层析柱(内径Icm)中填充5ml 以2-巯基苯并咪唑为配基的层析介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7. 0)，洗 脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4. 2)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋 白IgY，电泳分析纯度为96. 0%。实施例6取新鲜鸡血，按照9 1(体积比)的比例加入0. IM的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心 机以3000rpm转速离心10分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入20ml 60mM的乙 酸_乙酸钠缓冲液(pH5. 0)混合均勻，得到稀释血浆约25ml，加入750 μ 1辛酸，搅拌均勻， 8°C静置4小时，待杂蛋白沉淀完全，以SOOOrpm离心30分钟，得到上清液24. 2ml。上清液用 0.45 μ m滤膜过滤，调节pH值为8. 5，取Iml作为进样样品。层析柱(内径Icm)中填充5ml 以2-巯基苯并咪唑为配基的层析介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH8. 5)，洗 脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH3. 6)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋 白IgY，电泳分析纯度为95. 4%。实施例7取新鲜鸡血，按照9 1 (体积比)的比例加入0. IM的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心 机以2500rpm转速离心20分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入5ml 60mM的乙 酸_乙酸钠缓冲液(pH4. 2)混合均勻，得到稀释血浆约10ml，加入600 μ 1辛酸，搅拌均勻， 4°C静置1小时，待杂蛋白沉淀完全，以IOOOOrpm离心20分钟，得到上清液9. 2ml。上清液 用0.45 μ m滤膜过滤，调节pH值为7.0，取Iml作为进样样品。层析柱(内径Icm)中填充 5ml MEP HyperCel混合模式介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7. 0)，洗脱液 为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4. 2)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白 IgY，电泳分析纯度为93.7%。实施例8取新鲜鸡血，按照9 1(体积比)的比例加入0. IM的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心 机以3000rpm转速离心10分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入20ml 60mM的乙 酸_乙酸钠缓冲液(pH5. 0)混合均勻，得到稀释血浆约25ml，加入750 μ 1辛酸，搅拌均勻， 8°C静置4小时，待杂蛋白沉淀完全，以SOOOrpm离心30分钟，得到上清液24. Iml0上清液 用0.45 μ m滤膜过滤，调节pH值为8. 5，取Iml作为进样样品。层析柱(内径Icm)中填充 5ml MEP HyperCel混合模式介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH8. 5)，洗脱液 为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH3. 6)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白 IgY，电泳分析纯度为91.2%。
权利要求
一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法，其特征在于包括如下步骤1)配制0.1M的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，将鸡血与抗凝剂按照体积比为9∶1的比例混合均匀，用离心机以2500～3000rpm转速离心10～20分钟，得到血浆；2)将血浆与pH为4.5～5.0，浓度为60mM的乙酸 乙酸钠缓冲液按照体积比为1～4混合均匀，得到稀释血浆，加入辛酸，辛酸加入量为30～60μl/ml稀释血浆，4～8℃静置1～4小时，用离心机以8000～10000rpm转速离心20～30分钟，取上清液，得到免疫球蛋白IgY粗品溶液；3)调节免疫球蛋白IgY粗品溶液的pH至7.0～8.5，用0.45μm滤膜过滤后，上样到填充有混合模式吸附剂的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱缓冲液，得到免疫球蛋白IgY溶液；4)将免疫球蛋白IgY溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于90％的免疫球蛋白IgY产品。
2.根据权利要求1所述的一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法，其特征在于所述 的混合模式吸附剂为以巯基甲基咪唑为配基的层析介质、以巯基苯并咪唑为配基的层析介 质或者商业化介质MEP HyperCel0
3.根据权利要求1所述的一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法，其特征在于所述 的平衡缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7. 0 8. 5。
4.根据权利要求1所述的一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法，其特征在于所述 的洗脱缓冲液为乙酸_乙酸钠缓冲液，pH值为3. 6 4. 2。
全文摘要
本发明公开了一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法。具体步骤如下1)血浆预处理，取新鲜鸡血，离心，除去红细胞，得到血浆。2)辛酸沉淀，向血浆中加入辛酸达到一定浓度，沉淀去除杂蛋白，离心分离，取上清液。3)柱层析，用填充有混合模式吸附剂的层析柱分离上清液，收集洗脱峰。4)脱盐和干燥，将收集液脱盐，冷冻干燥，得到高纯度的免疫球蛋白IgY。本发明的特色在于开发了一条新的分离工艺，可以从鸡血中分离得到高纯度的免疫球蛋白IgY。方法的关键在于从辛酸沉淀的上清液中直接提取免疫球蛋白IgY，具有操作步骤简单、分离效率高、成本低廉的特点。
文档编号C07K1/36GK101948535SQ20101029542
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月27日 优先权日2010年9月27日
发明者姚善泾, 林东强, 童红飞 申请人:浙江大学