专利名称：富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物和制备方法
技术领域：
本发明涉及一种富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物和制备方法，这些磷酸肽大多 携带SerP-SerP-SerP-Glu-Glu序列片段，属于食品生物技术领域。
背景技术：
酪蛋白约占哺乳动物乳品中蛋白质总量的80%，是由asl-酪蛋白、aS2-酪蛋白、 β-酪蛋白、κ-酪蛋白等四种磷酸化蛋白质聚集而成的胶束大分子。当新生儿喂食母乳 后，酪蛋白胶束作为磷酸钙胶体的运输者，为孩子的骨骼形成和牙齿生长提供必要的矿物 质元素。母乳在体内消化过程中，酪蛋白将被水解为各种各样的多肽，但它结合金属的功能 将由水解物-酪蛋白磷酸肽(CPPs)保留甚至加强。目前，大量实验和临床数据显示，CPPs可 对人体营养系统提供多种生物学功能，如抗氧化、抗龋齿、免疫调节和补充矿物质元素(如 钙、铁、锌)。酪蛋白磷酸肽在蛋白序列中是无活性的，只有在食品加工或体内消化后从序列中 释放时才能发挥其各种生物学功能。迄今为止，为了制备CPPs，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、 血浆酶、Lactobacillus蛋白酶和胰酶等对酪蛋白、酪蛋白酸钠或脱脂牛乳的水解作用已被 广泛研究。然而，这些研究大多限于水解产物中各种磷酸肽的制备，而未区分多磷酸化多肽 和单磷酸化多肽。其中，如果CPPs含有SerP-SerP-SerP-Glu-Glu序列，带有多个磷酸化基 团，其携带矿物质元素能力较强。此外，多磷酸化多肽的制备还可为研究磷酸化蛋白质组学提供很好的样品。在蛋 白质组学中，微量的磷酸化蛋白序列鉴定与结构分析仍存在巨大挑战。蛋白质的可逆磷酸 化是最常见且最重要的翻译后修饰之一，几乎参与了生命活动的所有过程，包括细胞的增 殖、发育和分化、肌肉收缩、新陈代谢等。此外，许多糖尿病、老年痴呆等疑难疾病的发生， 也与蛋白质的可逆磷酸化密切相关。利用规模制备好的多磷酸多肽，可较好地解析磷酸化 (尤其是多个磷酸化)对蛋白质质谱行为的影响规律。目前，研究者报道了酪蛋白磷酸肽的分离纯化，但有些未能对其序列结构进行解 析，有些是制备各种类型磷酸肽。为了制备多磷酸化的CPPs，需整合多种分离方式，并对最 终产品进行测定。
发明内容
本发明的目的是提供一种富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物和制备方法。根据多 磷酸化多肽的结构特点。多磷酸化CPPs分子量大多超过lkDa，且携带多个负电荷。由于其 分子量较大，一般出现在水解初期，因此酪蛋白水解需控制在低水解度范围内。再采用5kDa 超滤膜将产物多肽从反应体系中分离出来，截留酶和未反应的底物，并用IkDa去除小分子 量多肽，再利用钙_乙醇沉淀法获得磷酸肽，最后采用强阳离子交换层析进行分级，经过质 谱鉴定与Sequest数据库检索确定磷酸肽序列。基于该工艺，可获得带有多个磷酸化基团 的多肽，具有很好的抗龋齿、免疫调节和补充矿物质元素等生物学功能，并为磷酸蛋白质组
4学提供质谱或机理分析的样品。本发明目的是提供一种富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物是以酪蛋白为原料，采 用蛋白水解酶进行适度水解，水解度需控制10%以内，沸水浴加热灭酶，采用5kDa超滤膜 从反应体系中分离出各种产物多肽，再将该产物用IkDa的超滤膜进行截留，所得截留液采 用钙_乙醇选择性沉淀磷酸肽，再将其用去离子水或挥发性盐溶液溶解，上样到强阳离子 交换柱上，分离获得带多个磷酸化的多肽，采用喷雾干燥或冷冻干燥获得产品。所述的多肽均含有多个磷酸化基团，共检出9个多磷酸化多肽(占水解产物中所 有磷酸肽的30% )，每个多肽所带磷酸化基团至少4个。本发明的富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物的制备方法包括的步骤1)酪蛋白的溶解将酪蛋白溶解在指定pH(7.0_9.0)的碱性溶液中，配制成 10-30g/L的蛋白溶液，滴加碱或者酸调节到指定pH值。2)酶解将蛋白溶液置于持续搅拌且恒温30-40°C的反应器中，按照酶与底物的 质量比为1 (10-1000)加入蛋白水解酶，开始反应并计时。控制反应体系的水解度小于 10%，停止反应，沸水浴灭酶。3)5kDa超滤膜分离将步骤2)获得的酶解液置于5kDa膜分离装置中，通过膜过 滤截留分子量较大的底物和蛋白酶，得到低于5kDa分子量的水解产物。4) IkDa超滤膜分离将步骤3)获得的水解产物置于IkDa膜分离装置中进行过 滤，获得分子量l_5kDa的截留液。5)钙-乙醇选择性沉淀磷酸肽在步骤4)获得的分子量大于IkDa的截留液中， 加入0. 8-1. 2%的CaCl2,静置45 60min,使Ca2+与CPPs产品中的磷酸基团充分结合，再 加入乙醇，使乙醇浓度为40-80%，形成沉淀，将其离心后取沉淀。6)离子交换层析制备多磷酸化的多肽将步骤5)获得的沉淀物，用去离子水或挥 发性盐溶液溶解，在强阳离子交换层析系统中上样，收集各个洗脱时间的组分。洗脱条件 流动相A为IOmM柠檬酸缓冲液，pH 3. 0 ；流动相B为IOmM柠檬酸缓冲液，lmol/LNaCl, pH 3. 0 ；梯度条件为 100% A(0 7. 5mL)，100% A 45% A(7. 5 37. 5mL), 100% B(37. 5 48mL)；上样流速为lmL/min ；洗脱流速为lmL/min。其中，最先洗脱的组分即为带多磷酸化 基团的多肽。7)干燥将步骤6)获得的多磷酸化多肽进行收集，将其喷雾干燥或冷冻干燥，获
得广品。8)磷酸肽的序列鉴定将步骤6)_7)获得的样品溶于0. 三氟乙酸溶液中，采用 液质联用技术和Sequest数据库检索对活性肽的序列进行鉴定。所述的蛋白水解酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶等。所述步骤3)和4)的超滤膜包括中空纤维膜、平板膜、卷式膜等。本发明提供的带多个磷酸化基团的多肽制备方法，可选择性地获得具有更高活性 的磷酸肽，在食品生物技术领域中具有良好的应用前景，并为磷酸蛋白质组学的研究提供 很好的研究样品。
图1多磷酸化的酪源多肽制备的工艺流程图。
图2强阳离子交换层析分级制备多磷酸化多肽的色谱图。
具体实施例方式实施例1配置lL20g/L的牛乳酪蛋白(Sigma公司)溶液，调节pH值为8. 0，将其置于持续 搅拌且恒温37°C的反应器中。按照酶与底物质量比为1 100加入0.2g胰酶(Sigma公 司)，并开始计时，同时滴加NaOH维持体系pH值为8. 0。反应IOmin后停止反应，立即沸水 浴灭酶lOmin，此时水解度为6%。利用5kDa的中空纤维膜对酶解液进行过滤，获得滤出液 (产物)，再利用IkDa的中空纤维膜进行过滤，获得分子量为lk_5kDa的截留液。在截留液 中加入CaCl2,使其浓度为1. 0%，静置60min，再加入乙醇，使乙醇浓度为60%，形成沉淀， 将其离心(IOOOOrpm)后取沉淀。将沉淀产物用去离子水溶解，取30mL上样到强阳离子交换层析柱SP650M(T0S0H 公司)，进行梯度洗脱，洗脱条件流动相A为IOmM柠檬酸缓冲液，pH 3. O ；流动相B为 IOmM柠檬酸缓冲液，lmol/LNaCl，pH 3. O ；梯度条件为 100% A(O 7. 5mL)，100% A 45% A(7. 5 37. 5mL)，100% B(37. 5 48mL)；上样流速为 lmL/min ；洗脱流速为 lmL/min。经 过洗脱，获得5个组分(图2)。再对所获得的5个组分进行序列鉴定，采用液质联用和Sequest数据库检索相结 合的方法，液质联用操作条件LCQ Advantage MAX电喷雾离子阱质谱；214TP54反相色谱 柱；进样体积为10 μ L ；流速为1. OmL/min ；检测时间为60min ；检测方式为正离子检测。多 肽的鉴定和搜索是由Bioworks V3. 1 (Thermo Finnigan公司)中的TurboSequest软件完 成的。结果表明最先洗脱的组分1以带多个磷酸化基团的多肽为主(共有9个，占水解产 物中所有磷酸肽的30%，氨基酸序列和所带磷酸化基团见表1)，所带磷酸化基团均不少于 3个。再将该组分进行冷冻干燥，制成产品。表1洗脱组分1的磷酸肽组成与氨基酸序列
权利要求
一种富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物，其特征在于它是以酪蛋白为原料，采用蛋白水解酶进行适度水解，水解度需控制10％以内，沸水浴加热灭酶，采用5kDa超滤膜从反应体系中分离出各种产物多肽，再将该产物用1kDa的超滤膜进行截留，所得截留液采用钙 乙醇选择性沉淀磷酸肽，再将其用去离子水或挥发性盐溶液溶解，上样到强阳离子交换柱上，分离获得带多个磷酸化的多肽，采用喷雾干燥或冷冻干燥获得产品。
2.根据权利要求1所述的酪蛋白水解物，其特征在于所述的多肽均含有多个磷酸化基 团，共检出9个多磷酸化多肽，占水解产物中所有磷酸肽的30%，每个多肽所带磷酸化基团 至少4个。
3.根据权利要求1所述的酪蛋白水解物，其特征在于所述的多肽的组成与氨基酸序列α S160-98(5P)Met-Glu-Ala-Glu-SerP-Ile-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-IIe-Val-Pro-A sn-SerP-Val-Glu-Gln-Lys-His-IIe-Gln-Lys-Glu-Asp-Val-Pro-Ser-Glu-Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln-Leu α S21-19 (4P) Lys-Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Il e-SerP-Gln-Glu-Thrα S2l-20 (4P) Lys-Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Il e-SerP-Gln-Glu-Thr-Tyrα S2l-24(4P) Lys-Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Il e-SerP-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys-G In-Glu-Lysβ 1-24(4P) Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP -Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thrβ 1-25 (4P) Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP -Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Argβ 1-28(4P) Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP -Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg-Ile-Asn-Lysβ 1-29 (4P) Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP -Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg-Ile-Asn-Lys-Lysβ 1-32 (4P) Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP -Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg-Ile-Asn-Lys-Lys-Ile-Glu-Lys。
4.一种富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物的制备方法，其特征在于包括的步骤1)酪蛋白的溶解将酪蛋白溶解在指定PH的碱性溶液中，配制成10-30g/L的蛋白溶 液，滴加碱或者酸调节到指定PH值；2)酶解将蛋白溶液置于持续搅拌且恒温30-40°C的反应器中，按照酶与底物的质量比为1 (10-1000)加入蛋白水解酶，开始反应并计时；控制反应体系的水解度小于10%， 停止反应，沸水浴灭酶；3)5kDa超滤膜分离将步骤2)获得的酶解液置于5kDa膜分离装置中，通过膜过滤截 留分子量较大的底物和蛋白酶，得到低于5kDa分子量的水解产物；4)IkDa超滤膜分离将步骤3)获得的水解产物置于IkDa膜分离装置中进行过滤，获 得分子量l_5kDa的截留液；5)钙-乙醇选择性沉淀磷酸肽在步骤4)获得的分子量大于IkDa的截留液中，加入 0. 8-1. 2%的CaCl2，静置45 60min，使Ca2+与CPPs产品中的磷酸基团充分结合，再加入 乙醇，使乙醇浓度为40-80%，形成沉淀，将其离心后取沉淀；6)离子交换层析制备多磷酸化的多肽将步骤5)获得的沉淀物，用去离子水或挥发性 盐溶液溶解，在强阳离子交换层析系统中上样，收集各个洗脱时间的组分；洗脱条件流动 相A为IOmM柠檬酸缓冲液，pH 3. 0 ；流动相B为IOmM柠檬酸缓冲液，lmol/L NaCl，pH 3. 0 ； 梯度条件为 100% A(0 7. 5mL)，100% A 45% A(7. 5 37. 5mL), 100% B (37. 5 48mL)； 上样流速为lmL/min ；洗脱流速为lmL/min。其中，最先洗脱的组分即为带多磷酸化基团的 多肽；7)干燥将步骤6)获得的多磷酸化多肽进行收集，将其喷雾干燥或冷冻干燥，获得产Pm ；8)磷酸肽的序列鉴定将步骤6)-7)获得的样品溶于0.三氟乙酸溶液中，采用液质 联用技术和Sequest数据库检索对活性肽的序列进行鉴定。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰 酶、碱性蛋白酶或风味蛋白酶。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的超滤膜包括中空纤维膜、平板 膜或卷式膜。
全文摘要
本发明涉及富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物和制备方法。它是以酪蛋白为原料，采用蛋白水解酶进行适度水解，水解度控制在10％以内，沸水浴加热灭酶，采用5kDa超滤膜从反应体系中分离出各种产物多肽，再将该产物用1kDa的超滤膜进行截留，所得截留液采用钙-乙醇选择性沉淀磷酸肽，再将其用去离子水或挥发性盐溶液溶解，上样到强阳离子交换柱上，分离获得带多个磷酸化的多肽。采用喷雾干燥或冷冻干燥获得产品。最后采用液质联用对所得磷酸肽进行序列鉴定。本发明可选择性地获得具有更高活性的磷酸肽，在食品生物技术领域中具有良好的应用前景，并为磷酸蛋白质组学的研究提供很好的研究样品。
文档编号C07K1/36GK101948524SQ20101026951
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月2日 优先权日2010年9月2日
发明者何志敏, 苏荣欣, 齐崴 申请人:天津大学