专利名称：一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，制备该重组蛋白 可应用于预防家禽减蛋综合症的基因工程疫苗，属于农业生物技术领域。
背景技术：
减蛋综合症(Egg Drop Syndrome, EDS)是由减蛋综合症病毒(EDSV)引起的一种 以产蛋鸡产薄壳或无壳蛋，产蛋率严重下降为主要特症的传染病(殷震，1982)。1976年被 Van Eck首次报道，现已成为世界范围内引起产蛋损失的主要原因之一；并于1977年根据 其病毒粒子形态、化学组成、及复制特点等归为血凝性禽腺病毒。该病毒被命名为III群禽类 腺病毒，是此群中的唯一成员，并且确定了其完整的EDSV核苷酸序列(McFerran等，1997)。 我国于1986年-1990年证实许多鸡场EDS-76血清阳性，1992年由李刚首次分离到病毒，之 后，从发病鸡群和其他禽类中分离到多株病毒(Prya等，2001)。目前该病已经成为世界范 围内引起产蛋损失的重要疾病之一，给养禽业造成了巨大的经济损失。本病可使产蛋率下 降10 % -30 %，最高达41 %，蛋的破损率达38 % -41 %，不同年龄的鸡均可感染，6_8月龄母 鸡处于发病高峰期，既可水平传播，又可垂直传播，给养鸡业造成严重的经济损失。目前，本病尚无有效的治疗方法，只能从加强管理、免疫、淘汰病鸡等方面进行防 治。在发病时，如有必要也可给抗菌药物，以防混合感染或继发感染。预防本病的关键是注 射疫苗。目前对于鸡减蛋综合症的防治措施主要是使用减蛋综合症的灭活疫苗。然而，用 该病毒进行接种，作为灭活疫苗或减毒株，有很多的缺点。一方面，一些减毒活疫苗仍保留 有一定的毒力，并且对于强毒株展示出的抗原覆盖效果是有区别的。另一方面，灭活疫苗灭 活剂对病毒抗原有影响，而且对不同的抗原成分影响不同。腺病毒是(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70 90nm的颗粒，其衣壳 (capsid)呈规则的20面体结构，直径约80-1 lOnm。衣壳含有240个六联体(hexon)、12个 五联体(penton)及12根纤毛(fiber)，12根纤毛以五联体蛋白为基底由衣壳表面伸出，纤 毛顶端形成头节区(knob)，其中基底由纤维蛋白的N-末端组成，而头节区则由纤维蛋白的 C-末端组成。纤毛的头节区可与动物细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起 着非常重要的作用。因此，纤维蛋白的C-末端区域为其抗体封闭后，病毒就丧失了其感染 细胞的能力。本发明从一株减蛋综合症病毒的基因组中克隆了其纤维蛋白C-末端编码基因， 并建立了获得该基因编码重组蛋白的方法，为减蛋综合症基因工程疫苗的研制提供了一种 新的途径。
发明内容
本发明的目的在于克服现有灭活疫苗生产技术的缺点，旨在提供一种利用DNA重 组技术制备EDSV关键抗原的方法。利用该方法可以快速、简便、制备大量重组蛋白，可应用 于家禽减蛋综合症的预防。
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为了实现上述发明目的，本发明的重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法 为首先利用PCR技术从EDSV基因组中克隆纤维蛋白C-末端的编码基因并进行序列分析; 然后将该基因克隆到表达载体pET-15b，转化大肠杆菌(E. coliBL21(DE3))后构建工程菌， 异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导工程菌表达纤维蛋白C-末端；最后裂解工程菌细 胞，离心分离其中的包含体，尿素溶解后，再用镍离子敖和树脂亲和纯化重组蛋白，稀释复 性，利用Western blotting技术检测重组蛋白的免疫原性。步骤一，纤维蛋白C-末端基因克隆与序列分析，按照如下步骤操作根据分离病毒的基因组序列设计一对引物，引物 1 :5，AAACATATGTCGAGCTCGGTACCTTTGACTTTGGC 3，，引物 2 5，AAACTCGAGTTATAAGGGAATGG 3，。采用酚抽提法从感染EDSV的鸡血细胞中提取总DNA，以该DNA为模板，按照94°C 变性45s，56°C退火45s，72°C延伸lmin，共进行30循环进行PCR扩增，将PCR产物直接克隆 到PMD-18T载体上，构建pMD-18T-EDS，转化大肠杆菌E. coli DH5 α，提取质粒，利用双脱氧 链终止法进行序列测定。从减蛋综合症病毒基因组中克隆纤维蛋白C-末端的编码基因具 有序列1所示的核苷酸序列。序列 1ATGTCGAGCT CGGTACCTTT GACTTTGGCT TATGATTCCA CGGATTTTCAAACGGCCTAG CCCTAAAGGT ATCTCCGACG CAGACCCCTC TCACCAGAATGGAAATAACT TGTTTGATTC TGGTTATGAG ATTTTTGCTT CATGTCCGCAGCAAAGGTTG CAGGGTATGT GTATTTAACA TCGGTTGGTG GGCTTGTACACAGATTAAAG CTACTGCGGG GTATTGGTTT ACGGGGGAAA ACAGCGTGCAAGGTTTGGAT TGGTGTTGTG TCCTTTTAGT GCTCGCGACC CCACTGCTAATGGCCAGCGC CAGTAGTGTG GAGTGGTGAT AGCAATACTC CCCTATATTTGCCATTAGTT ATACCAATAA CCGTGTAAAT CATGCAGTTA CCGGTAACTTGAAACCGAAT TGCCGGGTTA CACTCGTCAT TCTTTCTGCC CTACCGGGACAATTTTACAG GGGGTAATTT GTATGTGTGT CCCTGCACTG TAAATACAGGCTAAATGCCA TTTATATGGT GTTTGTGATT ACTCAATCAG CTTTGGGAACGCTTCTAACA CCCCTCCCAA CACATTCTTT TTAACTCCCC CCATTCCCTT步骤二，表达载体与工程菌的构建，按照如下步骤操作将pMD-18T-EDS与pET_15b用Nde I/Xho I双酶切，酶切产物进行1 %琼脂糖 凝胶电泳，分别回收700bp目的片段和5. 7kb的pET-15b，然后16°C连接过夜；将连接产 物转化到E. coliDH5 α感受态细胞，挑取单菌落接种到含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB 培养基，37°C振荡培养12h，提取质粒后用Nde I/Xho I双酶切进行鉴定，获得表达质粒 pET-15b-EDS ；将重组质粒转化到E. coli BL21 (DE3)，用0. 5mmol/L的IPTG诱导表达，然后 SDS-PAGE电泳分析。步骤三，重组EDSV纤维蛋白C-末端的纯化，按照如下步骤操作挑取工程菌单菌落接种于LB液体培养基(含氨苄青霉素浓度0. lg/L)，37°C恒温 振荡过夜培养；将过夜培养物按体积比为1 20的比例倒入LB液体培养基(含氨苄青霉 素浓度0. lg/L)，37°C恒温振荡培养3h。然后加入IPTG使其终浓度为5mmol/L，37°C恒温振
GGTGACAGAA AATTTCTATG GAACAAAGCA TGGGACCATT GGAAAGTATC CCTGTCAGGC TGCGGCCAAT TTACAAGGAG CACCGGAATG GGCCACCACA TAATTTCTTT TACATAA荡培养4h。将培养物低温冷冻离心，8000rpm，20min ；弃上清，加入结合缓冲溶液 100ml (20mmol/LTris. HCl，pH8. 0,0. 5mol/L NaCl,5mmol/L 咪唑)悬浮菌体，进行超声波破 碎，然后4°C，8000rpm, 30min,保留沉淀(包含体)。将包含体中加入2% (ff/V)Triton X_100，用搅拌器搅拌，超声破碎，搅拌器继续搅 拌，然后低温冷冻离心 8000rpm，30min。再分别用 2%，2. 2%，2. 4%，2. 5% (W/V)的 Triton X-100按上述方法洗涤，共洗涤4次，向最后洗涤的包含体沉淀中加入浓度为8mol/L的尿素 (结合缓冲溶液配制)，用磁力搅拌器搅拌40min，冷冻离心SOOOrpm，30min,保留上清。将尿素溶解包含体的上清上8mol/L尿素(结合缓冲溶液配制)平衡的Ni敖合树 脂柱(2 X IOcm)，先用10倍柱床体积的8mol/L尿素(结合缓冲溶液配制)冲洗层析柱，再 用 2 倍柱床体积的洗涤缓冲溶液(20mmol/L Tris. HCl，ρΗ8· 0,0. 5mol/L NaCl，1 OOmmo 1/L 咪唑)配制的8mol/L尿素洗涤层析柱，最后用30mL洗脱缓冲溶液(20mmol/L Tris. HCl, pH8.0,0. 5mol/L NaCl，300mmol/L咪唑)配制的8mol/L尿素洗脱目的蛋白，收集流出液。 流出液于4°C对蒸馏水透析过夜后，冷冻干燥。通过对重组EDSV纤维蛋白C-末端抗原性分析实验证实，利用本发明方法制备的 重组蛋白与感染了减蛋综合症病毒鸡的血清具有明显的免疫反应。从减蛋综合症病毒基因 组中克隆纤维蛋白C-末端的基因编码蛋白具有序列2所示的氨基酸序列。序列 2MSSSVPLTLA YDSTDFQVTE NGLALKVSPT QTPLTRIISM GNNLFDSGYE IFASCPQNKAAKVAGYVYLT SVGGLVHGTI QIKATAGYffF TGENSVQESI RFGLVLCPFS ARDPTANLSGWPAPVVffSGD SNTPLYFAAN AISYTNNRVN HAVTGNFYKE ETELPGYTRH SFCPTGTTGMNFTGGNLYVC PCTVNTGATT LNAIYMVFVI TQSALGTNFF ASNTPPNTFF LTPPIPFT本制备方法可以快速、简便、制备大量重组蛋白，对于开发预防家禽减蛋综合症的 基因工程疫苗具有极大的应用价值。
图1为纤维蛋白C-末端的编码基因的PCR扩增图。图2为质粒pMD-18T-EDS的酶切鉴定图。图3为表达质粒pET-15b_EDS的酶切鉴定图。图4为工程菌表达纤维蛋白C-末端的SDS-PAGE分析图。图5为重组纤维蛋白C-末端的SDS-PAGE分析图。图6为重组纤维蛋白C-末端的Western blotting分析图。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明方法做进一步的阐述。实施例1 1、纤维蛋白C-末端基因克隆与序列分析设计合成一对引物，引物1 5，AAACATATGTCGAGCTCGGTACCTTTG ACTTTGGC3，；引物 2 :5’ AAACTCGAGTTATGTAAAGGGAATGG 3’。
抽取感染EDSV的鸡血10ml，IOOOrpm离心5min，分离血细胞，用1. OmLTSE缓冲液 (20mmol/LTris. Cl，pH8. 0, 50mmol/LNaCl, 5mmol/L EDTA)悬浮血细胞，加入 5 μ L 蛋白酶K， 50°C消化30min-3h ；再加入330 μ L醋酸钾(5mol/L)溶液，混勻，10，OOOrpm离心lOmin，取 上清；向上清中加入等体积的饱和酚，充分混勻；10，OOOrpm离心lOmin，取上清；向上清中 加入10 μ L RNase,37°C, IOmin ；加入等体积异丙醇，混勻；10，OOOrpm离心5min，取沉淀；沉 淀用70%乙醇漂洗，室温放置30min，加入20 μ L蒸馏水，溶解，即得到总DNA。以该DNA为模板，按照94°C变性45s，56°C退火45s，72°C延伸lmin，共进行30循 环进行PCR扩增，如图1所示，其中1，2是PCR扩增产物，3是标准DNA ；将PCR产物直接克 隆到pMD-18T载体(TaKaRa公司)上，构建pMD_18T_EDS，如图2所示，其中，1是λ DNA/ EcoRI, Hindlll，2，3是pMD-18T_EDS经Nde I和Xho I酶切图；利用双脱氧链终止法进行 序列测定，结果显示，从减蛋综合症病毒基因组中克隆纤维蛋白C-末端的编码基因具有序 列1所示的核苷酸序列。序列 1ATGTCGAGCTCGGTACCTTTGACTTTGGCTTATGATTCCACGGATTTTCAGGTGACAGAA
AACGGCCTAGCCCTAAAGGTATCTCCGACGCAGACCCCTCTCACCAGAATAATTTCTATG
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CTAAATGCCATTTATATGGTGTTTGTGATTACTCAATCAGCTTTGGGAACTAATTTCTTT
GCTTCTAACACCCCTCCCAACACATTCTTTTTAACTCCCCCCATTCCCTTTACATAA2、表达载体与工程菌的构建将pMD-18T-EDS与pET_15b用Nde I/Xho I双酶切，酶切产物进行1 %琼脂糖凝 胶电泳，分别回收700bp目的片段和5. 7kb的pET-15b，然后16°C连接过夜；将连接产物 转化到E. coliDH5 α感受态细胞，挑取单菌落接种到2ml含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB 培养基，37°C振荡培养12h，提取质粒后用Nde I/Xho I双酶切进行鉴定，获得表达质粒 pET-15b-EDS，如图 3 所示，其中，1 是 λ DNA/EcoR I，Hindlll，2，3 是 pET-15b_EDS/NdeI， XhoI。将重组质粒转化到Ε. coli BL21(DE3)，挑取单菌落，接种到200mL含100μ g/mL氨苄 青霉素的LB培养基，37°C振荡培养12h，后转接到4L相同培养基中，37°C振荡培养3h后，加 入IPTG至终浓度为0. 5mM，继续培养4h，然后SDS-PAGE电泳分析，结果如图4所示，其中，1 是标准蛋白，2是E. coliBL21 (DE3)全蛋白，3，4是IPTG诱导工程菌全蛋白。3、重组EDSV纤维蛋白C-末端的纯化挑取工程菌单菌落于200ml LB液体培养基(含氨苄青霉素浓度0. lg/L)，37°Cfl 温振荡过夜培养；将过夜培养物按体积比为1 20的比例倒入总计4L的LB液体培养基 (氨苄青霉素浓度0. lg/L)，37°C恒温振荡培养3h ；然后加入IPTG使其终浓度为5mM，37°C恒温振荡培养4h。将培养物用大型低温冷冻离心机离心，8000rpm，20min;弃上清，加入结合缓冲液 100ml (20mmol/L Tris. HCl, pH8. 0,0. 5mol/L NaCl，5mmol/L 咪唑)悬浮菌体，然后进行 750W超声波破碎(工作时间10s，间隔时间20s，破碎120次)。然后4°C，8000rpm，30min，
保留沉淀(包含体)。将5g包含体中加入120ml的2% (ff/V)Triton X-100，用搅拌器搅拌30min，超 声破碎40次，搅拌器继续搅拌30min，然后低温冷冻离心8000rpm，30min。再分别用2%， 2.2%,2.4%,2.5% (W/V)的Triton X_100各120ml按上述方法洗涤，共洗涤4次，向最后 洗涤的包含体沉淀中加入IOOml浓度为8mol/L的尿素(结合缓冲溶液配制)，用磁力搅拌 器搅拌40min，冷冻离心8000rpm，30min，保留上清。将尿素溶解包含体的上清上8mol/L尿素(结合缓冲溶液配制)平衡的Ni敖合树 脂柱(2 X IOcm)，先用10倍柱床体积的8mol/L尿素(结合缓冲溶液配制)冲洗层析柱，再 用 2 倍柱床体积的洗涤缓冲溶液(20mmol/L Tris. HCl，ρΗ8· 0,0. 5mol/L NaCl，100mmol/L 咪唑)配制的8mol/L尿素洗涤层析柱，最后用30mL洗脱缓冲溶液(20mmol/L Tris. HCl, pH8. 0,0. 5mol/LNaCl,300mmol/L咪唑)配制的8mol/L尿素洗脱目的蛋白，收集流出液。纯 化效果如图5所示，其中1，2，3是纯化的重组EDSV纤维蛋白C-末端，4是标准蛋白。流出 液于4°C对IL蒸馏水透析过夜后，冷冻干燥。4、重组EDSV纤维蛋白C-末端抗原性分析将0. 1 μ g纯化的重组的EDSV纤维蛋白C-末端经SDS-PAGE分离后，电转移至 PVDF(聚偏氟乙烯)膜上，用5%的脱脂奶粉封闭2h，PBS振洗3次，分别加入一抗(鸡抗血 清)1 250作用2h，振洗3次，再加入二抗1 1000 (HRP标记的兔抗鸡IgG)作用2h，振 洗后于显色液中显色(20mmol/L Tris. HCl,pH8. 0,50mmol/L NaCl，0. 03% NiCl2,0. 01 %二 氨基联苯胺，0.3% H2O2)。结果如图6所示，重组纤维蛋白C-末端具有良好的抗原性。从 减蛋综合症病毒基因组中克隆纤维蛋白C-末端的基因编码蛋白具有序列2所示的氨基酸 序列。序列 2MSSSVPLTLA YDSTDFQVTE NGLALKVSPT QTPLTRIISM GNNLFDSGYE IFASCPQNKAAKVAGYVYLT SVGGLVHGTI QIKATAGYffF TGENSVQESI RFGLVLCPFS ARDPTANLSGWPAPVVffSGD SNTPLYFAAN AISYTNNRVN HAVTGNFYKE ETELPGYTRH SFCPTGTTGMNFTGGNLYVC PCTVNTGATT LNAIYMVFVI TQSALGTNFF ASNTPPNTFF LTPPIPFT
权利要求
一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在于首先利用PCR技术从减蛋综合症病毒基因组中克隆纤维蛋白C 末端的编码基因并进行序列分析；然后将该基因克隆到表达载体pET 15b，转化大肠杆菌后构建工程菌，异丙基 β D 硫代半乳糖苷诱导工程菌表达纤维蛋白C 末端；最后裂解工程菌细胞，离心分离其中的包含体，尿素溶解后，再用镍离子敖和树脂亲和纯化重组蛋白，稀释复性，利用Western blotting技术检测重组蛋白的免疫原性。
2.根据权利要求1所述的一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征 在于所述的纤维蛋白C-末端基因克隆与序列分析按照如下步骤操作根据分离病毒的基 因组序列设计一对引物引物 1 :5，AAACATATGTCGAGCTCGGTACCTTTGACTTTGGC 3，，引物 2 5’ AAACTCGAGTTATAAGGGAATGG 3’，采用酚抽提法从感染减蛋综合症病毒的鸡血细胞中提取 总DNA，以该DNA为模板，按照94°C变性45s，56°C退火45s，72°C延伸lmin，共进行30循环 进行PCR扩增，将PCR产物直接克隆到pMD-18T载体上，构建pMD_18T_EDS，转化大肠杆菌 E. coli DH5 α，提取质粒，利用双脱氧链终止法进行序列测定。
3.根据权利要求1所述的一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特 征在于所述的表达载体与工程菌的构建按照如下步骤操作将PMD-18T-EDS与pET_15b用 Ndel/Xho I双酶切，酶切产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，分别回收700bp目的片段和5. 7kb 的pET-15b，然后16°C连接过夜；将连接产物转化到E. coliDH5 α感受态细胞，挑取单菌落 接种到含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基，37°C振荡培养12h，提取质粒后用Nde I/Xho I双酶切进行鉴定，获得表达质粒pET-15b-EDS ；将重组质粒转化到E. coli BL21 (DE3)，用 0. 5mmol/L的异丙基-β _D_硫代半乳糖苷诱导表达，然后SDS-PAGE电泳分析。
4.根据权利要求1所述的一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特 征在于重组减蛋综合症病毒纤维蛋白C-末端的纯化按照如下步骤操作挑取工程菌单菌 落接种于LB液体培养基，37°C恒温振荡过夜培养；将过夜培养物按体积比为1 20的比 例倒入LB液体培养基，37°C恒温振荡培养3h ；然后加入异丙基_ β -D-硫代半乳糖苷使其 终浓度为5mmol/L，37°C恒温振荡培养4h ；将培养物低温冷冻离心，8000rpm，20min ；弃上 清，加入结合缓冲溶液悬浮菌体，进行超声波破碎；然后4°C，8000rpm，30min，保留沉淀即 包含体；将包含体中加入W/V为2%的Triton X-100，用搅拌器搅拌，超声破碎，搅拌器继 续搅拌，低温冷冻离心8000rpm, 30min ；再分别用W/V为2%，2. 2%，2. 4%，2. 5%的Triton X-100按上述方法洗涤，共洗涤4次，向最后洗涤的包含体沉淀中加入结合缓冲溶液配制的 浓度为8mol/L的尿素，用磁力搅拌器搅拌，冷冻离心8000rpm，30min，保留上清；将尿素溶 解包含体的上清上结合缓冲溶液配制的8mol/L尿素平衡的M敖合树脂柱，先用10倍柱床 体积的结合缓冲溶液配制的8mol/L尿素冲洗层析柱，再用2倍柱床体积的洗涤缓冲溶液 配制的8mol/L尿素洗涤层析柱，最后用洗脱缓冲溶液配制的8mol/L尿素洗脱目的蛋白， 收集流出液，流出液于4°C对蒸馏水透析过夜后，冷冻干燥；其中，结合缓冲溶液是20mmol/ L Tris. HCl, pH8. 0,0. 5mol/L NaCl，5mmol/L 咪唑；洗涤缓冲溶液是 20mmol/L Tris. HCl，pH8. 0,0. 5mol/LNaCl, 1 OOmmo 1/L 咪唑；洗脱缓冲溶液是 20mmol/L Tris. HCl，pH8. 0， 0. 5mol/L NaCl,300mmol/L咪唑；所述LB液体培养基含氨苄青霉素浓度0. lg/L。
5.根据权利要求1所述一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在 于从减蛋综合症病毒基因组中克隆纤维蛋白C-末端的编码基因具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在 于重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原是纤维蛋白C-末端，具有序列表中序列2所示的氨基 酸序列。
7.根据权利要求1所述一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在 于利用该方法制备的重组蛋白与感染了减蛋综合症病毒的鸡血清具有明显的免疫反应。
全文摘要
本发明涉及一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法。首先利用PCR技术从减蛋综合症病毒基因组中克隆纤维蛋白C-末端的编码基因并进行序列分析；然后将该基因克隆到表达载体pET-15b，转化大肠杆菌后构建工程菌，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导工程菌表达纤维蛋白C-末端；最后裂解工程菌细胞，离心分离其中的包含体，尿素溶解后，再用镍离子敖和树脂亲和纯化重组蛋白，稀释复性，利用Western blotting技术检测重组蛋白的免疫原性。利用该方法制备的重组蛋白与感染了减蛋综合症病毒鸡的血清有明显的免疫反应，可应用于预防家禽减蛋综合症的基因工程疫苗。
文档编号C07K1/22GK101955950SQ20101025782
公开日2011年1月26日 申请日期2010年8月12日 优先权日2010年8月12日
发明者周立桥, 孙志豪, 李荣贵, 李莹, 李金华 申请人:青岛大学;周立桥;李金华